Name: Kornea Yara İyileşmesini İncelemek İçin Epitelyal Aşınma Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 45 s
Description: Öğrenin farelerde kornea epitel aşınması yara modeli oluşturmayı. Bu yöntem, trephine ve künt spud kullanarak tekrarlanabilir yaralar oluşturur ve kornea iyileşmesi ile inflamasyonu incelemek için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansman: Destekleyen: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S. ve R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.) ve Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri veya Sigma Xi'nin resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Tüm hayvan protokolleri, Houston Üniversitesi ve Baylor Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komiteleri tarafından onaylanmıştır. Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) bildirisinde özetlenen ve hayvanların görme ve oftalmik araştırmalarda kullanımına ilişkin kılavuzlar, farelerin ele alınmasında ve kullanılmasında takip edilmiştir.
1. Hazırlık
<ol><li>Floresein çözeltisinin hazırlanması<ol>
<li>10 mg sodyum floresein tuzunu 1 mL steril salin veya steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözerek% 1 floresein çözeltisi hazırlayın. NOT: Mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için sodyum floresein çözeltisini kullanım gününde veya bir gün önce hazırlayın. Kullanımdan bir gün önce hazırlandığında, floresein çözeltisini ışıktan 4 ° C'de saklayın. Fotobeyazlatmayı önlemek için tüpleri alüminyum folyo ile sarın.</li>
		<li>Çözeltiyi tek bir deneyde kullanıma uygun alikotlara bölün. Zaman noktası başına fare başına 1-1,5 μL floresein çözeltisi kullanılır. Tek bir denemeye uygun aliquot hacmini hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63112/63112eq01.jpg"> NOT: Örneğin, beş zaman noktasında izlenen yara büyüklüğüne sahip tek bir deneyde altı fare incelenirse, bu tek deney için uygun olan aliquot hacmi şöyle olacaktır: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63112/63112eq02.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Farelerin anestezisi için ketamin / ksilazin kokteylinin hazırlanması.<ol>
<li>10 mL kokteyl hazırlamak için, 2.0 mL ketamin (100 mg / mL) ile 1.0 mL ksilazin (20 mg / mL) karıştırın ve 7.0 mL steril PBS ekleyin. Ketamin / ksilazin kokteylini ameliyattan bir gün önce veya ameliyat günü hazırlayın. NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm çözeltiler oda sıcaklığında kullanılmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Anestezi
<ol><li>Uygulanacak uygun anestezik miktarını belirlemek için fareyi (8-12 haftalık C57BL/6 vahşi tip fareler) tartın. Anestezik18'in enjeksiyonu için fareleri kısıtlamak ve işlemek için iki elli fare kısıtlama tekniğini kullanın. Ketamin / ksilazin kokteylini intraperitoneal olarak (i.p.) 80 mg / kg ketamin ve 8 mg / kg ksilazin nihai konsantrasyonunda uygulayın.</li>
	<li>Fareye kornea yaralaması yapmadan önce tam anestezi elde edilene kadar bekleyin. Ayak parmağını sıkıştırdıktan sonra pedal refleksini değerlendirerek anestezi derinliğini değerlendirin. Yeterli anestezi sağlandığında, fare ayak parmağını sıkıştırmak için hareket etmemelidir. NOT: Fareler anestezi sırasında vücut ısısını hızla kaybettiğinden, hipotermiyi önlemek için farelere bir sıcaklık kaynağı sağlamak önemlidir. Anestezi ve iyileşme aşamalarında fareleri bir ısı kaynağına (ısıtma yastığı) yerleştirin.</li>
</ol>3. Kornea yarası oluşumu
<ol><li>Sadece sağ veya sol gözü yaralayın. Fareden fareye geçerken yaralanan gözle (yani sol veya sağ) tutarlılığı koruyun. NOT: Aşınmalar kornea sinirlerine zarar verdiğinden ve keskinliği azalttığından, her iki gözün yaralanması önemli rahatsızlıklara ve bozulmalara neden olabilir. Analjezikler enflamatuar yanıtları baskılama potansiyeline sahip olduklarından, kullanımları kornea iltihabını anlamayı amaçlayan bazı deneylerde kafa karıştırıcı olabilir. Kornea yarası deneylerinde analjeziklerden kaçınmak, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitemiz (IACUC) tarafından onaylanmıştır.</li>
	<li>Epitel kornea yarası oluşturmak için<ol>
<li>Diseksiyon mikroskobu altında, korneanın merkezini ayırmak için 2 mm çapında trefin kullanın (bkz. Şekil 1), göz kapaklarını tutmak için baş parmak ve işaret parmağını kullanarak gözü geniş tutun. Kornea epiteli üzerinde bir izlenim bırakmak için trefin'i yavaşça döndürün. NOT: Trefin kullanırken aşırı basınç uygulanmamasına dikkat edilmelidir, çünkü bu kornea perforasyonuna neden olabilir. Ayrıca, trefinin merkezi olarak konumlandırılmasına özen gösterilmelidir. Öğrenciler korneanın merkezini bulmak için bir dönüm noktası olarak kullanılabilir.</li>
		<li>Diseksiyon yapan bir mikroskop altında, künt golf spodu (bkz. Şekil 1), trefin ile sınırlandırılmış alan içinde kornea yüzeyinden yaklaşık 45 ° 'de tutun. Epiteli debride debride etmek için sınırlanmış bölgedeki epiteli dikkatlice ve sürekli olarak pud ile kazıyın. NOT: Debridmanda aşırı kuvvet uygulamayın, çünkü bu da kornea perforasyonuna neden olabilir. Farelerin gözleri yaralama işlemi sırasında kuruyabilir ve bu da debridmanı zorlaştırır. Böyle bir durumda, optimum hidrasyonu sağlamak için oküler yüzeye steril PBS uygulayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig01.jpg"> Resim 1: 2 mm trefin ve künt golf sopası spud. Trefin, kornea merkezinde dairesel bir bölgeyi sınırlamak için kullanılır ve golf kulübü spud'u, sınırlandırılmış bölgedeki epiteli çıkarmak için kullanılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63112/63112fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
