Name: İmmobilize Tropomiyozin Kinaz Reseptörü B ile Etkileşime Giren Özel Bitki Metabolitlerini Tanımlamak için Hücresel Membran Afinite Kromatografisi Sütunları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Keşfedin hücresel membran afinite kromatografisi sütunları hazırlama yöntemini, immobilize TrkB reseptörleriyle etkileşen bitki metabolitlerini tanımlamak için. Bu teknik, karmaşık doğal ekstrelerdeki biyolojik olarak aktif bileşiklerin hızlı tespitini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z.C.A., Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu (TÜBİTAK) 2219- Uluslararası Doktora Sonrası Araştırma Burs Programı tarafından desteklenmiştir. Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Ücretsiz ve Bütünleştirici Tıp Merkezi tarafından 1R41AT011716-01 ödül numarası altında desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda Amerikan Farmakognozi Araştırma Başlangıç Hibesi Derneği, Regis Technologies tarafından L.C.'ye hibe olarak kısmen desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

1. SH-SY5Y nöroblastom hücrelerinin hücre kültürü (TrkB ve TrkB-NULL (ebeveyn) hücre hatları)
NOT: Kerafast'tan hücre hatları (SH-SY5Y Hücre Hattı (TrkB, BR6) ve SH-SY5Y Ebeveyn Hücre Hattı (TrkB NULL))49,50 adet satın alınmıştır. Kültürlenmiş hücreler, CMAC kolonlarının hazırlanmasında immobilize edilecek transmembran reseptörlerinin kaynağı olarak kullanılır. Aşağıdaki adımlarda, hücre zarı parçalarının nasıl elde edileceği ve işlevsel CMAC sütunlarının nasıl birleştirileceği açıklanmaktadır.
<ol><li>450 mL RPMI ortamı, 50 mL FBS, 5 mL penisilin / streptomisin çözeltisi ve 0.3 mg / mL genetikin (G418) karıştırılarak hazırlanan bir hücre kültürü ortamındaki hücreleri, nemli bir atmosferde 37 ° C'de 150 mm'lik bir hücre kültürü kabında% 5 CO2 ile büyütün.</li>
</ol>2. Hücre hasadı
<ol><li>Hücre geçişinden 3-4 gün sonra ulaşılan bir mikroskop kullanarak hücre akıcılığını (% 80-90) onaylayın.</li>
	<li>Hücre kültürü ortamını hücrelerin üstünden aspire edin ve hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS, 1x, pH 7.4) ile iki kez yıkayın. PBS'yi çıkarın ve hücreleri ayırmak için 2 mL düşük konsantre tripsin (% 0.25) ekleyin.</li>
	<li>Tüm hücreleri tripsin çözeltisi ile eşit şekilde örtmek için plakayı yavaşça döndürün ve hücreleri% 5 CO 2 ile nemli bir atmosferde 37 ° C'de yaklaşık2 dakika boyunca inkübe edin. Ayrılan hücrelere 8 mL hücre kültürü ortamı ekleyin ve ayrılmış hücreleri 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve buzun üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Hücre sayısını tahmin etmek için bir hemositometre kullanın (yaklaşık 3 x 107 hücre). Karışımda eşit hücre yoğunluğu elde etmek için yukarı ve aşağı pipetle pipetleyerek hücre süspansiyonunu karıştırın. Kapak kapağının altına 10 μL hücre süspansiyonu yerleştirin ve hücreleri 40x hedefi kullanarak mikroskop altında sayın.</li>
</ol>3. Hücre homojenizasyonu
<ol><li>Aşağıdaki proteaz inhibitörlerinin stok çözeltilerini hazırlayın: benzamidin (200 mM), fenilmetilsülfonil florür (PMSF, 10 mM) ve 4-(2-Aminoetil) benzensülfonil florür hidroklorür (AEBSF), aprotinin, bestatin ve löpeptin içeren ticari olarak temin edilebilen proteaz inhibitörleri kokteyli (100x konsantrasyon). DİKKAT: PMSF sadece duman davlumbazının içinde kullanılmalıdır.<ol>
<li>120 mg benzamidini 5 mL ultra saf deiyonize suda çözerek benzamidin stok çözeltisi (200 mM) hazırlayın. 4 ° C'de saklayın ve bir gün içinde kullanın. Her kullanımdan önce taze bir çözelti hazırlayın (önerilir).</li>
		<li>10 mL etanol içinde 0,017 g PMSF'yi çözerek PMSF stok çözeltisini (10 mM) hazırlayın. - 20 °C'de saklayın.</li>
