Name: Sürekli akışlı, permeabilizasyon algılamalı mikro-elektroporasyon sisteminin imalatı ve işletilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Öğrenin, mikro-elektroporasyon teknikleriyle ölçeklenebilir mikroakışkanlı cihaz üretimini ve gerçek zamanlı hücre membranı geçirgenliği izlemeyi. Bu yöntem, optimal elektroporasyon darbe koşullarını belirlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, Ulusal Bilim Vakfı (NSF CBET 0967598, DBI IDBR 1353918) ve ABD Eğitim Bakanlığı'nın Gelişmekte Olan Hassas ve Kişiselleştirilmiş Tıp Alanlarında Lisansüstü Eğitim (P200A150131) tarafından lisansüstü öğrenci J.J.S.'nin burs olarak finanse edilmesi için finansal desteğe teşekkür etmek istemektedir.

<ol><li>Gao, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+CRISPR%2FCas9+gene+editing+in+engineered+T-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of CRISPR/Cas9 gene editing in engineered T-cell therapy.</a> Cancer Medicine. 8 (9), 4254-4264 (2019).</li>
<li>Aijaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomanufacturing+for+clinically+advanced+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Biomanufacturing for clinically advanced cell therapies.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 362-376 (2018).</li>
<li>Milone, M. C., O'Doherty, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+use+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Clinical use of lentiviral vectors.</a> Leukemia. 32 (7), 1529-1541 (2018).</li>
<li>Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+electroporation%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry+and+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Theory of electroporation: A review.</a> Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41 (2), 135-160 (1996).</li>
<li>Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+electroporation+and+electropermeabilization%3A+mechanisms+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Membrane electroporation and electropermeabilization: mechanisms and models.</a> Annual Review of Biophysics. 48, 63-91 (2019).</li>
<li>Rosazza, C., Meglic, S. H., Zumbusch, A., Rols, M. P., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+electrotransfer%3A+A+mechanistic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene electrotransfer: A mechanistic perspective.</a> Current Gene Therapy. 16 (2), 98-129 (2016).</li>
<li>Clauss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+non-viral+T-cell+engineering+by+sleeping+beauty+minicircles+diminishing+DNA+toxicity+and+miRNAs+silencing+the+endogenous+T-cell+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient non-viral T-cell engineering by sleeping beauty minicircles diminishing DNA toxicity and miRNAs silencing the endogenous T-cell receptors.</a> Human Gene Therapy. 29 (5), 569-584 (2018).</li>
<li>Sherba, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+electroporation+buffer+composition+on+cell+viability+and+electro-transfection+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The effects of electroporation buffer composition on cell viability and electro-transfection efficiency.</a> Scientific Reports. 10 (1), 3053(2020).</li>
<li>Lu, H., Schmidt, M. A., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+electroporation+device+for+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic electroporation device for cell lysis.</a> Lab on a Chip. 5 (1), 23-29 (2005).</li>
<li>Kar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation%3A+current+trends%2C+applications+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation: current trends, applications and future prospects.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 28 (12), (2018).</li>
<li>Shi, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+electroporation-based+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">A review on electroporation-based intracellular delivery.</a> Molecules. 23 (11), (2018).</li>
<li>Wang, S. N., Zhang, X. L., Wang, W. X., Lee, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semicontinuous+flow+electroporation+chip+for+high-throughput+transfection+on+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Semicontinuous flow electroporation chip for high-throughput transfection on mammalian cells.</a> Analytical Chemistry. 81 (11), 4414-4421 (2009).</li>
<li>Wei, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+implantable+microelectrode+array+for+simultaneous+L-glutamate+and+electrophysiological+recordings+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystems+%26+Nanoengineering%22%5BJournal%5D)">An implantable microelectrode array for simultaneous L-glutamate and electrophysiological recordings in vivo.</a> Microsystems & Nanoengineering. 1, (2015).</li>
<li>Maschietto, M., Dal Maschio, M., Girardi, S., Vassanelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electroporation+of+mammalian+cells+through+SiO2+thin+film+capacitive+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In situ electroporation of mammalian cells through SiO2 thin film capacitive microelectrodes.</a> Scientific Reports. 11 (1), (2021).</li>
<li>Wu, Q. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-on-a-chip%3A+recent+breakthroughs+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Organ-on-a-chip: recent breakthroughs and future prospects.</a> Biomedical Engineering Online. 19 (1), (2020).</li>
<li>Pandey, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+Based+Point-of-Care+Diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Microfluidics Based Point-of-Care Diagnostics.</a> Biotechnology Journal. 13 (1), (2018).</li>
<li>Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+biosensor+technology+for+potential+applications+-+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in biosensor technology for potential applications - An overview.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, (2016).</li>
<li>Nuxoll, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioMEMS+in+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">BioMEMS in drug delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1611-1625 (2013).</li>
<li>Kang, S., Kim, K. H., Kim, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+electroporation+system+for+efficient+molecular+delivery+into+Chlamydomonas+reinhardtii+with+a+3-dimensional+microelectrode%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel electroporation system for efficient molecular delivery into Chlamydomonas reinhardtii with a 3-dimensional microelectrode.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li>
<li>Zheng, M. D., Shan, J. W., Lin, H., Shreiber, D. I., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamically+controlled+cell+rotation+in+an+electroporation+microchip+to+circumferentially+deliver+molecules+into+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamically controlled cell rotation in an electroporation microchip to circumferentially deliver molecules into single cells.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 20 (1), (2016).</li>