4. Yara kapanmasının izlenmesi ve yeniden epitelizasyonun izlenmesi
<ol><li>Pipet 1-1.5 μL% 1 floresein çözeltisi mavi ışık kaynaklı dijital bir mikroskop kullanarak yaralı yüzey ve görüntü korneası üzerine.</li>
	<li>Yara boyutunun abartılmasına yol açan çevredeki epitellere yayılmasını önlemek için floresan çözeltisinin ilk dakikasında görüntüler elde edin. Yaralı kornealar, yaralanmadan sonra belirli zamanlarda (yani, 0 saat, 12 saat, 18 saat, 24 saat ve 30 saat) görüntülenir. NOT: Tüm zaman noktalarında, görüntüleme anestezi altında yapılır; ketamin / ksilazin yaralama sırasında kullanılırken, izofluran sonraki zaman noktalarında kullanılır. Fareler, yara kapanma izleme süresi boyunca ayrı kafeslerde ayrı ayrı tutulur. Birlikte barındırıldığında, fareler çöp arkadaşının gözlerini yalama eğilimindedir, bu da farklı dokularda yara iyileşmesini etkilediği gösterilen bir davranış19,20.</li>
	<li>Bir görüntü analiz yazılımı kullanarak yara alanını izleyerek yakalanan görüntüleri analiz edin. Her zaman noktası için yara alanı, 0 saatte orijinal yara alanının yüzdesi olarak ifade edilir.</li>
</ol>5. İmmünofloresan görüntüleme ve analizi
<ol><li>IACUC onaylı bir yöntemle (bu durumda, karbondioksit doz aşımı ve ardından servikal çıkık) fareleri, yaralamadan sonra istenen zaman noktalarında ötenazileştirin.</li>
	<li>İris kavisli makas kullanarak göz küresini yerinden etmek için yanal canthus'a hafifçe bastırarak göz kürelerini toplayın. Optik siniri sıkıca kavramak için makası göz küresinin arkasına yönlendirin ve ardından göz küresinin çıkarılmasını sağlayan siniri kesin.</li>
	<li>Her bir göz küresini, oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 2 paraformaldehit içeren 1 mL'lik 1x PBS'ye sabitleyin ve ardından her biri 5 dakika boyunca 1 mL'lik 1x PBS'de üç kez yıkayın.</li>
	<li>Diseksiyon mikroskobu altında, sklerada bir kesi yapmak için bir cerrahi bıçak kullanın, limbusa yaklaşık 500 μm distal ve daha sonra dünyayı kesin. Forseps kullanarak, iris maddesini korneadan nazikçe çıkarın ve daha sonra limbus'u sağlam bıraktığınızdan emin olarak skleral dokuyu dikkatlice kesin.</li>
	<li>Her biri yaklaşık 1 mm uzunluğunda, periferik korneadan uzanan ve korneanın düzleşmesine izin vermek için merkezden kısa duran dört kısmi radyal kesim yapın.</li>
	<li>Korneaları 15 dakika boyunca 1 mL% 2 sığır serum albümini (BSA) ve% 0.01 TritonX -100'de 1x PBS'de% 0.01 TritonX -100'de geçirgenleştirin ve bloke edin, ardından oda sıcaklığında 45 dakika daha 1x PBS'de% 2 BSA'da bloke edin.</li>
	<li>Korneaları% 2 BSA içeren 1x PBS'de hazırlanan doğrudan etiketlenmiş benzersiz florokrom konjuge antikorlardan oluşan bir kokteylde 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin. NOT: Antikorlar, ilgilenilen belirli hücreleri ve dokuları etiketlemek için hedeflenir. Örneğin, endotel, nötrofiller ve trombositler sırasıyla anti-CD31 21,22, anti-Ly-6G 23,24 ve anti-CD41 25,26 antikorları ile etiketlenmiştir. Çekirdekleri görselleştirmek için antikor kokteyline 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) eklenir.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra, korneaları her biri 15 dakika boyunca 1x PBS'de üç kez yıkayın.</li>
	<li>Korneaları mikroskop üzerine bir damla solma önleyici floresan montaj ortamına monte edin, bir kapak kayması ile örtün ve bir floresan ışık mikroskobu kullanarak istenen büyütme (4x ila 100x objektif) ile görüntü. Şekil 2A'da gösterildiği gibi korneanın farklı bölgelerdeki tam kalınlıkta görüntülerini alın. NOT: Şekil 2A'da gösterilen mikroskobik analiz paterni, inflamasyon ve hücre bölünmesindeki spesifik bölgesel değişiklikleri analiz etmek için kullanılır. Hem DAPI hem de Ly-6G boyama, ekstravasküler nötrofilleri tanımlamak için kullanılır. DAPI boyama ile, küresel nötrofiller farklı bir at nalı veya çörek şeklinde çekirdeğe sahiptir (Şekil 2B).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig02.jpg"> Şekil 2: Kornea görüntüleme stratejisi ve merkezi aşınma sonrası nötrofil infiltrasyonu . (A) Kornea çapı boyunca dokuz mikroskobik alan gösteren bir kornea bütününün şematik gösterimi. Gri alan orijinal yara alanını temsil eder. Her bölgenin genişliği 500 μm'dir. (B) DAPI boyaması ile nötrofil çekirdeklerinin farklı at nalı veya çörek şeklini not edin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63112/63112fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Bu yöntem makalesinin amacı, bir trefin ve künt bir golf sopası tükürüğü kullanarak farede merkezi bir kornea epitelyal aşınma yarası oluşturmak için bir protokolü tanımlamaktı. Bu murin modeli, kornea iltihabını ve yara iyileşmesine katkısını incelemek için kullanılmıştır. Bu tip bir model, normal fizyolojik koşullar altında vepatolojilerde kornea yarası iyileşme mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir 17,28,29,41,42.<sup...

