Glifosat Bazlı Ürünlerin Mikrobiyomlar Üzerindeki Potansiyel Etkisinin Ölçülmesi
January 10th, 2022
Glifosat bazlı ürünler (GBP), dünya çapında en yaygın geniş spektrumlu herbisitlerdir. Bu makalede, GBP'nin mikrobiyomlar üzerindeki etkisini ölçmek için saha deneylerinden biyoinformatik analizlere kadar genel kılavuzlar sunuyoruz.
Burada, glifosatın mikrobiyomlar üzerindeki etkisini değerlendirmek için deneyleri yürütmek için en iyi biyoinformatik yöntemini içeren bir iş akışı sunuyoruz. Başlıca avantajı, gelecekteki saha ve laboratuvar deneyleri için sağlam bir test edilebilir hipotez sağlamasıdır. Açıklanan metodoloji, bitkiler, hayvanlar ve mikroplar dahil olmak üzere çeşitli sistemlere uygulanabilir.
Metodolojinin her bir parçası oldukça basittir. Belki de en zor kısım, işin farklı bölümlerini gerçekleştirebilecek multidisipliner bir ekibi entegre etmektir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir araştırmacı olan Suni Matthew olacak.
Başlamak için, deney alanını 10 kontrol kopyasına bölerek ve araziler arasındaki tampon bitki örtüsü şeritleriyle GBP işlemine bölerek birinci deneye başlayın. Tarımsal uygulamalarda izin verilen maksimum glifosat dozajını taklit etmek için kontrol arazilerini musluk suyuyla ve GBP arazilerini ticari GBP ile tedavi edin. Mikrobiyotayı deneysel bitkilerden örnekleyin.
Bitki örneklerinin 10 kopyasını tarladan toplayın, hemen buzun üzerine yerleştirin ve daha fazla işlem için laboratuvara getirin. İkinci deney için, 12 aylık bir kuş kafesi deneyinde odun talaşı, dışkı ve GBP kontamine veya kontrol yemleriyle beslenen bıldırcınlardan dökülen bazı yemler de dahil olmak üzere yatak takımlarını toplayın. Yatak numunelerini, yayıldıktan hemen sonra glifosat konsantrasyon ölçümleri için akredite bir laboratuvara gönderin.
Kök ve yaprak mikrobiyotalarını incelemek için her arsaya çok yıllık çim ve çilek bitkileri ekin. Bitki örneklerini yıkayarak ve sterilize ederek endofitik mikropları tanımlayın ve çıkarın. Numuneler sterilize edildikten sonra, üreticinin protokolünü izleyerek ticari olarak temin edilebilen bir bitki DNA ekstraksiyon kiti kullanarak genomik DNA'yı çıkarın.
İç içe geçmiş bir yaklaşım kullanarak, 16S rRNA geninin V6 ila V8 değişken bölgelerini yükseltin ve metin makalesinde açıklandığı gibi gerekli sayıda örnek için PCR ana karışımını yapın. PCR'nin ilk turu için, 799 ileri ve 1492 geri primerleri kullanın. Termosikletteki amplifikasyon profilini 35 döngü için ayarlayın.
Amplifikasyonu doğrulamak için, beş mikrolitre yükseltilmiş ürün kullanarak elektroforez yapın ve daha sonra PCR ürününün geri kalan 25 mikrolitresini otoklavlanmış ultra saf suda bir ila 10 oranında seyreltin. 1062 ileri ve 1390 geri üniversal primerleri kullanarak, ikinci amplifikasyon turunu 25 döngü ile gerçekleştirin. Elde edilen PCR ürünlerini otoklavlanmış ultra saf suda eşit oranda seyreltin.
Ürünleri barkodlar ve P1 adaptör dizisi ile etiketlemek için sekiz döngü ile üçüncü amplifikasyon turunu gerçekleştirin. Bir biyoanalizör üzerinde PCR ürünlerinin kalitesindeki konsantrasyonu doğrulayın ve bir equimolar kütüphane hazırlamak için her bir numunenin 30 nanogramlık DNA'sını oluşturan hacimleri 1.5 mililitrelik bir tüpte toplayın. Bir agaroz jel kaseti üzerinde otomatik bir DNA boyutu seçim sistemi kullanarak boyut fraksiyonasyonuna göre 350 ila 550 baz çifti boyutlarındaki amplikonları seçin.
