Sürekli akışlı, permeabilizasyon algılamalı mikro-elektroporasyon sisteminin imalatı ve işletilmesi
7 Ocak 2022
Bu protokol, çip üzerinde laboratuvar, mikroakışkan elektroporasyon cihazı oluşturmak için gereken mikrofabrikasyon tekniklerini açıklar. Deney düzeneği, sürekli bir akışta kontrollü, tek hücre düzeyinde transfeksiyonlar gerçekleştirir ve popülasyon tabanlı kontrol ile daha yüksek verimlere genişletilebilir. Hücre zarı geçirgenliğinin derecesini gerçek zamanlı olarak elektriksel olarak izleme yeteneğini gösteren bir analiz sağlanmıştır.
Bu yöntem, araştırmacıların istenen hücre tipi için optimal elektroporasyon titreşim koşullarını belirlemelerini sağlarken, geleneksel ampirik deneysel yaklaşıma olan ihtiyacı en aza indirir. Bu yöntem, elektroporasyon işlemi boyunca hücre zarı geçirgenliğinin derecesini elektriksel olarak izleyebilen ölçeklenebilir bir mikroakışkan çalıştırma cihazı üretmek için mikro-elektroporasyon tekniklerini kullanır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Kishankumar Busha olacak.
Başlamak için, silikon gofreti, spin kaplayıcının vakum sistemini kullanarak gofret spin kaplayıcının mancasına sabitleyin. Ardından iplikçiyi programlayın. Daha sonra, silikon gofretin merkezine dört mililitre SU-8 2010 fotoğraf direnci dağıtın ve programı çalıştırın.
Sistem durduğunda, vakumu kapatın. Ardından, 2D mikroakışkan kanal tasarımlarıyla fotoğraf maskesini maske tutucuya sabitleyin ve SU-8 kaplamalı silikon gofreti gofret mandren üzerine yerleştirin. Santimetre kare başına 150 milijul pozlama ayarlarını yapın ve makineyi çalıştırın.
UV ışınlarına maruz kaldıktan sonra, silikon gofreti SU-8 geliştirici çözümüne üç ila dört dakika boyunca nazik bir ajitasyonla batırın. Daha sonra gofreti çözeltiden çıkarın ve yüzeyi izopropanol ile durulayın. Daha sonra, silikon gofreti sert bir pişirme için 30 dakika boyunca 150 santigrat derece fırına yerleştirin.
Ardından, kanal yan duvarlarının tam yüksekliğini ve eğimini ölçmek için kalem profilometrisini kullanmadan önce oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Ardından, cam slaytın yüzeyine bir mililitre fotoğraf direnci dağıtın ve programı bir kez daha çalıştırın. Sistem durduğunda, vakumu kapatın ve cam slaytı çıkarın.
Fotoğraf maskesini 2D elektrot tasarımlarıyla maske tutucusuna sabitledikten sonra, cam gofreti S-1818 kaplama ile gofret mandren üzerine yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve hizalayın. Santimetre kare başına 215 milijul pozlama ayarlarını yapın ve makineyi çalıştırın. Pozlamadan sonra, cam slaytı MF-319 geliştirici çözümüne iki dakika batırarak nazik ajitasyon uygulayın.
Ardından cam gofreti çıkarın ve yüzeyini deiyonize suyla durulayın. Son olarak, cam sürgüyü sert bir pişirme için 150 santigrat derece fırına yerleştirin ve ilgilenilen substrat yüzeyinin yukarı bakmasını sağlayın. 30 dakika sonra, sürgüyü fırından çıkarın ve ışıktan koruyun.
Cam sürgüyü kazımak için, bir politetrafloroetilen kapta bir dakika boyunca 10 ila 1 tamponlu hidroflorik asit çözeltisine batırın. Daha sonra cam slaytları deiyonize suda üç kez aktarın ve yıkayın. Daha sonra, fiziksel bir buhar biriktirme sistemi kullanarak, dakikada 100 angstrom hızında sekiz dakika boyunca titanyum ve dakikada 200 angstromda 10 dakika boyunca platin püskürtün.