Kornea gözün üçte birinin saydam ön kısmıdır. Kornea gözün iç yapılarını korumak ve gözü enfeksiyonlara karşı koruyan yapısal bir bariyer oluşturmak da dahil olmak üzere çeşitli işlevlere hizmet eder1. Daha da önemlisi, kornea görme için kritik öneme sahiptir ve gözün kırılma gücünün yaklaşık üçte ikisini sağlar 2,3. Korneanın vizyondaki rolü için çok önemli olan şey şeffaflığıdır. Bununla birlikte, dışa doğru pozisyonu nedeniyle, kornea günlük olarak bariyer fonksiyonunun bozulmasına, şeffaflık kaybına ve nihai körlüğe yol açabilecek çok çeşitli yaralanmalara maruz kalmaktadır. Kornea saydamlık kaybı tüm dünyada görme bozukluğunun önde gelen nedenlerinden biridir 4,5. Kornea sıyrıkları, acil servise (ER) yapılan ziyaretlerin yaygın bir nedenidir ve ER6'da sunulan gözle ilgili vakaların yarısını oluşturur. Amerika Birleşik Devletleri'nde yılda 1 milyondan fazla kişinin gözle ilgili yaralanmalardan muzdarip olduğu tahmin edilmektedir7. Bu yaralanmalara yanıt olarak etkili kornea yarasının iyileşmesi, kornea homeostazının korunması, şeffaflığının ve kırma yeteneklerinin korunması için çok önemlidir. Tehlikeye giren kornea yarasının iyileşmesi durumunda, kornea enfeksiyonlara, ülserasyonlara ve yara izlerine karşı savunmasız hale gelir 8,9. Ayrıca, refraktif ameliyatların artan popülaritesi, kornea10'a benzersiz bir travmatik zorluk getirmektedir. Kornea yaralanması iyileşmesinin kornea şeffaflığının ve görmenin korunmasındaki temel önemi göz önüne alındığında, normal kornea yarası iyileşme sürecinin daha iyi anlaşılması, enfeksiyon ve hastalıkla ilişkili bozulmuş kornea yarasının iyileşmesini anlamak için bir ön koşuldur.
Bu amaçla, kornea yara iyileşmesinin çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir11,12,13,14,15. Kornea yarasının iyileşmesinin murin modellerinin, normal fizyolojik koşullar altında çalışan kornea yarası iyileşme mekanizmalarını anlamamızı sağlamada yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Kornea yarasının iyileşmesini incelemek için her biri yara iyileşme sürecinin farklı yönlerini araştırmak için uygun olan farklı kornea yaraları türleri kullanılmıştır. Kornea yara iyileşmesi çalışmalarında kullanılan en yaygın yara modeli tipleri mekanik ve kimyasal yara modelleridir. Çoğunlukla korneada alkali yanıkların oluşumunu içeren kimyasal kornea yaraları, kornea ülserlerini, opaklaşmayı ve neovaskülarizasyonu incelemek için yararlıdır13. Mekanik kornea yaraları debridman (aşınma) yaralarını ve keratektomi yaralarını içerir14,15,16. Sağlam veya kırılmış kornea epitel bazal membranı sırasıyla debridman ve keratektomi yaralarını tanımlar. Debridman yaralarında epitel bazal membranı sağlam kalırken, keratektomi yaralarında çoğunlukla anterior stromaya penetrasyon ile bazal membran kırılır. Debridman yaraları, kornea yaralanmasını takiben yeniden epitelizasyon, epitel hücre proliferasyonu, immün yanıt ve sinir rejenerasyonunu incelemek için en yararlı olanlardır. Keratektomi yaraları ise kornea skarlaşmasının incelenmesinde en yararlı olanıdır14,15.
Burada, bir trefin ve künt bir golf kulübü spud kullanarak farede merkezi bir kornea epitelyal aşınma yarası oluşturmak için bir protokol açıklanmaktadır. Bu basit kornea yara iyileşmesi modeli oldukça tekrarlanabilir ve iyi yayınlanmıştır ve şimdi hastalık bağlamında tehlikeye atılmış kornea yara iyileşmesini değerlendirmek için kullanılmaktadır17.