		<li>Ticari olarak temin edilebilen proteaz inhibitörü karışımını 1 mL ultra saf deiyonize suda çözerek proteaz inhibitörü kokteyli (100x) hazırlayın. İyice karıştırın ve kokteylin 200-300 μL'sini alın ve kullanmadan önce - 20 ° C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>55.114 mg ATP disodyum tuzu hidratını 1 mL deiyonize ultra saf suda çözerek ATP stok çözeltisini (100 mM) hazırlayın. İyice karıştırın ve karışımın 100 μL'sini alın ve kullanmadan önce - 20 ° C'de saklayın.</li>
	<li>3.03 g tris (hidroksimetil) aminometan hidroklorür (Tris-HCl, 50 mM), 2.9 g sodyum klorür (NaCl, 100 mM), 0.22 g kalsiyum klorür susuz (CaCl 2, 3 mM), 0.2 g magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl2,2 mM) ve 0.19 potasyum klorür (KCl, 5 mM) 500 mL ultra saf deiyonize suda çözerek tampon hazırlayın.</li>
	<li>Adım 3.3'te hazırlanan tamponun 17,3 mL'sini 0,3 mL (3 mM) benzamidin stok çözeltisi, 0,2 mL (0,1 mM) PMSF stok çözeltisi, 0,2 mL proteaz inhibitörü kokteyl karışımı, 20 μL (100 μM) ATP stok çözeltisi, 2 mL (%10) gliserol ve 0,029 g (5mM) EDTA ile karıştırarak homojenizasyon tamponunu hazırlayın (Tablo 1). Hidroklorik asit çözeltisi kullanarak pH'ı 7.4'e ayarlayın.</li>
	<li>Adım 2.3'te 4 ° C'de toplanan hücreleri 400 x g'de 5 dakika boyunca döndürün. Süpernatantı çıkarın ve kalan hücre peletini 10 mL buz gibi soğuk PBS (1x, pH 7.4) ile yıkayın. Hücreleri 400 x g'da 5 dakika boyunca 4 ° C'de tekrar döndürün.</li>
	<li>Süpernatantı atın ve adım 3.4'te hazırlanan 20 mL homojenizasyon tamponu ile değiştirin. Konik tüpü buzun üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 40 mL Dounce homojenizatör doku öğütücüye aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Süspansiyonu manuel olarak, buz üzerinde, 40 yukarı ve aşağı havane darbesi kullanarak homojenize edin. Homojenize hücre süspansiyonunu 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Homojenatı 4 °C'de 400 x g'de 7 dakika boyunca santrifüj yapın. Peleti atın ve süpernatantı yeni bir konik tüpe aktarın ve 47900 x g'de 30 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj yapın. Hücre zarı peletini kaydedin ve süpernatanı atın.</li>
</ol>4. Hücre zarı çözünürlüğü
<ol><li>Adım 3.3'te yapılan tampon çözeltisinin 8.7 mL'sini 0.1 mL (0.1 mM) PMSF stok çözeltisi, 0.15 mL (3 mM) benzamidin stok çözeltisi, 0.1 mL proteaz inhibitörü kokteyli, 10 μL (100 μM) ATP stok çözeltisi, 1 mL (% 10) gliserol ve 0.2 g (% 2) sodyum kolat ile karıştırarak çözündürme tamponunu hazırlayın (Tablo 2).</li>
	<li>Çözündürme tamponunu, adım 3.8'de elde edilen hücre zarı parçaları ile konik tüpe aktarın ve peleti yeniden askıya alın. Elde edilen karışımı 18 saat boyunca 4 °C'de 150 rpm'de döndürün. NOT: Bu noktada, deney bir gecede hücre zarı pelet çözünürlüğü için duraklatılabilir.</li>
</ol>5. IAM'de hücre zarı immobilizasyonu. Kişisel bilgisayar. DD2 parçacıkları
<ol><li>18 saat sonra, çözünürleştirme karışımını 4 ° C'de 47900 x g'de 30 dakika boyunca santrifüj edin.</li>
	<li>Süpernatantı saklayın ve peleti atın. 100 mg IAM ekleyin. Kişisel bilgisayar. DD2 parçacıkları, süpernatan, vortekse ve elde edilen süspansiyon karışımını 1 saat boyunca 4 °C'de 150 rpm'de döndürün.</li>
	<li>IAM üzerindeki hücre zarı parçalarının immobilizasyonunu kolaylaştırmak. Kişisel bilgisayar. DD2 parçacıkları aşağıda özetlendiği gibi diyaliz adımına ilerler.<ol>
<li>24 g tris-HCl (50 mM), 23,4 g NaCl (100 mM), 0,06 g CaCl 2 (0,1 mM), 5,85 g EDTA (5 mM) ve 0,07 g PMSF( 0,1 mM; Tablo 3). NOT: PMSF suda çözünmez, bu nedenle önce küçük hacimli etanol içinde çözün ve daha sonra tamponla beherin içine yavaşça ekleyin.</li>
		<li>Hidroklorik asit çözeltisi ile pH'ı 7.4'e ayarlayın. Diyaliz adımına geçmeden önce tamponu en az 1 saat boyunca 4 °C'ye yerleştirin.</li>
		<li>10 cm selüloz membran diyaliz tüpünü (10 K MWCO, 35 mm) keserek diyaliz tüpü hazırlayın ve IAM içeren süspansiyonu aktarın. Kişisel bilgisayar. DD2 parçacıkları ve hücre zarı parçaları diyaliz tüpüne girer. Diyaliz tüpünün her iki ucunu kapatmak için diyaliz tüp klipslerini kullanın.</li>