<li>Santra, T. S., Kar, S., Chang, H. Y., Tseng, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-localized+single-cell+nano-electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Nano-localized single-cell nano-electroporation.</a> Lab on a Chip. 20 (22), 4194-4204 (2020).</li>
<li>Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+electroporation%3A+challenges+and+perspectives+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications.</a> Integrative Biology. 1 (3), 242-251 (2009).</li>
<li>Santra, T. S., Chang, H. Y., Wang, P. C., Tseng, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+pulse+duration+on+localized+single-cell+nano-electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Impact of pulse duration on localized single-cell nano-electroporation.</a> Analyst. 139 (23), 6249-6258 (2014).</li>
<li>Geng, T., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+electroporation+for+cellular+analysis+and+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery.</a> Lab on a Chip. 13 (19), 3803-3821 (2013).</li>
<li>Hsi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustophoretic+rapid+media+exchange+and+continuous-flow+electrotransfection+of+primary+human+T+cells+for+applications+in+automated+cellular+therapy+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Acoustophoretic rapid media exchange and continuous-flow electrotransfection of primary human T cells for applications in automated cellular therapy manufacturing.</a> Lab on a Chip. 19 (18), 2978-2992 (2019).</li>
<li>Khine, M., Ionescu-Zanetti, C., Blatz, A., Wang, L. P., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+arrays+with+real-time+monitoring+and+feedback+control%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation arrays with real-time monitoring and feedback control.</a> Lab on a Chip. 7 (4), 457-462 (2007).</li>
<li>Ye, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+and+real-time+electrical+monitoring+on+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%222020+33rd+Ieee+International+Conference+on+Micro+Electro+Mechanical+Systems+%28Mems+2020%29%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation and real-time electrical monitoring on a microfluidic chip.</a> 2020 33rd Ieee International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (Mems 2020). , 1040-1043 (2020).</li>
<li>Huang, Y., Rubinsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+electroporation+chip+for+single+cell+membrane+permeabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+a-Physical%22%5BJournal%5D)">Microfabricated electroporation chip for single cell membrane permeabilization.</a> Sensors and Actuators a-Physical. 89 (3), 242-249 (2001).</li>
<li>Guo, X. L., Zhu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controllable+in-situ+cell+electroporation+with+cell+positioning+and+impedance+monitoring+using+micro+electrode+array%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Controllable in-situ cell electroporation with cell positioning and impedance monitoring using micro electrode array.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Punjiya, M., Nejad, H. R., Mathews, J., Levin, M., Sonkusale, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+through+device+for+simultaneous+dielectrophoretic+cell+trapping+and+AC+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A flow through device for simultaneous dielectrophoretic cell trapping and AC electroporation.</a> Scientific Reports. 9, (2019).</li>
<li>Wang, H. Y., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+electroporation+for+delivery+of+small+molecules+and+genes+into+cells+using+a+common+DC+power+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Microfluidic electroporation for delivery of small molecules and genes into cells using a common DC power supply.</a> Biotechnology and Bioengineering. 100 (3), 579-586 (2008).</li>
<li>Zheng, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous-flow%2C+electrically-triggered%2C+single+cell-level+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">Continuous-flow, electrically-triggered, single cell-level electroporation.</a> Technology. 5 (1), 31-41 (2017).</li>
<li>Batista Napotnik, T., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+electroporation+detection+methods+-+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">In vitro electroporation detection methods - An overview.</a> Bioelectrochemistry. 120, 166-182 (2018).</li>
<li>MICROPOSIT™ S1800® G2 Series Photoresists. KAYAKU. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/S1800-G2.pdf">https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/S1800-G2.pdf</a> (2021).</li>
<li>SU-8 2000 Permanent Negative Epoxy Photoresist. KAYAKU. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/08/KAM-SU-8-2000-2000.5-2015-Datasheet-8.13.20-final.pdf">https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/08/KAM-SU-8-2000-2000.5-2015-Datasheet-8.13.20-final.pdf</a> (2001).</li>
<li>Substrate Preparation. MicroChemicals. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.microchemicals.com/technical_information/subtrate_cleaning_adhesion_photoresist.pdf">https://www.microchemicals.com/technical_information/subtrate_cleaning_adhesion_photoresist.pdf</a> (2021).</li>
<li>Lisinenkova, M., Hahn, L., Schulz, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLisinenkova%2C+M+%224M+2006+-+Second+International+Conference+on+Multi-Material+Micro+Manufacture%22">4M 2006 - Second International Conference on Multi-Material Micro Manufacture</a>. , Elsevier. 91-94 (2006).</li>
<li>Beh, C. W., Zhou, W. Z., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS-glass+bonding+using+grafted+polymeric+adhesive+-+alternative+process+flow+for+compatibility+with+patterned+biological+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS-glass bonding using grafted polymeric adhesive - alternative process flow for compatibility with patterned biological molecules.</a> Lab on a Chip. 12 (20), 4120-4127 (2012).</li>
<li>PA90 High Voltage Power Operational Amplifiers. APEX. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.apexanalog.com/resources/products/pa90u.pdf">https://www.apexanalog.com/resources/products/pa90u.pdf</a> (2021).</li>
<li>Lissandrello, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+continuous-flow+microfluidic+electroporation+of+mRNA+into+primary+human+T+cells+for+applications+in+cellular+therapy+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput continuous-flow microfluidic electroporation of mRNA into primary human T cells for applications in cellular therapy manufacturing.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18045(2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Bu protokolde sunulan metodoloji öncelikle mikroakışkan bir cihazın mikrofabrikasyonuna odaklanır ve daha sonra özel bir elektroporasyon deney düzeneğine entegre edilir. Mikrofabrikasyon sürecinin özelliklerini tanımlarken sıklıkla kullanılan 'tarif' terimi, işleyen bir cihazı başarılı bir şekilde üretmek için her adımı takip etmenin / optimize etmenin önemine işaret eder. Bununla birlikte, UV maruz kalma süresi/enerjisi, PVD püskürtme hızları/süreleri ve oksijen plazma jeneratörü ayarları gibi optimize edilmediğinde, sü...