<table><tbody><tr><td>Anti-CD31 antikoru</td><td>BD Bioscience, Pharmingen</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD41 antikoru</td><td>BD Bioscience, Pharmingen</td><td>553847</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G antikoru</td><td>BD Bioscience, Pharmingen</td><td>551459</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>B14</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 fareler</td><td>Jackson Laboratuvarları</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision geniş alan evrişim floresan mikroskobu</td><td>GE Yaşam Bilimleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektronik Üstten Yüklemeli Teraziler (Tartı)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>T038181000CS</td><td></td></tr><tr><td>Golf sopası spud,</td><td>Stephens aletleri</td><td>S2-1135</td><td></td></tr>, <tr><td>İris eğrisi makası</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>31212</td><td></td></tr>, <tr><td>İzofluran,</td><td>Patterson veteriner</td>, <td>07-893-1389</td><td></td></tr>, <tr><td>Ketamin</td>, <td>Patterson, veteriner</td>, <td>07-890-8598</td><td></td></tr>, <tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS),</td> <td>ThermoFisher, bilimsel</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum floresein tuzu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46970</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi bıçak (scapel bıçağı)</td><td>Güzel Bilim araçları</td><td>10022-00</td><td></td></tr><tr><td>Trephine</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31</td><td></td></tr><tr><td>TritonX -100</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-295-34</td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>Güzel Bilim araçları</td><td>11923-13</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Patterson veteriner</td><td>07-808-1947</td><td></td></tr></tbody></table>