		<li>IAM'yi içeren diyaliz tüpünü yerleştirin. Kişisel bilgisayar. Diyaliz tamponunda DD2 sabit faz ve hafifçe karıştırırken 24 saat boyunca 4 ° C'de diyaliz.</li>
		<li>24 saat sonra, diyaliz tüpünü taze hazırlanmış diyaliz tamponuna yerleştirin ve 24 saat daha diyalize devam edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. CMAC sütun ambalajı
<ol><li>IAM'yi yıkamak için kullanılacak amonyum asetat tamponunu (10 mM, pH 7.4) hazırlayın. Kişisel bilgisayar. DD2 partikülleri ve kolon karakterizasyon deneylerinde 0.7708 g amonyum asetat 1 L ultra saf deiyonize suda çözülür. Hidroklorik asit çözeltisi ile pH'ı 7.4'e ayarlayın.</li>
	<li>48 saatlik diyalizden sonra, diyaliz tüpünü diyaliz tamponundan çıkarın ve diyaliz tüpünün içeriğini 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.</li>
	<li>Karışımı 4 ° C'de 400 x g'da 5 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı atın ve kalan peleti 10 mL amonyum asetat tamponu ile üç kez yıkayın, her yıkamadan sonra karışımı 400 x g'da 5 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj edin.</li>
	<li>Üçüncü yıkamadan sonra, kalan peleti 1 mL amonyum asetat tamponunda yeniden askıya alın. İyice karıştırın ve CMAC kromatografi sütunu elde etmek için 5/20 cam sütunu paketlemek için elde edilen bulamacı kullanın.</li>
	<li>Sütunu paketlemek için, önce daha önce amonyum asetat tamponu ile ıslatılmış bir alt filtreyi filtre tutucuya yerleştirin. Filtre tutucuyu cam kolona takın ve tutucunun konumunu sabitlemek için kolon kapağını vidalayın. Kolonu dikey olarak bir parmak kelepçesine yerleştirin ve laboratuvar standına sabitleyin. Kolonun altına bir beher yerleştirin.</li>
	<li>Tek kanallı pipetleyici kullanarak, adım 6.4'te elde edilen bulamacın küçük bir hacmini cam kolona aktarın. Pipet ucunu cam sütun duvarına karşı tutarak malzemeyi yavaşça dökün. Başka bir bulamaç hacmi dökmeden önce ambalaj malzemesinin yerleşmesine izin verin.</li>
	<li>Paketleme işlemini hızlandırmak için, her adım arasında bir mikropipet kullanarak tamponu sabit yatağın üstünden çıkarın. Bulamacın 1 mL'si paketlenene kadar bu adımları tekrarlayın.</li>
	<li>Bir üst filtre yerleştirin ve adaptör ünitesini, Şekil 1'de gösterildiği gibi sabit fazın üzerinde kalan tampon kalmayacak şekilde vidalayın. Adaptör ünitesinin konumunu adaptör kilidi ile sabitleyin.</li>
	<li>Kolonu yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi (HPLC) pompasına bağlayın, akış hızını 0,2 mL/dk'ya ayarlayın ve kolonları gece boyunca amonyum asetat tamponuyla yıkayın. Sütun artık karakterizasyon adımı için hazırdır. Kolonu, kullanana kadar 4 °C'de saklayın. NOT: Daha uzun süre depolama için (bir haftadan uzun süre kullanılmayan sütun) kolonu, amonyum asetat tamponunda% 0,05 sodyum azid çözeltisi ile çalıştırın ve 4 ° C'de saklayın. DİKKAT: Sodyum azid, ağızdan alındığında veya cilt yoluyla emildiğinde oldukça toksiktir; sadece duman başlığının altında kullanılmalıdır. Sodyum azid ile çalışırken laboratuvar önlüğü, güvenlik gözlükleri ve eldivenler (nitril tercih edilir) giydiğinizden emin olun.</li>
</ol>7. CMAC sütun karakterizasyonu
<ol><li>Konfokal mikroskopi ve BDNF bağlama<ol>
<li>IAM'yi hazırlayın. Pcc. Adım 1'den adım 6.4'e kadar olan talimatları izleyerek TrkB ve SH-SY5Y TrkB-NULL hücrelerini aşırı eksprese eden SH-SY5Y nöroblastom hücrelerinden ayrı olarak elde edilen immobilize hücre zarı fragmanlarına sahip DD2 sabit faz parçacıkları.</li>
		<li>Antikor boyamadan önce BDNF ile inkübe edilecek numuneler için, 10 μg BDNF'yi 100 μL ultra saf deiyonize suda çözerek BDNF stok çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi -20 °C'de saklayın.<ol>