CAR-T (Kimerik Antijen Reseptör Engineered T hücresi) hücre tedavisi ve CRISPR (kümelenmiş düzenli aralıklarla kısa palindromik tekrarlayan DNA dizileri) / Cas9 kullanılarak genetik düzenleme gibi biyomedikal araştırmalardaki mevcut terapötik yenilikler, eksojen materyali hücre içi boşluğa hem başarılı hem de verimli bir şekilde iletme yeteneğine büyük ölçüde güvenmektedir1. CAR-T tedavisinde, hücre tedavisi üretiminde gen verme adımını gerçekleştirmek için altın standart viral vektörlerkullanmaktır 2. Viral aracılı gen iletimi etkili bir dağıtım yöntemi olmasına rağmen, bazı dezavantajları da vardır. Bunlar arasında üretim maliyetleri, sitotoksisite, immünojenisite, mutagenez/tümörigenez potansiyeli ve verilecek gen(ler) üzerindeki boyut sınırlamalarıyer alır 3. Bu sınırlamalar, alternatif, viral olmayan dağıtım teknolojilerinin araştırılmasına ve geliştirilmesine yol açmıştır.
Viral aracılı gen dağıtımına bir alternatif olan elektroporasyon, hücrelerin DNA, RNA ve protein transfeksiyonlarını gerçekleştirmek için optimal bir elektriksel darbe dalga formunun uygulanmasına dayanır. Harici bir elektrik alanının uygulanmasını takiben, hücre zarı kısa bir süre tehlikeye girer ve hücreyi, aksi takdirde geçirimsiz eksojen materyallerin hücre içi iletimine duyarlı hale getirir4. Viral aracılı teslimatla karşılaştırıldığında, elektroporasyon genellikle güvenli, kullanımı kolay ve düşük işletme maliyetlerine sahip olduğu için avantajlıdır. Elektroporasyon hem küçük hem de büyük moleküler kargo sağlayabilir ve soy5'ten bağımsız olarak hücrelerin transfeksiyonunda etkili olabilir. Elektroporasyondan sonra arzu edilen sonuçları, yani iyi yaşayabilirliği ve iyi elektro-transfeksiyon verimliliğini elde etmek için, çeşitli deneysel parametrelerin birlikte optimize edilmesi gerekir. Bunlar arasında hücre tipi6, hücre yoğunluğu, molekül konsantrasyonu7, elektroporasyon tampon özellikleri (örneğin, moleküler bileşim, iletkenlik ve ozmolarite)8, elektrot boyutu/geometrisi9 ve elektriksel darbe dalga formu (şekil, polarite, darbe sayısı)10 (bir örnek için Şekil 1'e bakınız) bulunur. Bu parametrelerin her birinin elektroporasyon deneylerinin sonuçları üzerinde önemli bir etkisi olmasına rağmen, darbe dalga formu özellikle ayrıntılı olarak incelenmiştir, çünkü uygulanan darbe (ler) in elektrik enerjisi, ortaya çıkan hücre canlılığı ile elektro-transfeksiyon verimliliği arasındaki içsel dengenin köküdür8.
Tipik olarak, elektroporasyon deneyleri, hücrelerin bir elektroporasyon küveti içindeki bir dizi büyük, paralel plakalı elektrot arasında 100'lerce mikrolitre tamponda askıya alındığı makro ölçekte gerçekleştirilir. Elektrotlar genellikle 1-4 mm'lik bir elektrot mesafesine sahip alüminyumdan üretilir. Hücreler pipet aracılığıyla manuel olarak yüklendikten sonra, küvet, kullanıcının hücre süspansiyonunu elektroporat etmek için darbe dalga formu parametrelerini ayarlayabileceği ve uygulayabileceği hacimli, elektrikli bir darbe jeneratörüne elektriksel olarak bağlanır. Makro ölçekli veya toplu elektroporasyon, hücre yoğunluklarını &gt;106 hücre / mL'yi işleyebilse de, bu özellik elektriksel darbe dalga formu ayarlarını optimize ederken israf edici olabilir. Bu, özellikle hücre popülasyon sayılarının sınırlı olabileceği birincil hücre tiplerini elektroporize ederken endişe vericidir. Ek olarak, elektrotlar arasındaki büyük mesafe nedeniyle, darbe jeneratörü elektrik alan mukavemetlerini &gt;1kV / cm11) elde etmek için büyük voltajlar sağlayabilmelidir. Bu yüksek voltajlar, elektrolit tamponu boyunca dirençli güç dağılımına neden olur ve Joule'un ısınmasına neden olur ve bu da ortaya çıkan hücre canlılığına zarar verebilir12. Son olarak, yoğun bir hücre süspansiyonu üzerinde elektroporasyon yapmak, ortaya çıkan elektro-transfeksiyon verimliliğinde ve hücre canlılığında doğuştan gelen bir değişkenlik ile sürekli olarak yüklenecektir. Süspansiyondaki her hücre, çevreleyen hücreler nedeniyle farklı bir elektrik alan kuvveti yaşayabilir. Deneyimli elektrik alan kuvvetinin artmasına veya azalmasına bağlı olarak, ortaya çıkan hücre canlılığı veya elektro-transfeksiyon verimliliğinin her biri olumsuz etkilenebilir11. Makro ölçekli elektroporasyonun bu dezavantajları, mikro ölçekte çalışan ve tek hücre düzeyinde daha iyi kontrol sağlayan alternatif teknolojilerin izlenmesine ve geliştirilmesine yol açmıştır.
BioMEMS veya biyomedikal mikro-elektro-mekanik sistemler alanı, mikroelektronik endüstrisinde yapılan teknolojik gelişmelerden kaynaklanmaktadır. Özellikle, biyomedikal araştırmaların ilerlemesi için mikro cihazlar geliştirmek için mikrofabrikasyon süreçlerini kullanmak. Bu ilerlemeler arasında in vivo elektriksel izleme için mikro-elektrot dizilerinin geliştirilmesi13, in situ elektroporasyon için kapasitif mikro-elektrotlar 14, çip üzerinde minyatür organ cihazları 15, mikroakışkan bakım noktası teşhisi 16, biyosensörler 17 ve nano ve mikro-elektroporasyon cihazları dahil olmak üzere ilaç dağıtım sistemleri 18 19,20,21 bulunmaktadır. . Biyolojik hücrelerle aynı büyüklükte cihazlar tasarlama ve üretme kabiliyeti nedeniyle, nano ve mikro elektroporasyon teknolojileri, makro ölçekli