Belirtilen boyuttaki amplikonları içeren elute'yi kasetteki bir şişede toplayın ve saflaştırılmış bir 16S rRNA gen kütüphanesi elde edin. Toplanan elüenti 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve biyoanalizör üzerindeki saflığı ve konsantrasyonu doğrulayın. DNA kütüphanesini otoklavlanmış ultra saf su kullanarak 26 pikomolar'lık son konsantrasyona kadar seyreltin.
ITS bölgesini yükseltmek için, reaksiyonu ITS astarlarıyla ayarladıktan sonra, termosiklustaki amplifikasyon profilini ayarlayın. Daha sonra% 1.5 agaroz jeli üzerinde güçlendirilmiş ürünün beş mikrolitresini analiz edin ve otoklavlanmış ultra saf su kullanarak kalan 25 mikrolitre ürünü bir ila 10 oranında seyreltin. Barkod etiketli ileri astarlar ve P1 adaptörü etiketli ters astarlarla gerekli sayıda numune için PCR ana karışımını yapın.
Seyreltilmiş PCR ürününü şablon olarak kullanarak, ikinci amplifikasyon turunu gerçekleştirin. 16S rRNA geni için kütüphane hazırlığına benzer şekilde, saflaştırılmış ITS bölgesi için kütüphaneyi hazırlayın. EPSPS protein dizisinin biyoinformatik analizlerini başlatın.
Sorgu dizisinin, sorgu dizilerinde bulunan amino asit işaretleyicilerinin fraksiyonunu ve motiflerin sayısını gösterdiği sunucudan sağlanan çıktılardan glifosata karşı potansiyel duyarlılığını değerlendirin. İkinci çıktı, sorgunun hizalamalarını ve işaretçi kalıntılarına dayalı başvuru dizilerini gösterir. Üçüncü çıktı, sorgu ve başvuru dizilerinin çift yönlü tam hizalamalarını gösterir.
Dördüncü çıktı, Vibrio cholerae, Coxiella burnetii, Brevundimonas vesicularis ve Streptomyces davawensis'in EPSPS referans dizilerini göstermektedir. Çıktı sayfasının sonunda, sorgu EPSPS sırasını daha ayrıntılı çözümlemek için BLASTp ve korunmuş etki alanları gibi harici araçların bağlantılarını bulun. Genel depolardan EPSPS dizilerini tanımladıktan sonra, bu veri kümelerine EPSPS sınıfı sunucusunun taksonomik bilgileri ve 50.000'den fazla diziden oluşan EPSPS sınıfını içeren ana sayfasından erişin.
GBP'deki bitkilerin büyümesini karşılaştırmak ve arazileri kontrol etmek için tarla mevsiminin sonunda bitkilerin toprak üstü biyokütlesini tartın. Bir elektronik tabloda, mikrobiyom deneyleri için bakteriyel OTU'ları önceden hesaplanmış veri kümelerine eşleyin. Ve olasılıksal bir skora dayanarak, glifosata karşı içsel duyarlılığı hesaplayın.
Bu yöntem, EPSPS proteinindeki duyarlılıktaki değişiklikleri mikro evrimsel düzeyde ölçmek için kullanıldı. Analiz edilen yakından ilişkili 32 prokaryot grubundan 12'sinde duyarlılık durumundaki değişiklikleri tespit ettik. Bu nedenle, glifosat bazlı ürünlerin sürekli kullanımı, bitki, hayvan ve toprak mikrobiyomlarında mikrobiyoz üretebilir.
Optimum amplikon kütüphaneleri elde etmek için PCR öncesi ve sonrası prosedürlerin kalitesini sağlayın. Ayrıca, yazılımı kullanmadan önce EPSPS protein dizisinin kısmi olmadığından emin olun. Saha deneylerinde, kontrollerin glifosat ile kontaminasyonunu önlediğinizden emin olun.
Genel Bakış
Bu makale, glifosat bazlı ürünlerin mikrobiyoma üzerindeki etkisini değerlendirmek için kapsamlı bir metodoloji sunar. Mikrobiyal topluluklarındaki değişiklikleri kantitatif olarak belirlemek için deneysel tasarımları ve biyoinformatik yaklaşımları özetlemektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Çevre Bilimi
- Tarım Uygulamaları
Arka Plan
- Glifosat, mikrobiyoma üzerinde potansiyel etkileri olan yaygın olarak kullanılan bir herbisidir.