<li>Ayrı 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde transfer, 100 μL IAM aliquot. Kişisel bilgisayar. TrkB'yi aşırı eksprese eden immobilize SH-SY5Y Nöroblastom hücreleri ve IAM'nin 100 μL aliquot'u ile DD2 kolon ambalaj malzemesi. Kişisel bilgisayar. Amonyum asetat tamponunda asılı duran immobilize SH-SY5Y TrkB-NULL hücreli DD2 kolonlu ambalaj malzemesi.</li>
			<li>Her tüpe 390 μL amonyum asetat tamponu, 10 μL BDNF stok çözeltisi ve 0,5 μL ATP stok çözeltisi (adım 3.2'de hazırlanan) ekleyin ve sallanarak oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Antikor boyamadan önce BDNF ile inkübe edilmeyecek örnekler için, 100 μL IAM aliquot aktarın. Kişisel bilgisayar. Amonyum asetat içinde 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine asılı TrkB'yi aşırı eksprese eden immobilize SH-SY5Y Nöroblastom hücrelerine sahip DD2 kolon ambalaj malzemesi.</li>
		<li>Her tüpe 400 μL amonyum asetat tamponu ve 0,5 μL ATP stok çözeltisi (adım 3.2'de hazırlanmış) ekleyin ve sallanarak oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.</li>
		<li>Adım 7.1.2 ve 7.1.4'te hazırlanan numuneleri 4 ° C'de 10.000 x g'de 1 dakika boyunca döndürün ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Elde edilen peletleri 10 dakika boyunca 500 μL amonyum asetat tamponu ile yıkayın ve 10.000 x g'da 1 dakika boyunca 4 ° C'de tekrar döndürün ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Peletlerin her birine, 220 μL amonyum asetat tamponu,% 10 normal keçi serumunun 25 μL'si ve 5 μL primer anti-BDNF antikoru ekleyin. Sallanarak gece boyunca soğuk bir odada (4 ° C) inkübe edin.</li>
		<li>Kuluçka adımının tamamlanmasının ardından, karışımı 4 ° C'de 10.000 x g'de 1 dakika boyunca döndürün ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Elde edilen peleti, 10 dakika boyunca% 1 hafif deterjan (örneğin, sodyum kolat) içeren amonyum asetat tamponu ile 3 kez yıkayın ve karışımları 4 ° C'de 10.000 x g'de 1 dakika boyunca döndürün ve süpernatanı atın.</li>
		<li>900 μL amonyum asetat tamponu, 100 μL% 10 normal keçi serumu ve 1 μL florofor konjuge sekonjuge sekonder antikoru (1:1.000 seyreltme) karıştırarak ikincil antikor çözeltisi hazırlayın. Adım 7.1.9'da elde edilen peletlerin her birine 300 μL ikincil antikor çözeltisi ekleyin. ve sallanarak gece boyunca 4 ° C'de kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Karışımı 4 ° C'de 1 dakika boyunca 10.000 x g'de döndürün ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Elde edilen peleti, 10 dakika boyunca% 1 hafif deterjan (örneğin, sodyum kolat) içeren amonyum asetat tamponu ile 3 kez yıkayın ve karışımı 4 ° C'de 10.000 x g'de 1 dakika boyunca döndürün ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Elde edilen peletleri 50 μL amonyum asetat tamponunda yeniden askıya alın. Karışımların her birinin 20 μL'sini bir slayt üzerine yerleştirin ve bir kapak kayması ile örtün.</li>
		<li>IAM'yi görüntüleyin. Kişisel bilgisayar. Hareketsiz hücre zarı parçacıkları ile DD2 parçacıkları, katı hal lazer sistemi kullanılarak üretilen 488 nm'de uyarma ve 520 nm'de emisyon ile konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak parçalanır. NA değeri 0,75 ve WD'si 0,35 mm olan 20x hedefi kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>İşaretleyici ligand olarak 7,8-DHF kullanan frontal afinite kromatografisi<ol>
<li>Bir CMAC sütununu bir diyot dizisi dedektörü ve/veya kütle spektrometresi ile bir HPLC sistemine bağlayın.</li>
		<li>% 5 metanol içeren amonyum asetat tamponunda 500 mL 1 mM 7,8-DHF çözeltisi hazırlayın.</li>
		<li>İşaretleyici ligandının (1 mM) sabit konsantrasyonunu CMAC sütunu boyunca oda sıcaklığında 0,4 mL/dak akış hızında pompalayın. Bir diyot dizisi algılama (DAD) (dalga boyu 254 nm) dedektörü veya kütle spektrometresi kullanarak elüsyon profilini izleyin (tek iyon izleme modunu kullanın; negatif iyonizasyon modunda m / z 253).</li>
		<li>Çalıştırma tamamlandıktan sonra kolon boyunca amonyum asetat tamponu çalıştırılarak gece boyunca yıkama gerçekleştirin.</li>