Daha sonra fotoğraf direncini kaldırmak için, metal kaplı cam slaytları 10 dakika boyunca bir aseton banyosuna batırın ve ajitasyon sağlamak için banyoyu sonikleştirin. Gerekirse, kalıntıları gidermek için asetonla ıslatılmış bir mendil kullanın. Polidimetilsiloksan replika kalıplama için daha sonra, PDMS elastomer tabanını, elektronik terazinin üzerine yerleştirilmiş tek kullanımlık bir kapta 10 ila 1 ağırlık oranında bir sertleştirici ile yapar.
Ardından, PDMS çözeltisini silikon gofret üzerine dökün ve hava kabarcıklarını gidermek için karışımı bir vakum altına yerleştirin. Karışımı en az dört saat boyunca 65 santigrat derecede kürledikten sonra, kalıplanmış PDMS'yi kesmek ve silikon gofretten soymak için bir tıraş bıçağının ucunu kullanın. Daha sonra keskinleştirilmiş bir biyopsi punch kullanarak, PDMS'yi cihazın giriş ve çıkışlarından çıkarın.
Ardından, PDMS bağlama için plazma jeneratörünü programlayın. Ardından PDMS ve elektrot camı slaytını, özellikleri yukarı bakacak şekilde sisteme yerleştirin ve programı çalıştırın. Program tamamlandıktan sonra, cihazları çıkarın ve kanal özelliklerini elektrotlara hızlı bir şekilde hizalamak için bir stereoskop kullanın.
Yapıştırma arayüzündeki istenmeyen hava kabarcıklarını gidermek için PDMS'nin merkezinden yanlara doğru basıncı sıkıca uygulayın. HEK293 hücrelerini toplayın, santrifüj edin ve peleti elektroporasyon tamponunda mililitre başına yaklaşık beş milyon hücrede yeniden askıya alın. Daha sonra, GFP için plazma DNA kodlamasını mililitre başına 20 mikrogramlık son bir konsantrasyona ekleyin ve yavaşça karıştırın.
Daha sonra plazma-DNA hücresi süspansiyonunu deney için bir santimetreküp şırıngaya aktarın. Mikrocihazı bir slayt tutucu aracılığıyla mikroskop sahnesine yerleştirin. Ardından şarjlı bağlı cihazı, CCD kamerayı açın ve mikroakışkan kanalı netlemeye getirin.
Tek hücreli elektroporasyon için, tek hücrelerin elektrot setinden akışını sağlamak için şırınga pompası akış hızını dakikada 0,1 ila 0,3 mikrolitreye ayarlayın. Ardından, ilk ve en düşük elektrik enerjisi elektroporasyon darbesi için darbe parametrelerini ayarlayın. Darbe uygulaması başına önceden belirlenmiş sayıda hücre algılamasını izleyin.
Test edilen her durumun sonunda, hücreleri mikrocihaz çıkışından aspire edin ve çıkışı geri kazanım medyasıyla doldurun. Bir sonraki elektroporasyon darbe koşuluna tekrarlayın ve tüm elektroporasyon darbe koşulları test edilene kadar tekrarlayın. Ardından, yüksek verimli popülasyon tabanlı geri bildirim için elektroporasyon darbe parametrelerini belirleyin.
Popülasyon tabanlı geri besleme kontrollü elektroporasyon için, şırınga pompası akış hızını dakikada bir ila üç mikrolitreye ayarlayın ve nabız genliğini optimize edilmiş duruma ayarlayın. Ardından tetikleme modunu kapatın ve darbe genişliğini hücre geçiş süresiyle eşleşecek şekilde ayarlayın. İstenilen sayıda hücre elektroporasyondan sonra hem şırınga pompasını hem de fonksiyon jeneratörünü kapatın.