muadilleri22,23 ile karşılaştırıldığında avantajlıdır. Bu elektroporasyon cihazları, yüksek voltajlı darbe uygulamalarının gerekliliğini ortadan kaldırır, çünkü 10'lar ila 100'lerce mikrometre aralığına sahip elektrot setleri tipik olarak entegre edilir. Bu özellik, elektrolit yoluyla akımı büyük ölçüde azaltır, bu da toksik elektroliz ürünlerinin birikimini ve bu sistemlerde Joule ısıtmasının etkilerini azaltır. Mikro ölçekli kanallar ayrıca, darbe uygulaması sırasında hücrelere çok daha düzgün bir elektrik alanının güvenilir bir şekilde uygulanmasını sağlar ve bu da daha tutarlı sonuçlar elde edilmesini sağlar24. Ek olarak, mikro-elektroporasyon cihazlarının, hücre terapisi üretiminde oldukça arzu edilen bir yetenek olan tam otomatik bir teknolojiye gelecekteki entegrasyon için kendisini ödünç veren mikroakışkan bir platforma entegre edilmesi de yaygındır25. Son olarak, mikro ölçekli elektroporasyon, elektroporasyon olaylarının elektriksel sorgulamasına izin verir. Örneğin, hücre zarı geçirgenliğinin derecesi, tek bir hücre seviyesinde gerçek zamanlı olarak izlenebilir26,27. Bu yöntemin amacı, elektroporasyon protokollerini optimize etmek için hücre zarı geçirgenliğinin derecesini ölçebilen, ancak önceki son teknolojiye göre verimi artıran bir mikroakışkan, tek hücreli mikro-elektroporasyon cihazının mikrofabrikasyonunu, sistem çalışmasını ve analizini tanımlamaktır.
Tek hücreli elektroporasyon yapmak artık yeni bir teknik değildir, çünkü ilk olarak Rubinsky ve ark. tarafından 2001 yılında statik hücre elektroporasyon teknolojisinin geliştirilmesi ile gösterilmiştir28. Mikro cihazları, elektroporasyon olayını elektriksel olarak izleme yeteneğini gösteren ilk kişi oldukları için yenilikçiydi. Bu, cihazların verimlerini artırmak için hücre zarı geçirgenliğinin derecesini paralel bir şekilde elektriksel olarak tespit edebilen statik, tek hücreli elektroporasyon teknolojilerinin geliştirilmesine yol açmıştır. Bununla birlikte, paralelleştirme ve toplu işleme ile bile, bu cihazlar birim zaman başına işleyebilecekleri toplam hücre sayısı 29,30'dan ciddi şekilde yoksundur. Bu sınırlama, çok daha yüksek verimlerde tek hücre düzeyinde mikro-elektroporasyon yapabilen akış cihazlarının geliştirilmesine yol açmıştır31. Statikten akış ortamına bu cihaz geçişi, elektroporasyon darbesinin uygulanmasını takiben hücre zarı geçirgenliğinin derecesini elektriksel olarak izleme yeteneğini sınırlar. Bu çalışmada açıklanan yöntem, bu iki teknoloji arasındaki boşluğu doldurur; bu, sürekli akışlı, seri bir şekilde, bireysel hücrelerin hücre zarı geçirgenlik derecesini elektriksel olarak tespit edebilen, darbeleyen ve izleyebilen bir mikro-elektroporasyon teknolojisidir.
Bu teknoloji yakın zamanda Zheng ve ark. Bu çalışmada, elektroporasyon darbesinin hem genliğinin hem de süresinin değiştiği parametrik bir çalışmanın tamamlanmasıyla bu teknolojinin yetenekleri tanıtıldı ve hücre zarı geçirgenliğinin göstergesi olan takip eden elektrik sinyali araştırıldı32. Sonuçlar, elektroporasyon darbesinin yoğunluğundaki bir artışın (yani, uygulanan elektrik alanındaki artış veya nabız süresindeki artış) ölçülen hücre zarı geçirgenliğinde bir artışa neden olduğunu göstermiştir. Sistemi daha da doğrulamak için, başarılı elektroporasyonun ortak bir floresan göstergesi olan propidium iyodür33, hücre süspansiyonuna eklendi ve elektrik darbesinin uygulanmasından hemen sonra bir floresan görüntüsü yakalandı. Optik sinyal, yani hücre içindeki propidyum iyodürün floresan yoğunluğu, hücre zarı geçirgenlik derecesinin elektriksel ölçümü ile güçlü bir şekilde ilişkiliydi ve bu elektriksel ölçümün güvenilirliğini doğruladı. Bununla birlikte, bu çalışma sadece çevrilebilir önemi çok az olan veya hiç olmayan küçük moleküllü propidium iyodürün verilmesini dikkate aldı.
Bu çalışmada, biyolojik olarak aktif bir plazmid DNA (pDNA) vektörü sunarken ve elektroporasyondan sonra yeniden kaplanan ve kültürlenen hücrelerin elektro-transfeksiyon verimliliğini değerlendirirken sistemin verimini iyileştirmek için bu teknolojinin yeni bir uygulaması tanıtılmıştır. Önceki çalışma, elektroporasyon olayını elektriksel olarak ölçebilen mevcut mikro-elektroporasyon teknolojilerinden daha iyi performans göstermesine rağmen, cihazın mevcut durumu, hücre tespitini, darbe uygulamasını ve hücre zarı geçirgenlik ölçümünü gerçekleştirmek için elektrot seti (~ 250 ms) arasında uzun hücre geçiş süreleri gerektirir. Tek bir kanalla bu, aktarım hızını 4 hücre/sn ile sınırlar. Bu sınırlamayla mücadele etmek için, pDNA elektro-transfeksiyonunu gerçekleştirmek için hücre popülasyonuna dayalı geri besleme kontrollü elektroporasyonun yeni bir kavramı tanıtılmıştır. Bir hipofizyolojik iletkenlik elektroporasyon tamponu kullanarak, bu sistem çok sayıda elektroporasyon darbe uygulamasında tek hücrelerin elektriksel sorgulamasına izin verir. Elektrik tepkisine dayanarak, daha sonra 'optimal' bir elektroporasyon darbesi belirlenir. Daha sonra, hücre zarı geçirgenlik tayininin geçersiz kılındığı, akış hızının arttırıldığı ve elektroporasyon darbe görev döngüsünün, elektrotlar arasında geçişte hücre başına bir darbe sağlamak için hücre geçiş süresiyle