kornea yara İyileşmesini İncelemek İçin epitelyal aşınma modeli

An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

Kornea görme için kritik öneme sahiptir ve gözün kırılma gücünün yaklaşık üçte ikisini oluşturur. Korneanın vizyondaki rolü için çok önemli olan şey şeffaflığıdır. Bununla birlikte, dış pozisyonu nedeniyle, kornea, kornea şeffaflığının kaybına ve nihai körlüğe yol açabilecek çok çeşitli yaralanmalara karşı oldukça hassastır. Bu yaralanmalara yanıt olarak etkili kornea yarasının iyileşmesi, kornea homeostazının korunmasında ve kornea saydamlığının ve kırma yeteneklerinin korunmasında çok önemlidir. Tehlikeye giren kornea yarası iyileşmesi durumunda, kornea enfeksiyonlara, ülserasyonlara ve yara izlerine karşı savunmasız hale gelir. Kornea yaralanması iyileşmesinin kornea şeffaflığının ve görmenin korunmasındaki temel önemi göz önüne alındığında, normal kornea yarası iyileşme sürecinin daha iyi anlaşılması, enfeksiyon ve hastalıkla ilişkili bozulmuş kornea yarasının iyileşmesini anlamak için bir ön koşuldur. Bu amaç doğrultusunda, kornea yaralanmasının murin modellerinin, normal fizyolojik koşullar altında çalışan kornea yarası iyileşme mekanizmalarını daha iyi anlamamızda yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Burada, bir trefin ve künt bir golf kulübü spud kullanarak farede merkezi bir kornea epitel aşınması oluşturmak için bir protokol açıklanmaktadır. Bu modelde, yara bölgesini ayırmak için kornea üzerinde ortalanmış 2 mm çapında dairesel bir trefin kullanılır. Golf sıçrayışı, epiteli debride etmek ve kornea epitel bazal membranına zarar vermeden dairesel bir yara oluşturmak için özenle kullanılır. Ortaya çıkan enflamatuar yanıt, etkili yara iyileşmesi için kritik olan iyi karakterize edilmiş hücresel ve moleküler olayların bir kaskadı olarak ilerler. Bu basit kornea yara iyileşmesi modeli oldukça tekrarlanabilir ve iyi yayınlanmıştır ve şimdi hastalık bağlamında tehlikeye atılmış kornea yara iyileşmesini değerlendirmek için kullanılmaktadır.

Şekil 3 , künt golf sopası spud'u ile oluşturulan bir kornea yarasının iletim elektron mikrografını göstererek, epitel bazal membranının yaralanmadan sonra gerçekten sağlam olduğunu göstermektedir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig03.jpg"> Şekil 3: Epitelyal bazal membran kornea aşınmasından sonra bozulmadan kalır. Künt golf sopası spud'u ile...

Burada, bir trefin ve künt bir golf kulübü spud kullanarak farede merkezi bir kornea epitelyal aşınma yarası oluşturmak için bir protokol açıklanmaktadır. Bu kornea yara iyileşmesi modeli yüksek oranda tekrarlanabilir ve şimdi hastalıklar bağlamında tehlikeye atılmış kornea yara iyileşmesini değerlendirmek için kullanılmaktadır.

Kornea Yara İyileşmesini İncelemek İçin Epitelyal Aşınma Modeli

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...