Daha sonra hücreleri çıkış rezervuarından uygun boyutta bir hücre kültürü şişesine veya önceden ısıtılmış geri kazanım ortamıyla doldurulmuş bir plakaya aktarın ve kültür şişesini veya plakasını bir inkübatöre aktarın. Veri analizi için, verileri bir analiz yazılımına yükleyin ve her darbeli koşul için akıma karşı zamanın bir grafiğini oluşturun. Daha sonra hücre zarı geçirgenliğinin derecesini belirleyin, test edilen tüm darbe koşullarında hücre zarı geçirgenlik haritasını oluşturun ve optimum darbe durumunu doğrulayın.
Kuluçkadan sonra, FITC ve uzak kırmızı filtreleri kullanarak epi-floresan görüntüleri yakalayın ve görüntü kümelerini manuel olarak veya bir algoritma aracılığıyla analiz edin. Tek bir darbe genliği için tek hücre seviyesi geçirgenlik algılamasının arkasındaki çalışma prensipleri burada vurgulanmaktadır. Her elektroporasyon darbe parametresinden sonra, bir sonraki en yüksek enerjili elektroporasyon darbesi test edilir.
HEK293 hücreleri için hücre zarı geçirgenlik haritası, uygulanan elektrik enerjisi ile hücre zarı geçirgenliğinin derecesi arasında belirgin bir korelasyon göstermiştir. Bu deneyde, santimetre başına 1.8 kilovoltluk bir elektrik alan kuvveti ve 670 mikrosaniyelik bir darbe optimal olarak belirlenmiştir. Bu değerlerde %70 elektro-transfeksiyon etkinliği elde edilmiştir.
Santimetre başına 0,4 kilovoltluk bir elektrik alan mukavemeti ve üç milisaniyelik bir darbe süresinin aksine, 24 saatte elektro-transfeksiyon verimliliği% 5'ten azdıMikro üretim sürecinin özgüllüğünü tanımlarken sıklıkla kullanılan tarif terimi, işleyen bir cihazı başarılı bir şekilde üretmek için her adımı takip etmenin veya optimize etmenin önemini ekler. Bu elektroporasyon teknolojisi, CAR T hücrelerinin üretimi ve test edilmesi veya CRISPR-Cas9 gen düzenleme tekniklerinin optimizasyonu ve test edilmesi gibi ek biyomedikal araştırma projelerinde kullanılabilir. Bu mikro-elektroporasyon teknolojisi, elektriksel darbe koşullarını uygulamak ve bu bilgiyi klinik olarak ilgili moleküler kargonun teslimi ile ilişkilendirmek için farklı hücre tiplerinin tepkilerinin elektriksel olarak sorgulanmasına izin verir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, kontrollü, tek hücreli transfeksiyonlar sağlayan bir mikroakışkan elektroporasyon cihazı oluşturmak için kullanılan mikrofabrikasyon tekniklerini açıklar. Elektroporasyon süreci boyunca hücre zar geçirgenliğinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikroakışkanlar
- Elektroporasyon
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Elektroporasyon, hücrelere madde sokmak için kullanılan bir tekniktir.
- Mikroakışkan cihazlar, akışkan akışının ve hücre manipülasyonunun kesin kontrolünü sağlar.
- Hücre zar durumunun gerçek zamanlı olarak izlenmesi deneysel doğruluğu artırır.
- Bu yöntem, geleneksel ampirik yaklaşımlara olan bağımlılığı azaltır.
Çalışmanın Amacı
- Elektroporasyon için ölçeklenebilir bir mikroakışkan cihazı geliştirmek.
- Çeşitli hücre tipleri için darbe koşullarını optimize etmek.
- Gerçek zamanlı olarak hücre zar geçirgenliğini izlemek.
Kullanılan Yöntemler
- Cihaz üretimi için mikro-elektroporasyon teknikleri.
- Üretim sürecinde silikon yonga ve SU-8 fotorezistin kullanılması.
- Elektroporasyon için kontrollü darbe koşulları.
- Hücre zar durumunun gerçek zamanlı elektriksel izlenmesi.
