İntraserebral Transplantasyon ve Fare Beynindeki İnsan Nöral Progenitör Hücrelerinin İnVivo Biyolüminesans İzlenmesi

Fare beyninde lusiferaz-yeşil floresan proteini (GFP) eksprese eden ikili muhabir bir vektör ile transdüke edilen insan nöral progenitör hücrelerinin intraparankimal transplantasyonunu tanımladık. Transplantasyondan sonra, lusiferaz sinyali, floresan mikroskobu kullanılarak beyin bölümlerinde tanımlanan in vivo biyolüminesans ve GFP eksprese eden aşılanmış hücreler kullanılarak tekrar tekrar ölçülür.

Hücre bazlı terapi, beyin yenilenmesi için büyük bir potansiyele sahiptir. Burada gösterdiğimiz protokol, fare beyninde nakledilen hücrelerin uzunlamasına in vivo görüntülenmesine izin verdiği için değerlidir. Bu protokol, aynı hayvandaki greftin bir süre boyunca göçü ve hayatta kalması hakkında fikir edinmek için özellikle yararlıdır.

Bu prosedür, fare beynine nakledilen herhangi bir lusiferaz eksprese eden hücre hattına uygulanabilir. Bununla birlikte, sinyal gücü, transplantasyonun derinliğine veya ilgili hücre hattındaki lusiferaz ekspresyonuna bağlı olarak değişebilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımızda mükemmel bir doktora öğrencisi olan Rebecca Weber olacaktır.

Eksi 150 santigrat derece depolamadan bir şişe hücre toplayarak başlayın ve laboratuvara aktarın. Şişeyi, buz kristalleri çözülene kadar iki ila üç dakika boyunca 37 santigrat derecede temperlenmiş bir su banyosuna hızlı bir şekilde aktarın. Ardından, şişeyi biyogüvenlik kabinine aktarın ve tüm içeriği steril 15 mililitrelik konik bir tüpe pipetleyin.

Dokuz mililitre steril PBS ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 G'de santrifüj yapın. Peleti rahatsız etmeden süpernatantı aspirasyonla çıkarın ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak son spinden önce hücreleri sayın. Hayvanı indüksiyon odasından stereotaksik çerçeveye taşıyın, yüz maskesi kullanarak anesteziyi koruyun.

Gözlerin kurumasını önlemek için oftalmik yağlayıcı uygulayın. Fare kafa derisini elektrikli tıraş bıçağı ile tıraş edin ve pamuklu çubuklar kullanarak cildi% 5 betadin çözeltisi ile dezenfekte edin. Fare kafasını sabitleyin ve kulak çubuklarını dış meatusa yerleştirin.

Cerrahi bir diş matkabı ile kafatasından iki ila üç milimetre çapında bir delik açın. Hazırlanan hücreleri tüpte yeniden askıya alın ve iki mikrolitre hücre süspansiyonunu bir şırıngaya çekin. Şırıngayı hedef bölgenin üzerine yerleştirin ve iğneyi yavaşça dura yüzeyine hareket ettirin ve derinlik koordinatlarını hesaplayın.

Living Image yazılım simgesine çift tıklayın ve açılır listeden bir kullanıcı kimliği seçin. Ardından, görüntülenen Denetim Masası'nda Başlat'ı tıklatın. Living Image yazılımında, Denetim Masası'ndaki Işıldayan ve Fotoğraf kutularını işaretleyin ve Otomatik pozlama'yı seçin.

Bir görüş alanı seçin. Konu yüksekliğini girin ve konu yüksekliği odağını kullan seçeneğini belirleyin. Büyük Binning, F/Stop, bloke Uyarma Filtresi ve açık Emisyon Filtresi dahil olmak üzere filtreleme parametrelerini manuel olarak ayarlayın.

Lusiferini intraperitoneal olarak enjekte edin ve beş dakika sonra, hayvanları sürekli bir izofluran kaynağı ile uyuşturun. Geleneksel bir saç tıraş makinesi kullanarak baş bölgesindeki yatıştırılmış hayvanları tıraş edin. Hayvanı görüntüleme odasına yerleştirin ve Lusiferin enjeksiyonundan 15 dakika sonra Kontrol Panelindeki Edin'i tıklatarak görüntülemeye başlayın.

Fare beynindeki nöral progenitör hücreleri nakletmeden önce, hücreler in vitro EGFP ekspresyonu ile başarılı transdüksiyon için test edildi. Başarılı transplantasyon, kırmızı Firefly lusiferaz sinyalinin varlığı ile doğrulandı. Farenin sağ duyusal motor korteksindeki 6.000 ila 180.000 hücrenin transplantasyonundan sonra, biyolüminesans sinyali tüm konsantrasyonlarda tespit edilebildi.

Hücreler transplantasyondan sonra en az beş hafta hayatta kaldı. Nakledilen hücreler, EGFP muhabiri aracılığıyla yapılan sonraki histolojik analizlerde ve anti-insan çekirdekleriyle immün boyama ile ex vivo olarak başarıyla tespit edildi. Hedef bölgeyi kaçırmamak için enjeksiyon koordinatlarını dikkatlice hesaplamak çok önemlidir.

Ayrıca, herhangi bir reflüyü önlemek için şırıngayı transplantasyondan sonra en az beş dakika yerinde bırakın. İn vivo biyolüminesan görüntülemeden sonra, beyin dokusu histolojik analiz için hazırlanabilir veya nakledilen hücreler FACS kullanılarak izole edilebilir ve farklı veya karışık teknolojilerle karakterize edilebilir. Genel olarak, bu teknik beyindeki nakledilen hücrelerin nicel ve sürekli olarak izlenmesini sağlar ve inme ve travmatik beyin hasarı da dahil olmak üzere çok sayıda nörolojik hastalığa uygulanabilir.