eşleştirildiği bir 'yüksek verim' modu uygulanır. Bu çalışma, mikro cihazın üretimi için mikrofabrikasyon adımları, deneyi gerçekleştirmek için gereken malzeme / ekipman ve kurulumları ve cihazın çalışması / analizi ve elektro-transfeksiyon verimliliği (eTE) hakkında kapsamlı ayrıntılar sağlayacaktır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63103/63103fig01.jpg"> Şekil 1: Elektroporasyon sonuçlarını etkileyen deneysel faktörler. (Sol) Hücre Süspansiyonu-Elektroporasyonun başlamasından önce göz önünde bulundurulması gereken önemli faktörler şunlardır: Yük taşıma yükü (bu durumda, pDNA), konsantrasyon, hücre yoğunluğu ve elektroporasyon tampon özellikleri. Elektroporasyon tamponunun dikkate alınması gereken özellikleri iletkenlik, ozmolarite ve bu değerlere katkıda bulunan tam moleküler bileşimdir. (Orta) Darbe Uygulaması-Tam darbe tipi (kare dalgaya karşı üstel bozunum) ve darbe dalga formu (tek darbeye karşı darbe treni), hem ortaya çıkan hücre canlılığını hem de elektro-transfeksiyon verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmelidir. Elektroporasyon işlemlerinde uygulanan yaygın darbe trenleri tipik olarak bir dizi Yüksek Gerilim (HV) darbesinden veya YG ve Alçak Gerilim (LV) darbe büyüklükleri arasında dönen bir dizi darbeden oluşur. (Sağda) Hücre Geri Kazanımı-Aşağı akış işleme adımları, özellikle hücrelerin aktarıldığı geri kazanım hücre kültürü ortamı optimize edilmelidir. Öne çıkmayan (En Sol), genel elektroporasyon işlemi optimizasyonu için ek yukarı akış hücresi işleme adımları uygulanabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63103/63103fig1v3large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>150 mm çapında petri kapları</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td>adım 6.1.1 gofret sabitlemek için</td></tr><tr><td>24 oyuklu doku kültürü plakaları</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td>adım 10.3.6 plakaya elektroporasyonlu hücreler</td></tr><tr><td>33220A Dalga Formu/Fonksiyon üreteci</td><td>Agilent</td><td></td><td>adım 9.2.3 elektroporasyon darbe üreteci</td></tr><tr><td>4'' Si-gofretler</td><td>Üniversite Gofret</td><td></td><td>Mikroakışkan kanal imalatı için alt bölüm 2.1</td></tr><tr><td>6 oyuklu doku kültürü plakaları</td><td>VWR</td><td>10062-892</td><td>adım 8.1.8 plaka hücrelerine</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-4</td><td>adım 2.1.2 temizlik için ve&nbsp; adım 5.1 fotorezist kaldırma</td></tr><tr><td>Allegra X-22R Santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>adımlar 8.1.4 , 8.3.2. ve 8.3.3. hücreleri döndürmek için</td></tr><tr><td>AutoCAD 2018 Autodesk</td><td></td><td></td><td>alt bölüm 1.1. şeffaflık maskeleri tasarlamak için</td></tr><tr><td>Tamponlu oksit aşındırıcı 10:1</td><td>VWR</td><td>901621-1L</td><td>HF aşındırma için alt bölüm 3.1</td></tr><tr><td>CCD Monokrom mikroskop kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca 285 C4742-96-12G04</td><td>adım 11.2.3. CMOS kamerayı görüntülemek için</td></tr><tr><td>- Sensicam QE 1.4MP</td><td>PCO</td><td></td><td>alt bölüm 9.3 deney düzeneğinin bir parçası</td></tr><tr><td>İletken Epoksi</td><td>CircuitWorks</td><td>CW2400</td><td>alt bölümü 7.6. tel bağlantısı için</td></tr><tr><td>Konik Santrifüj Tüpleri, 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td>adım 8.1.4. hücre santrifüjleme için</td></tr><tr><td>Yüzey Profilometresi Yüzey profilometresi için Dektak 3ST Yüzey Profilometresi</td><td>Veeco (Sloan/Dektak)</td><td></td> <td>adım 2.1.15 ve 5.4 Yüzey profilometrisi için</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık biyopsi zımbası, 0,75 mm</td> Giriş erişimi için <td>Robbins Instruments</td><td>RBP075</td><td>adım 6.2.3</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık biyopsi punchı, 3 mm</td><td>Robbins Instruments</td><td>RBP30P</td><td>adım 6.2.3 çıkış erişimi için</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>abcam</td><td>ab108410</td><td>adım 11.2.2. canlı hücre boyama için</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885084</td><td>adım 8.1.2. medya bileşiminin bir parçası</td></tr><tr><td>E3631A Bipolar Üçlü DC güç kaynağı</td><td>Agilent</td><td></td><td>adım 9.2.1.-9.2.2.deney düzeneğinin bir parçası</td></tr><tr><td>Eclipse TE2000-U Ters&nbsp; Mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td>&nbsp; Alt Bölüm 9.3. deney düzeneğinin bir parçası</td></tr><tr><td>EVG620 UV Litografi Sistemi</td><td>EVG</td><td></td><td>&nbsp; Adım 2.1.9. ve 2.2.7. UV Maruziyeti için</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Nöromikleri</td><td>FBS001</td><td>adım 8.1.2. Medya bileşiminin bir parçası</td></tr><tr><td>FS20 Ultrasonik Temizleyici</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>subsection 5.1. fotorezist kaldırma için</td></tr><tr><td>Kapaklı Cam Medya Şişesi, 100 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB800100</td><td>adım 8.2.1. tampon depolama için</td></tr><tr><td>Kapaklı Cam Medya Şişesi, 500mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB800500</td><td>adım 8.1.2.medya depolama için</td></tr><tr><td>HEK-293 hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td>alt