		<li>7.2.2 numaralı adımları yineleyin. - 7.2.4. işaretleyici ligandın farklı konsantrasyonlarını (750 nM, 500 nM, 300 nM) kullanarak, sütunları her çalıştırmadan sonra gece boyunca yıkayın. Başka bir yerde ayrıntılı olarak incelendiği gibi, ligand Kd'yi hesaplamak için frontal afinite kromatografisini kullanın. 24,51
</li>
	</ol></li>
	<li>Centella asiatica (L.) Urb ile yer değiştirme çalışmaları. (gotu kola) özü<ol>
<li>% 5 metanol ve% 0.2 sulu gotu kola ekstresi (10 mg / mL) içeren amonyum asetat tamponunda 500 mL 500 nM 7,8-DHF çözeltisi hazırlayın.</li>
		<li>İşaretleyici ligandının (500 nM) sabit konsantrasyonunu, ekstrakt ile kolon boyunca oda sıcaklığında 0,4 mL/dak akış hızında pompalayın. Bir DAD dedektörü (dalga boyu 254 nm) veya bir kütle spektrometresi kullanarak elüsyon profilini izleyin (tek iyon izleme modunu kullanın; negatif iyonizasyon modunda m / z 253).</li>
		<li>Çalıştırma tamamlandıktan sonra kolon boyunca amonyum asetat tamponu çalıştırılarak gece boyunca yıkama gerçekleştirin.</li>
		<li>500 nM 7,8-DHF için elüsyon profillerini ve işaretleyici ligand yer değiştirmesini incelemek için çözeltiyi gotu kola özü ile çalıştırdıktan sonra elde edilen profilleri çizin.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Gotukola ekstraktından potansiyel TrkB bağlayıcılarını tanımlamak için eksik pik kromatografi yaklaşımı
<ol><li>CMAC sütunlarında gotu kola ekstraktının fraksiyonasyonu<ol>
<li>CMAC TrkB ve TrkB-NULL sütunlarını ayrı ayrı bir HPLC sistemine bağlayın ve sütunların her birine 50 μL sulu gotu kola ekstraktı (10 mg / mL) enjekte edin. Oda sıcaklığında 0,4 mL/dak akış hızında kolon boyunca %5 metanol içeren pompa amonyum asetat tamponu (10 mM, pH 7,4).</li>
		<li>CMAC TrkB ve TrkB-NULL sütunlarından ayrı kesirleri aşağıdaki gibi toplayın: 0-5 dakika, 5-10 dakika, 10-15 dakika, 15-20 dakika, 20-25 dakika, 25-30 dakika, 30-35 dakika, 35-40 dakika, 40-45 dakika, 45-50 dakika, 50-55 dakika, 55-60 dakika.</li>
		<li>Elde edilen fraksiyonları dondurun ve liyofilize edin. Ultra performanslı sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi analizine geçmeden önce 50 μL metanofildeki liyofilize fraksiyonları yeniden askıya alın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ultra performanslı sıvı kromatografisi kuadrupol uçuş süresi kütle spektrometresi (UPLC-QTOF-MS) gotu kola CMAC fraksiyonlarının analizi<ol>
<li>Madde 8.1.3'te elde edilen tüm kesirleri analiz edin. bir UPLC sistemi ile birleştirilmiş bir kütle spektrometresi kullanarak (UPLC-MSE analiz modu). C18 VanGuard ön sütunu (2,1 mm x 5 mm, 1,7 μm) ile C18 sütunu (2,1 x 50 mm, 1,7 μm) kullanarak kesirleri analiz edin.</li>
		<li>Kolonu mobil faz A (% 0.1 formik asitli su) ve B (% 0.1 formik asitli asetonitril) ile 0.3 mL / dak akış hızında kullanarak kolonu: 0.0 dk% 99 A% 1 B, 1.5 dk% 84 A% 16 B, 5.0 dk% 80 A% 20 B, 7.0 dakika% 75 A% 25 B, 10.0 dk %65 A %35 B, 20.0-24.0 dk 1% A %99 B, 25.0-29.0 dk %99 A %1 B.</li>
		<li>Her numune için enjeksiyon hacmini 3 μL'ye ayarlayın. MSE'yi çözünürlük pozitif ve negatif iyon modlarında, çarpışma enerjisi düşük enerji için 4V'ta ve yüksek enerji için 20-35 V'ta gerçekleştirin.</li>
		<li>Pozitif iyonizasyon modunda aşağıdaki ESI kaynak koşullarını kullanın: kılcal gerilim 1,5 kV, numune alma konisi 40 V, kaynak ofseti 80, kaynak sıcaklığı 100 °C, çözünme sıcaklığı 350 °C, koni gazı akışı 38,0 L/s, çözünme gazı 400 L/s.</li>
		<li>Negatif iyonizasyon modunda aşağıdaki ESI kaynak koşullarını kullanın: kılcal gerilim 1,45 kV, numune alma konisi 40 V, kaynak ofseti 80, kaynak sıcaklığı 110 °C, çözünme sıcaklığı 300 °C, koni gazı akışı 50,0 L/s, çözünme gazı akışı 652 L/s.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Lukasz Ciesla, IAM'nin sağlayıcısı Regis Technologies ile işbirliği yapıyor. Kişisel bilgisayar. DD2 parçacıkları.