Ana Sonuçlar
- Cihaz tek hücreli elektroporasyonu başarıyla gerçekleştirir.
- Gerçek zamanlı izleme, zar geçirgenliği hakkında bilgiler sağlar.
- Optimize edilmiş koşullar, daha iyi transfeksiyon verimliliğine yol açar.
- Bu yöntem, daha yüksek verimlilikteki uygulamalar için ölçeklenebilir.
Sonuçlar
- Mikroakışkan elektroporasyon cihazı, kontrollü transfeksiyonlar için etkilidir.
- Gerçek zamanlı izleme, elektroporasyon dinamiklerinin anlaşılmasını artırır.
- Bu yaklaşım, araştırmada hücre transfeksiyonu sürecini hızlandırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This micro-electroporation system addresses the high manufacturing costs and lengthy protocol development associated with viral-mediated gene delivery in cell therapy development. By enabling real-time monitoring of cell membrane permeabilization and optimizing pulsing conditions through population-based feedback control, the technology reduces empirical experimentation and supports scalable transfection workflows. This positions the method as a predictive, cost-effective alternative for early-stage target validation and lead identification in biologics development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating electrical pulsing conditions with molecular delivery efficiency.
- Operational Value: Reduces reliance on trial-and-error protocol optimization for difficult-to-transfect primary cells.
- Predictive Value: Supports data-driven go/no-go decisions by establishing permeability-transfection relationships early in discovery.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantitative permeability maps that enable consistent compound or cargo evaluation across conditions.
- Scalability: Population-based feedback control increases throughput from single-cell to higher-rate processing while maintaining real-time monitoring.
- Reproducibility: Fabrication via established microfabrication techniques ensures device consistency across batches for assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-scale optimization to preclinical validation by providing transferable pulsing parameters for difficult cell types.
- Mechanistic De-risking: Correlates electrical inputs with functional outputs (e.g., GFP expression) to reduce ambiguity in gene delivery mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables prioritization of cell types or constructs based on empirically derived transfection efficiency thresholds.
Pipeline & Workflow Integration
The system integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, where optimized electroporation conditions support reliable delivery of genetic constructs for functional screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling precise, measurable delivery of siRNA, DNA, or CRISPR components into target cells.
- Screening: Delivers assay-ready cells with standardized permeabilization states for consistent response measurement to therapeutic candidates.
- Analytics: Generates real-time current versus time readouts and post-transfection fluorescence data to quantify delivery efficiency under varying conditions.
- Translational Research: Provides optimized pulsing conditions that can be transferred to preclinical models for continued validation of gene-editing or cell-therapy constructs.
- Enterprise Reuse: Fabricated using scalable microfluidic and photolithography techniques, the device serves as a reusable platform across multiple projects and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in transgene delivery by linking electrical parameters to functional outcomes.
- Operational Value: Standardizes electroporation through feedback-controlled pulsing, reducing variability and operator-dependent optimization.
- Strategic Value: Lowers development costs and timelines by minimizing empirical screening and enabling rapid condition optimization.
- Portfolio Impact: Improves risk-adjusted prioritization of gene delivery constructs based on quantifiable transfection efficiency data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfabrication, microfluidics, and electrical pulse control for device setup and operation.
- Depends on access to photolithography equipment, sputter coaters, and cleanroom-compatible processes for electrode and channel fabrication.
- Necessitates standardization of cell preparation, suspension concentration, and recovery protocols across users and labs.
- Adaptation to different cell types requires re-running the permeability mapping and feedback optimization steps.
- Practical limitations include the need for fluorescent cargo (e.g., GFP) for efficiency validation and constraints on maximum throughput due to cell transit time and detection speed.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Device Fabrication‐Photolithography
3:12
Device Fabrication
5:21
Cell Preparation, Experimental Setup, Operation, and Analysis
8:24
Results: Cell Membrane Permeabilization and Electro‐Transfection Efficiency Using the Continuous Flow, Micro‐Electroporation System
9:36
Conclusion