bölüm 8.1 hücre kültürü için</td></tr><tr><td>HEPES tampon çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83264-100ML-F</td><td>adım 8.2.1 elektroporasyon tampon bileşiminin bir parçası</td></tr><tr><td>Heksametildisilazan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>379212-25ML</td><td>adım 2.2.3 yapışma arttırıcı</td></tr><tr><td>HF2LI Kilitli Amplifikatör</td><td>Zürih Aletler</td><td></td><td>alt bölümü 9.2 deney düzeneğinin bir parçası</td></tr><tr><td>HF2TA Akım amplifikatörü</td><td>Zürih Aletleri</td><td></td><td>alt bölümü 9.2 deney düzeneğinin bir parçası</td></tr><tr><td>İzopropil Alkol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A459-1</td><td>temizlik için adım 2.1.2, SU-8 geliştirmesini takiben gofretin durulanması için adım 2.1.14 ve PDMS</td></tr><tr><td>IX81 floresan mikroskobu</td> temizlemek için adım 6.3.1 <td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin Çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513-20ML'yi</td> görüntülemek için adım 11.2.3 <td>adım 8.1.2. medya bileşiminin bir parçası</td></tr><tr>Cihaz üretimi için<td>M16878/1BFA 22 gauge tel</td><td>AWC</td><td>B22-1</td><td>alt bölüm 7.5</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208337-100G</td><td>adım 8.1.2 elektroporasyon tamponu bileşiminin bir parçası</td></tr><tr><td>MF 319 Geliştirici</td><td>: Kayaku İleri Malzemeler</td><td>10018042</td><td>Adım 2.2.9. Fotorezist</td></tr><tr><td>Geliştirici Microposit S1818 fotorezist</td><td>Kayaku Gelişmiş Malzemeler</td><td>1136925</td><td>adım 2.2.4 elektrot desenleme için pozitif fotorezist</td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları, 75 x 25 mm</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td>adım 2.2.1 elektrot soda kireç cam alt tabaka</td></tr><tr><td>Model 2350 Yüksek gerilim amplifikatörü</td><td>TEGAM</td><td>2350</td><td>adım 9.2.5. deney düzeneğinin bir parçası</td></tr><tr><td>Ulusal Aletler LaboratuvarıVIEW</td><td>Ulusal Aletler</td><td></td><td>veri toplama</td></tr><tr><td>İğnesi, 30G x 1 inç</td><td>BD Scientific</td><td>305128</td><td>adım 10.1.1. sistem hazırlama</td></tr><tr><td>PA90 IC parçası OPAMP Güç devresi</td><td>Digi-key</td><td>598-1330-ND</td><td>Özel devrenin bir parçası</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4458-20ML</td><td>adım 8.1.2. medya kompozisyonunun bir parçası</td></tr><tr><td>Plazmid pMAX-GFP</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>adım 8.3.4. hücre içi dağıtım için</td></tr><tr><td>Plastik boru, 0.010 '' x 0.030 "</td><td>VWR</td><td>89404-300</td><td>adım 10.1.2. sistem astarlaması için</td></tr><tr><td>Platin hedefler</td><td>Kurt J. Lesker</td><td></td><td>alt bölüm 4.2. fiziksel buhar biriktirme için</td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td>Adım 8.2.1. Elektroporasyon tampon bileşiminin bir parçası</td></tr><tr><td>Pompa 11 PicoPlus mikroakışkan şırınga pompası</td><td>Harvard Apparatus</td><td>MA1 70-2213</td><td>adım 10.1.4. sistem hazırlama için</td></tr><tr><td>PVD75 Fiziksel buhar biriktirme sistemi</td><td>Kurt J. Lesker</td><td></td><td>alt bölüm 4.1. fiziksel buhar biriktirme için</td></tr><tr><td>PWM32 Döndürücü Sistem</td><td>İlerleme Araştırma</td><td></td><td>adımları 2.1.6 ve 2.2.2. fotorezist</td></tr> <tr><td>ile alt tabaka kaplaması içinPX-250 Plazma işleme sistemi</td><td>March Instruments</td><td></td><td>PDMS ve cam alt tabaka yapıştırma için alt bölüm 7.2</td></tr><tr><td>SDG1025 Fonksiyon/Dalga formu üreteci</td><td>Siglent</td><td></td><td>adım 9.2.2. deney düzeneğinin bir parçası</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td>adım 8.2.1. elektroporasyon tampon bileşiminin bir parçası</td></tr><tr><td>SU-8 2010 negatif fotorezist</td><td>Kayaku İleri Malzemeler</td><td>Y111053</td><td>adım 2.1.7. mikroakışkan kanal desenlemesi için</td></tr><tr><td>SU-8 geliştiricisi</td><td>Microchem</td><td>Y010200</td><td>adım 2.1.12. fotorezist geliştirmek için</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903-1KG</td><td>adım 8.2.1. elektroporasyon tampon bileşiminin bir parçası</td></tr><tr><td>Sylgard 184 elastomer kiti</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>adım 6.2.1&nbsp; 10: 1 PDMS polimer ve sertleştirici madde karışımı</td></tr><tr><td>Şırınga, 1 ml</td><td>BD Bilimsel</td><td>309628</td><td>adım 8.3.4. sistem hazırlama parçası</td></tr><tr><td>SZ61 Stereomikroskop Sistemi</td><td>Olympus</td><td></td><td>alt bölüm 7.3. kanal ve elektrot hizalaması için</td></tr><tr><td>Doku Kültürü İşlem Görmüş T25 Şişeleri</td> Hücre kültürü için <td>Falcon</td><td>353108</td><td>adım 8.1.2</td></tr><tr><td>Titanyum hedefleri</td><td>Kurt J. Lesker</td><td></td><td>alt bölüm 4.2. fiziksel buhar biriktirme için</td></tr><tr><td>Saydamlık maskeleri</td><td>CAD/ART Hizmetleri</td><td></td><td>adımları 2.1.9. ve 2.2.7. fotolitografi için</td></tr><tr><td>Trikloro(1H,1H,2H,2H-perflorooktil)silan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931-10G</td><td>adım 6.1.2. gofret silanizasyonu için</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td>adımları 8.1.3. ve 8.3.1. hücre toplama için</td></tr></tbody></table>