Özel metabolitlerin karmaşık karışımlarında bulunan aktif bileşiklerin tanımlanması çok zor bir görevdir23. Geleneksel olarak, bireysel bileşikler izole edilir ve aktiviteleri farklı tahlillerde test edilir. Bu yaklaşım zaman alıcı ve maliyetlidir ve genellikle en bol ve iyi karakterize edilen bileşiklerin izolasyonuna ve tanımlanmasına yol açar23. Şu anda kullanılan yüksek verimli tarama testleri, halihazırda bilinen hedeflere sahip kombinatoryal kimya kütüphanelerinin tar...

Botanik karışımlar, farmakolojik olarak aktif bileşikler1 bakımından zengindir ve yeni ilaç isabetlerinin tanımlanması için iyi bir kaynak görevi görür ve 2,3,4,5'e yol açar. Doğal ürünlerden yeni ilaçların keşfi verimli bir yaklaşım olmuştur ve şu anda onaylanmış birçok ilaç, ilk olarak doğada tanımlanan bileşiklerden kaynaklanmaktadır. Doğal bileşiklerin kimyasal çeşitliliğinin, kimyasal olarak sentezlenmiş moleküllerin insan yapımı kütüphaneleri ile eşleştirilmesi zordur. Birçok doğal bileşik, insan protein hedefleriyle etkileşime girer ve modüle eder ve evrimsel olarak optimize edilmiş ilaç benzeri moleküller olarak düşünülebilir6. Bu doğal bileşikler, nörolojik bozukluklarda kullanılmak üzere ilaç kurşun tanımlaması için özellikle uygundur6. Alzheimer hastalığının (AD) yönetimi için şu anda FDA onaylı ilaçlardan ikisi doğal alkaloitlerden türetilmiştir, yani: galantamin ve rivastigmin (fizikostigmin türevi)6. Şu anda Parkinson hastalığı için en sık reçete edilen ilaç olan L-DOPA, ilk olarak geniş fasulyeden (Vicia faba L.) tanımlanmıştır. 7. Pergolid ve lisürid, dopaminerjik reseptör agonistleri, parazitik mantar Claviceps purpurea8'den doğal ergot alkaloidlerinin türevleridir. Hint yılan kökünden izole edilmiş bir alkaloid olan Reserpin (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) ilk antipsikotik ilaçlardan biriydi9. Son zamanlarda, düzensiz immün yanıt ve sistemik inflamasyon, majör depresif bozukluk veya nörodejeneratif hastalıklar gibi çok sayıda nörolojik rahatsızlığın gelişimi ile ilişkilendirilmiştir10. Diğer yaşam tarzı müdahaleleriyle birlikte bitki bazlı bir diyetin yaşlılarda bilişsel ve işlevsel yetenekleri geliştirdiği bulunmuştur 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Triterpenlere ve polifenollere ait bazı elektrofilik moleküllerin hem in vitro hem de in vivo modellerde inflamatuar yanıtları modüle ettiği bulunmuştur12. Örneğin, α.β doymamış karbonil (örneğin, kurkumin, sinnamaldehit) veya izotiyosiyanat grubu (örneğin, sülforafan) içeren doğal bileşikler, murin interlökin-3 bağımlı pro-B hücre hattında pro-inflamatuar sitokinlerin aşağı akış sentezini inhibe eden Toll benzeri reseptör-4 (TLR4) dimerizasyonuna müdahale eder12,22 . Epidemiyolojik kanıtlar, karmaşık gıda matrislerinde bulunan diyet fitokimyasallarının da yeni ilaç kurşunlarının uygulanabilir bir kaynağını oluşturabileceğini güçlü bir şekilde göstermektedir6.
Bitki bazlı gıdalar da dahil olmak üzere bitki özlerinde bulunan biyolojik olarak aktif moleküllerin tanımlanmasındaki en büyük engellerden biri, araştırılan örneklerin karmaşıklığıdır. Geleneksel olarak, bireysel bileşikler izole edilir, saflaştırılır ve daha sonra biyolojik aktivite için test edilir. Bu yaklaşım genellikle en bol ve iyi karakterize edilen bileşiklerin tanımlanmasına yol açar. Tanımlanmış bir moleküler hedef olmadan fenotipik ilaç keşif yaklaşımları, karmaşık karışımların biyo-kılavuzlu fraksiyonasyonuna dayanır23. Bu yaklaşımda, bir ekstrakt, daha sonra fenotipik tahlillerde test edilen daha az karmaşık alt fraksiyonlara bölünür. Aktif bileşiklerin izolasyonu ve saflaştırılması, tahlilde doğrulanan biyolojik aktivite tarafından yönlendirilir. Belirli bir ilaç hedefinin kimliğinin bilinmesi, karmaşık karışımlarda bulunan farmakolojik olarak aktif bileşiklerin tanımlanmasını önemli ölçüde hızlandırabilir. Bu yaklaşımlar genellikle moleküler hedefin, örneğin bir enzimin, manyetik boncuklar gibi katı bir yüzeyde immobilizasyonuna dayanır23. Hareketsiz hedefler daha sonra tarama deneylerinde kullanılır ve hedef ile etkileşime giren bileşiklerin izolasyonu ile sonuçlanır. Bu yaklaşım, sitozolik proteinleri hedef alan bileşiklerin tanımlanmasında yaygın olarak kullanılmasına rağmen, transmembran proteinleri (TMP'ler) ile etkileşime giren kimyasalların tanımlanmasında daha az yaygın olarak uygulanmıştır.23. TMP'lerin immobilizasyonundaki ek bir zorluk, proteinin aktivitesinin hücre zarı fosfolipitleri ve kolesterol23,24 gibi çift katmandaki diğer moleküllerle etkileşimine bağlı olmasından kaynaklanmaktadır. Transmembran hedefini hareketsiz hale getirmeye çalışırken proteinler ve doğal fosfolipid çift katmanlı ortamları arasındaki bu ince etkileşimleri korumak önemlidir.