Bu protokol önemlidir, çünkü kornea iltihabını ve normal ve patolojik koşullar altında yara iyileşmesine katkısını incelemek için mükemmel bir modeldir. Bu tekniğin temel avantajı, bazal membranı ihlal etmeden hassas ve tekrarlanabilir bir epitel yarası oluşturmasıdır. Bu kornea yaralama modeli basit ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilir.Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan doktora öğrencisi olan Prens Akowuah olacak. Başlamak için, bir mililitre steril salin veya PBS içinde 10 miligram sodyum floresein tuzu çözerek% 1'lik bir floresein çözeltisi hazırlayın. Daha sonra, anestezi için, iki mililitre ketamin, bir mililitre ksilazin ve yedi mililitre steril PBS karıştırarak 10 mililitre ketamin-ksilazin kokteyli hazırlayın.8-12 haftalık C57 siyah 6 vahşi tip fareyi uyuşturduktan sonra, ayak parmağını sıkıştırdıktan sonra pedal refleksini değerlendirerek anestezi derinliğini değerlendirin. Epitel kornea yarası oluşturmak için, anestezi uygulanan fareyi diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Sadece sağ veya sol gözü sarın ve fareden fareye geçerken yaralanan gözle tutarlılığı koruyun.Göz kapaklarını başparmak ve işaret parmağı ile tutarak gözü tamamen açık tutun. Daha sonra, iki milimetre çapında steril bir trefin kullanarak, korneanın merkezini sınırlayın ve kornea epiteli üzerinde bir izlenim bırakmak için trefin'i yavaşça döndürün. Aşırı basınç uygulamayın, çünkü bu kornea perforasyonuna neden olabilir.Daha sonra, steril künt golf sopası püskürtülmesini kornea yüzeyinden yaklaşık 45 derecelik bir açıyla tutarak, spud'u kullanarak sınırlandırılmış alanda dikkatli ve sürekli kazıma ile epiteli debride debride edin. Aşırı kuvvet uygulamayın ve gerekirse steril PBS kullanarak hidrasyon sağlayın. Yara kapanmasını ve yeniden epitelizasyonu izlemek için, yaralı yüzeye 1 ila 1,5 mikrolitre% 1 floresein çözeltisi pipet yerleştirin ve mavi ışık kaynağına sahip dijital bir mikroskop kullanarak korneayı görüntüler.Yaralı korneayı yaraladıktan sonra belirli zamanlarda görüntüleyin. Çözeltinin çevredeki epitele yayılmasını önlemek için floresan çözeltisinin ilk dakikasında görüntü alın, bu da yara boyutunun abartılmasına neden olabilir. Daha sonra, bir görüntü analiz yazılımı kullanarak, yara alanını izleyin ve her zaman noktasında yara alanını, sıfır saatte orijinal yara alanının bir yüzdesi olarak ifade edin.Kornea yarasının iletim elektron mikrografisi, epitel bazal membranının yaralanmadan sonra bile bozulmadan kaldığını göstermektedir. 8 ila 12 haftalık vahşi tip farelerde, yara kapanması yaralanmadan 24 saat sonra tamamlanır. Yaralanmaya inflamatuar yanıt, limbusta hücre görüntüleme ile karakterizedir.Burada ekstravasküler nötrofillere sahip yaralanmamış bir korneanın limbal vaskülatürü ve aşınmadan 30 saat sonra ekstravasküler trombositler ve nötrofiller ile yaralı bir korneanın vaskülatürü gösterilmektedir. Bu protokolü başarılı bir şekilde yeniden üretmek için, her fare aralığında aynı gerinim kullanılmalı ve yara boyutu ve derinliği açıklandığı gibi oluşturulmalıdır.

an-epithelial-abrasion-model-for-studying-corneal-wound-healing

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Burada açıklanan, epitel dokularının doğal mikro çevreleri içindeki yaralanma tepkisinin mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilecek klinik olarak anlamlı bir ex vivo sahte katarakt cerrahisi modelinin oluşturulmasıdır.

Bir Klinik İlgili kurulması<em&gt; Ex Vivo</emYerli mikroçevresinin Epitelyal Yara Tamir incelenmesi için&gt; Mock Katarakt Cerrahisi Modeli

Bu iletişim kuralı oküler yüzey için bir aşınma fare indirebilmek için ve yara iyileşme süreci bundan sonra izlenecek yöntemi açıklanır. Protokol kısmen göz yüzey epitel anaesthetized farelerde kaldırmak için oküler bir burr yararlanır.