- Etkisi anlamak, ekolojik ve tarımsal sağlık için çok önemlidir.
- Çalışma, saha deneylerini biyoinformatik analizlerle entegre etmektedir.
- Etkili araştırma için multidisipliner işbirliği esastır.
Çalışmanın Amacı
- Glifosatın bitki, hayvan ve toprak mikrobiyoma üzerindeki etkilerini kantitatif olarak belirlemek.
- Bu alanda gelecekteki araştırmalar için sağlam bir çerçeve sağlamak.
- Glifosatın neden olabileceği potansiyel mikrobiyal disbiyozları tanımlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Kontrol ve glifosat ile tedavi edilen arsalar ile saha deneyleri.
- Bitkilerden ve yatak malzemelerinden mikrobiyal örnekleme.
- Genomik DNA ekstraksiyonu ve mikrobiyal genlerin PCR amplifikasyonu.
- EPSPS protein dizilerinin biyoinformatik analizleri.
Ana Sonuçlar
- Glifosat üzerindeki mikrobiyal hassasiyetteki değişiklikleri belirleme.
- Tedavi edilen ortamlarda potansiyel mikrobiyal disbiyozu gösterme.
- Glifosat'ın etkisini değerlendirmek için detaylı bir iş akışı sağlama.
- Deneysel prosedürlerde kalite kontrolün önemini vurgulama.
Sonuçlar
- Sürekli glifosat kullanımı mikrobiyal toplulukları bozabilir.
- Metodoloji çeşitli ekolojik çalışmalar için uyarlanabilir.
- Gelecek araştırmalar uzun vadeli ekolojik etkilere odaklanmalıdır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantifying the impact of glyphosate-based products on microbiomes addresses a critical challenge in agricultural and environmental biotechnology, where unintended effects on non-target microbial communities can influence plant health and ecosystem stability. This workflow enables robust hypothesis testing and predictive assessment of microbial sensitivity, supporting risk-adjusted decisions in agrochemical R&D portfolios. Integrating bioinformatics with field data enhances translational continuity from discovery to environmental risk evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microbial pathway susceptibility to glyphosate via EPSPS sequence analysis.
- Supports biological de-risking by identifying non-target organisms potentially affected by herbicide exposure.
- Facilitates predictive confidence in environmental safety assessments for new agrochemical candidates.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microbiome samples for downstream sequencing and bioinformatics workflows.
- Standardizes PCR-based amplification and library preparation for reproducible microbial profiling.
- Generates quantitative outputs on microbial community composition and glyphosate sensitivity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns field and laboratory data to assess translational relevance of microbiome shifts in real-world settings.
- Supports continuity from molecular target analysis to ecosystem-level impact studies.
- Informs risk-adjusted advancement of agrochemical products with environmental stewardship considerations.
Pipeline & Workflow Integration
This methodology bridges early discovery, screening, and translational research by integrating field sampling, molecular profiling, and bioinformatics analysis of EPSPS sensitivity.
- Discovery Biology: Provides a framework for hypothesis-driven testing of glyphosate effects on microbial pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative microbiome data for comparative analysis across treatments.
- Analytics: Outputs probabilistic sensitivity scores and sequence alignments to inform risk assessment.
- Translational Research: Connects molecular findings to field-level ecological outcomes for regulatory and stewardship decisions.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable workflow adaptable to diverse plant, animal, and environmental systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in non-target impact assessments and target validation.
- Operational Value: Standardizes multidisciplinary workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage ecological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of agrochemical candidates with environmental considerations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, bioinformatics, and field ecology.
- Needs access to sequencing platforms, PCR instrumentation, and computational resources.
- Demands rigorous cross-team standardization for sample handling and data analysis.
- Must adapt protocols for different microbiome sources and environmental matrices.
- Relies on high-quality sequence data and contamination control for reliable outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:52
Two Field Experiments to Test the Effect of Glyphosate Based Products (GBPs)
1:58
Microbiome Analyses: 16S rRNA and ITS Gene Amplification, and Library Preparation
4:59
Algorithm to Determine the Potential Sensitivity of Organisms to Glyphosate
5:56
Assessing the EPSPS Class from Universal Microbial Markers
6:40
Results: Quantification of Microbial Species Sensitivity after GBPs Usage
7:10
Conclusion