Hücresel membran afinite kromatografisinde (CMAC) hücre zarı fragmanları ve saflaştırılmış proteinler değil, yapay membran (IAM) sabit faz parçacıkları23 üzerinde hareketsiz hale getirilir. IAM durağan fazları, fosfatidilkolin analoglarının silika üzerine kovalent olarak bağlanmasıyla hazırlanır. Son zamanlarda, serbest amin ve silanol gruplarının uçtan kapatıldığı yeni IAM durağan faz sınıfları geliştirilmiştir (IAM. Kişisel bilgisayar. DD2 parçacıkları). CMAC kolonları sırasında hücre zarı fragmanları hazırlanması, adsorpsiyon yoluyla IAM parçacıklarının yüzeyine hareketsiz hale getirilir.
CMAC sütunları, iyon kanalları (örneğin, nikotinik reseptörler), GPCR'ler (örneğin, opioid reseptörleri), protein taşıyıcıları (örneğin, p-glikoprotein) vb. dahil olmak üzere farklı TMP sınıflarını immobilize etmek için bugüne kadar kullanılmıştır. İmmobilize protein hedefleri, farmakodinamiklerin karakterizasyonunda (örneğin, ayrışma sabiti, Kd) veya hedefle etkileşime giren küçük moleküllü ligandların bağlanma kinetiğinin (kaçık ve kkapalı) belirlenmesinde ve ayrıca karmaşık matrislerde bulunan potansiyel yeni ilaç uçlarının tanımlanması sürecinde kullanılmıştır24 . Burada, çok sayıda sinir sistemi bozukluğu için ilaç keşfi için uygun bir hedef olarak ortaya çıkan immobilize tropomiyozin kinaz reseptörü B (TrkB) ile CMAC kolonlarının hazırlanması sunulmaktadır.
Önceki çalışmalar, beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) / TrkB yolunun aktivasyonunun, AD veya majör depresif bozukluk25,26,27,28 gibi bazı nörolojik rahatsızlıkların iyileşmesi ile ilişkili olduğunu göstermiştir. BDNF düzeylerinin ve reseptör TrkB ekspresyonunun AD'de azaldığı, benzer azalmaların MS29 hayvan modellerinde hipokampal fonksiyonu bozduğu bildirilmiştir. AD hastalarının serum ve beyninde BDNF düzeylerinde azalma bildirilmiştir30,31,32. Tau aşırı ekspresyonu veya hiperfosforilasyonun, primer nöronlarda BDNF ekspresyonunu aşağı regüle ettiği ve AD hayvan modellerinde33,34,35 olduğu bulunmuştur. Ek olarak, BDNF'nin β-amiloid kaynaklı nörotoksisite in vitro ve in vivo36 üzerinde koruyucu etkileri olduğu bildirilmiştir. Sıçan beynine doğrudan BDNF uygulanmasının bilişsel olarak bozulmuş hayvanlarda öğrenme ve hafızayı arttırdığı gösterilmiştir37. BDNF/TrkB, AD28,38 dahil olmak üzere nörolojik ve psikiyatrik bozuklukların iyileştirilmesinde geçerli bir hedef olarak ortaya çıkmıştır. AD'de tedavilerin geliştirilmesi için BDNF / TrkB sinyal yolunu hedeflemek, potansiyel olarak hastalık hakkındaki anlayışımızı geliştirecektir39. Ne yazık ki, BDNF'nin kendisi zayıf farmakokinetik özellikleri ve olumsuz yan etkileri nedeniyle bir tedavi olarak kullanılamaz40. TrkB/BDNF yolaklarının küçük molekül aktivatörleri potansiyel TrkB ligandları 41,42,43 olarak araştırılmıştır. Test edilen küçük molekül agonistleri arasında, 7,8-dihidroksiflavonun (7,8-DHF), BDNF / TrkB yolunu41,44,45,46 aktive ettiği gösterilmiştir. 7,8-DHF'nin bir türevi (R13; 4-Oxo-2-fenil-4H-kromen-7,8-diyl bis (metilkarbamat)) şu anda AD47 için olası bir ilaç olarak değerlendirilmektedir. Son zamanlarda, birkaç antidepresanın TrkB'ye doğrudan bağlanarak ve BDNF sinyallemesini teşvik ederek çalıştığı ve TrkB'yi çeşitli nörolojik bozuklukları tedavi etmek için geçerli bir hedef olarak takip etmenin önemini vurguladığı gösterilmiştir48.