sürekli akışlı, permeabilizasyon algılamalı mikro-elektroporasyon sisteminin imalatı ve işletilmesi

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

CAR-T hücre tedavisi gibi mevcut terapötik yenilikler, viral aracılı gen dağıtımına büyük ölçüde bağımlıdır. Verimli olmasına rağmen, bu tekniğe yüksek üretim maliyetleri eşlik eder ve bu da gen dağıtımı için alternatif yöntemler kullanmaya ilgi duyulmasını sağlamıştır. Elektroporasyon, genlerin ve diğer eksojen materyallerin hücre içi iletimi için elektro-fiziksel, viral olmayan bir yaklaşımdır. Bir elektrik alanın uygulanması üzerine, hücre zarı geçici olarak hücreye moleküler olarak verilmesine izin verir. Tipik olarak, elektroporasyon çok sayıda hücreyi işlemek için makro ölçekte gerçekleştirilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, birincil ve transfekte edilmesi zor hücre tipleriyle çalışırken maliyetli olan kapsamlı ampirik protokol geliştirmeyi gerektirir. Uzun protokol geliştirme, hücreleri geçirgenleştirmek için yeterli elektrik alanı kuvvetlerini elde etmek için büyük voltajların gerekliliği ile birleştiğinde, mikro ölçekli elektroporasyon cihazlarının geliştirilmesine yol açmıştır. Bu mikro-elektroporasyon cihazları, yaygın mikrofabrikasyon teknikleri kullanılarak üretilir ve yüksek verim yeteneklerini sürdürme potansiyeli ile daha fazla deneysel kontrol sağlar. Bu çalışma, sürekli akış altında tek hücre seviyesinde hücre zarı geçirgenliği seviyesini tespit edebilen bir mikroakışkan-elektroporasyon teknolojisi geliştirmektedir. Bununla birlikte, bu teknoloji saniyede işlenen 4 hücre ile sınırlıydı ve bu nedenle sistem verimini artırmak için yeni bir yaklaşım önerildi ve burada sunuldu. Hücre popülasyonuna dayalı geri besleme kontrolü olarak belirtilen bu yeni teknik, çeşitli elektroporasyon titreşim koşullarına hücre geçirgenliği tepkisini dikkate alır ve test edilen hücre tipi için en uygun elektroporasyon darbe koşullarını belirler. Daha sonra, bu 'optimal' darbenin geçiş halindeki hücre süspansiyonuna uygulandığı daha yüksek bir verim modu kullanılır. Cihazın üretilmesi, mikroakışkan deneylerin kurulması ve çalıştırılması ve sonuçların analiz edilmesi adımları ayrıntılı olarak sunulmaktadır. Son olarak, bu mikro-elektroporasyon teknolojisi, HEK293 hücrelerine yeşil floresan protein (GFP) için bir DNA plazmid kodlaması göndererek gösterilmiştir.

Şekil 4, tek bir darbe genliği için tek hücre seviyesinde membran geçirgenliği algılamasının arkasındaki çalışma prensiplerini vurgulamaktadır. Elektroporasyon deneyinin başlatılmasını takiben, hücre algılama algoritması, noktadan noktaya, eğim tabanlı bir algılama yöntemiyle hücre tespiti için en uygun eşiği belirler. Sistem daha sonra ölçülen elektrik akımında önemli bir negatif değişiklik olup olmadığını sürekli olarak izler (1), bu da bir hücrenin girişinin göstergesidir. Bunun nedeni, b...

Bu protokol, çip üzerinde laboratuvar, mikroakışkan elektroporasyon cihazı oluşturmak için gereken mikrofabrikasyon tekniklerini açıklar. Deney düzeneği, sürekli bir akışta kontrollü, tek hücre düzeyinde transfeksiyonlar gerçekleştirir ve popülasyon tabanlı kontrol ile daha yüksek verimlere genişletilebilir. Hücre zarı geçirgenliğinin derecesini gerçek zamanlı olarak elektriksel olarak izleme yeteneğini gösteren bir analiz sağlanmıştır.

Sürekli akışlı, permeabilizasyon algılamalı mikro-elektroporasyon sisteminin imalatı ve işletilmesi

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...

Bu yöntem, araştırmacıların istenen hücre tipi için optimal elektroporasyon titreşim koşullarını belirlemelerini sağlarken, geleneksel ampirik deneysel yaklaşıma olan ihtiyacı en aza indirir. Bu yöntem, elektroporasyon işlemi boyunca hücre zarı geçirgenliğinin derecesini elektriksel olarak izleyebilen ölçeklenebilir bir mikroakışkan çalıştırma cihazı üretmek için mikro-elektroporasyon tekniklerini kullanır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Kishankumar Busha olacak.Başlamak için, silikon gofreti, spin kaplayıcının vakum sistemini kullanarak gofret spin kaplayıcının mancasına sabitleyin. Ardından iplikçiyi programlayın. Daha sonra, silikon gofretin merkezine dört mililitre SU-8 2010 fotoğraf direnci dağıtın ve programı çalıştırın.Sistem durduğunda, vakumu kapatın. Ardından, 2D mikroakışkan kanal tasarımlarıyla fotoğraf maskesini maske tutucuya sabitleyin ve SU-8 kaplamalı silikon gofreti gofret mandren üzerine yerleştirin. Santimetre kare başına 150 milijul pozlama ayarlarını yapın ve makineyi çalıştırın.UV ışınlarına maruz kaldıktan sonra, silikon gofreti SU-8 geliştirici çözümüne üç ila dört dakika boyunca nazik bir ajitasyonla batırın. Daha son

the-fabrication-operation-continuous-flow-micro-electroporation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Temassız dielektroforez (cDEP) kendi içsel dielektrik özellikleri aracılığıyla sıralama ve parçacıkların zenginleştirme ulaşır. Fluidic elektrot kanallar steril karakterizasyonu olmayan zarar ve biyolojik parçacıkların sıralamaya cDEP takım elbise kumaşı, DEP geleneksel metalik elektrotlar değiştirin. Biz bir cDEP mikrocihazda hazırlamak ve hücre karakterizasyonu ve sıralama deneyler nasıl gösterilmektedir.