Kornea epitel aşınma oküler Burr ile bir Model olarak kornea için yara iyileşme

Eski bir protokol vivo kornea organ kültür model çalışmaları şifa yara açıklanan için yararlı. Bu modeli sistem rejeneratif iyileşmesine katkıda bulunmak üzere ajanlar veya ilaç toksisitesi organize 3D çok hücreli ortamında etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.

Ex vivo kornea Organ kültür modeli için yaranın çalışmaları

Burada, kornea epitelinin mekanik ve kimyasal hasarı için fare ve tavşana dayalı hayvan modelleri, yeni terapötikleri ve altta yatan mekanizmayı taramak için geliştirilmiştir.

Kornea Epitelinin Mekanik ve Kimyasal Yaralanmaları için Ex Vivo ve In Vivo Hayvan Modelleri

Mevcut protokol, ovo'daki embriyonik bir civcivin korneasının yaralanmasında yer alan farklı adımları göstermektedir. Rejenere veya tamamen restore edilmiş kornealar, yaralama prosedürünü takiben çeşitli hücresel ve moleküler teknikler kullanılarak rejeneratif potansiyel açısından analiz edilebilir.

Embriyonik Yaralı Civciv Kornealarında İzsiz Doku Rejenerasyonunun İncelenmesi

Bu protokol, hücresel düzeyde sonraki yara kapanmasını değerlendirmek için zebra balıklarının oküler yüzeyine aşınma yoluyla zarar vermeye odaklanır. Bu yaklaşım, kornea epitelini kısmen çıkarmak için bir oküler çapaktan yararlanır ve yara kapanması sırasında hücre morfolojisindeki değişiklikleri izlemek için taramalı elektron mikroskobu kullanır.

Zebra Balığı Kornea Yara İyileşmesi: Aşınmadan Yara Kapatma Görüntüleme Analizine

Burada, korneayı innerve eden duyu liflerine zarar vermek için üç farklı yöntem öneriyoruz. Bu yöntemler, farelerde akson rejenerasyonunun incelenmesini kolaylaştırır. Diğer hayvan modellerine uyarlanabilen bu üç yöntem, kornea innervasyon fizyolojisi ve rejenerasyonunun incelenmesi için idealdir.

Murin Korneasında Nörotrofik Keratit ve Sinir Rejenerasyonunu İndüklemek için Üç Strateji

Kornea sütürleri ile birlikte kornea epitel küretajı yoluyla şiddetli kornea iltihabının bir sıçan modeli geliştirdik. Çalışma, enflamatuar koşullar altında kornea iltihabı paternlerini, epitel proliferasyonunu ve limbal kök hücrelerdeki değişiklikleri değerlendirdi.

Kornea Sütürleri ile Kombine Kornea Epitel Küretajına Dayalı Sıçanlarda Şiddetli Kornea İnflamasyonu Modelinin Oluşturulması

Biz santral arter ve sinir ve beyin nörovasküler demet bölerek bir tavşan kulağı iskemik yara modeli oluşturmak için minimal invaziv bir teknik geliştirdik. Bir subkutan tünel sonra tüm cilt altı dokuları keser. Bu prosedür, minimal deri bozulmasına neden olmakta ve güvenli bir şekilde, diyabetik hayvanlarda kullanılabilir.

Bir İskemik Yara Model üretmek için Basitleştirilmiş Tekniği

Fizyolojik ve patofizyolojik ortamlarda terapötik bileşiklerini değerlendirmek için de kullanılabilir deri yara iyileşmesinin Bir murin modeli.

Yara Şifa murin Modeli

Öğrenin farelerde kornea epitel aşınması yara modeli oluşturmayı. Bu yöntem, trephine ve künt spud kullanarak tekrarlanabilir yaralar oluşturur ve kornea iyileşmesi ile inflamasyonu incelemek için değerlidir.

Kornea Yara İyileşmesini İncelemek İçin Epitelyal Aşınma Modeli

Daha fazla video keşfet