Temassız dielektroforez sayesinde etiket ücretsiz İzolasyon ve Hücreler zenginleştirilmesi

Bir mikro-akışkan girdap eliyle elektroporasyon platformu kesin dozaj ve bağımsız kontrolü ile aynı hücre popülasyonlarına dağılımını çok sayıda molekülün ardışık olarak verilmesi için geliştirilmiştir. Sistemin büyüklüğü göre hedef hücre saflaştırma adımı önceki elektroporasyon moleküler verme etkinliğini ve işlenmiş hücre canlılığı arttırmak için destekli.

Microscale Vortex destekli Sıralı Moleküler Teslimat için Electroporator

Birden mikroakışkan kanallarda parçacıkların algılama ve boyutlandırma multipleks için, kod bölmeli çoklu erişim (CDMA) ile rezistif darbe algılama (RPS) birleştiren entegre bir yüzey elektrot ağı ile mikroakışkan platformu göstermektedir.

Parçacıkların Mekansal Takip için Çoklanmış Elektronik Algılama ile mikroakışkan Platformu

ne olursa olsun çalışma koşulları, ICP bölgenin ilerlemesini durdurabilir yeni bir iyon konsantrasyon kutuplaşma (ICP) platformu için protokol açıklanmıştır. Platformun bu sağlıyor ICP olgusunun iki polarizasyona olan iyon tükenmesi ve zenginleştirme, birleştirme kullanılması yatmaktadır.

Yan yana İyon Değişimi Membranlar arasında İyon Konsantrasyon Polarizasyon birleştirme Polarizasyon Bölgesi İlerlemesinin yasakla

Bir mikrosıvısal Biyoalgılayıcı platform tasarlanmıştır ve çeşitli analitlerin hızlı ve hassas miktar için düşük maliyetli kuru film fotorezist teknolojisi kullanılarak imal edilmiştir. Bu tek kullanımlık sistem-küçük parça-immobilize enzim bağlı deneyleri elektrokimyasal göstergesi için stop-akış tekniği yoluyla sağlar.

Kuru zar elektrokimyasal mikrosıvısal Biyoalgılayıcı fotorezist tabanlı Platform: Cihaz imalat, On-chip tahlil hazırlama ve sistemin çalışması

Bu protokol, bir mikroakışkan çipe dayalı bir sürekli akışlı polimeraz zincir sisteminin nasıl oluşturulacağını ve laboratuvarda bir kapiler elektroforez sisteminin nasıl oluşturulacağını açıklar. Laboratuvarda nükleik asitlerin analizi için basit bir yöntem sunar.

Escherichia coli'nin Sürekli Akış-PCR Mikroakışkan Çipinde Amplifikasyonu ve Kapiler Elektroforez Sistemi ile Tespiti

Gözenekli substrat elektroporasyonu (PSEP), tutarlı, yüksek verimli iletimi yüksek hücre canlılığı ile eşleştirir. Transepitelyal elektrik empedans (TEEI) ölçümlerinin tanıtılması, PSEP'in ara süreçleri hakkında bilgi sağlar ve etiketsiz teslimata olanak tanır. Bu makalede, PSEP dağıtım deneylerini ve TEEI ölçüm analizini aynı anda gerçekleştirmek için bir yöntem tartışılmaktadır.

Transepitelyal Elektriksel Empedans İzleme ile Gözenekli Substrat Bazlı Elektroporasyon

Elektroporasyon, moleküler kargoyu tanıtmak için hücre kültürlerinde geçici gözenekler oluşturmak için darbeli elektrik alanlarının (PEF'ler) kullanılmasıdır. Bu teknik son zamanlarda araştırma ve klinik ortamlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, canlı hücreli, floresan mikroskobu gerçekleştirmek için yakın zamanda geliştirilen "Elektroporasyon Sitometri Sistemi" ni kullanarak elektroporasyon tekniklerini açıklıyoruz.

U2 OS Hücre Kültürü Kullanılarak Canlı Hücre, Floresan Mikroskobu için Bir Elektroporasyon Sitometrisi Protokolü

"E-DNA" sensörleri, reagentless, kan ve diğer karmaşık matrisler doğrudan meydan bile iyi bir performans elektrokimyasal biyosensörler, nükleik asit, protein ve küçük molekül analitler geniş bir algılama için adapte edilmiştir. Burada bu tür sensörlerin üretimi ve kullanımı için genel bir prosedür mevcut.

Nükleik Asitler, Proteinler ve Küçük Moleküller Reagentless Algılama Elektrokimyasal DNA Biyosensörler Fabrikasyon

Steril bir sürekli akış devresi, laminer akış kayma gerilmesi tabi yapışık hücrelere için bir yöntem tarif. Hücrelerin yapışma, morfoloji, şeffaf oda ile devre metaboliti analizi ve gelecek deneyler ya da kültür için kayma maruz kaldıktan sonra hasat hücreleri için alınan numuneler incelenmiştir olabilir.

Laminer Akış Kesme Stres altında endotel progenitör hücrelerin değerlendirin Paralel plakalı Akış Odası ve Sürekli Akış Devre

Öğrenin, mikro-elektroporasyon teknikleriyle ölçeklenebilir mikroakışkanlı cihaz üretimini ve gerçek zamanlı hücre membranı geçirgenliği izlemeyi. Bu yöntem, optimal elektroporasyon darbe koşullarını belirlemeye yardımcı olur.

Sürekli akışlı, permeabilizasyon algılamalı mikro-elektroporasyon sisteminin imalatı ve işletilmesi

Daha fazla video keşfet