Protokol, işlevsel TrkB sütunu ve TrkB-NULL negatif kontrol sütununun birleştirilmesi işlemini açıklar. Kolonlar, bilinen bir doğal ürün küçük-moleküler ligand kullanılarak karakterize edilir: 7,8-DHF. Ek olarak, TrkB ile etkileşime giren bileşiklerin tanımlanması için bitki ekstraktını örnek olarak kullanarak karmaşık matrislerin taranması sürecini açıklıyoruz.

<table><tbody><tr><td>7-8 Dihidroksiflavon hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5446-10 mg</td> <td>& ge; %98 (HPLC)</td></tr><tr><td>Adenozin 5'-trifosfat (ATP) disodyum tuzu hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383-1 g</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum asetat</td><td>VWR Kimyasalları BDH</td><td>BDH9204-500 g</td><td></td></tr><tr><td>BDNF antikoru</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-15198-400 & mu; L</td><td>Birincil antikor; 2 mg / mL konsantrasyon</td></tr><tr><td>Benzamidin hidroklorür hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6506-25 g</td><td></td></tr><tr><td>Beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) insan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3795-10 & mu; g</td><td>Rekombinant, E. coli cinsinden eksprese edilmiş, liyofilize toz, hücre kültürüne uygun</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>VWR Analitik</td><td>BDH9224-1 kg</td><td></td></tr><tr><td>Kolik asit sodyum tuzu</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62050-100 g</td><td></td></tr><tr><td>Dounce homojenizatör</td><td>VWR</td><td>71000-516</td><td>40 mL, 285 mm (toplam uzunluk), 32 x 140 mm (OD x Y)</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td><td>VWR Analitik</td><td>BDH-9232-500 g</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500 mL</td><td>steril filtreli, hücre kültürü için uygun</td></tr><tr><td>G418 disülfat tuzu çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8168-100 mL</td><td>H2O, 0.1 & mu içinde 50 mg/mL; m filtreli, hücre kültürü için uygun</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>VWR Yaşam Bilimleri</td><td>E520-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>İmmobilize yapay membran (IAM. Kişisel bilgisayar. DD2)</td><td>Regis Teknolojileri, Inc.</td><td>1-771050-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat</td><td>VWR Analitik</td><td>BDH9244-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322425</td><td></td></tr><tr><td>Nikon C2 DUVb</td><td>Nikon</td><td></td><td>Konfokal lazer tarama mikroskobu</td></tr><tr><td>Normal keçi serumu (%10)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>50197Z</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetansülfonil florür (PMSF)</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978-5 g</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>VWR Yaşam Bilimleri</td><td>K812-500 mL</td><td>1x</td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>VWR Kimyasalları BDH</td><td>0395-1 kg</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>VWR Yaşam Bilimleri Ambreso</td><td>M221-1 mL</td><td>50 mM AEBSF, 30 & mikro içeren proteomik sınıf; M aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 ve 1 mM leupeptin</td></tr><tr><td>RPMI-1640 orta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-500 mL</td><td>, L-glutamin ve sodyum bikarbonat içeren, sıvı, steril filtreli, hücre kültürüne uygun</td></tr><tr><td>İkincil antikor keçi anti-tavşan IgG (H + L)</td> <td>Invitrogen Alexa Flour Plus 488</td><td>A32731</td><td></td></tr><tr><td>SH-SY5Y Trk-B</td><td>Kerafast</td><td>ECP007</td><td></td></tr> <tr><td>eksprese eden nöroblastom hücre hatlarıSH-SY5Y Trk-NULL hücre hattı</td><td>Kerafast</td><td>ECP005</td><td></td></tr><tr><td>Yılan derisi diyaliz tüpü</td><td>Thermo Scientific</td><td>88245</td><td>10K MWCO, 35 mm kuru iç çap</td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>BDH VWR Analitik</td><td>BDH9286-2.5 kg</td><td></td></tr><tr><td>Tricorn 5/20 sütun</td><td>GE Sağlık</td><td>24-4064-08</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>VWR Yaşam Bilimleri</td><td>0497-1 kg</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-500 mL</td><td>% 0.25, steril filtreli, hücre kültürüne uygun, 2.5 g domuz tripsin ve 0.2&nbsp; g EDTA</td></tr></tbody></table>

İmmobilize tropomiyozin kinaz reseptörü b ile etkileşime giren Özel bitki metabolitlerini tanımlamak için hücresel membran afinite kromatografisi sütunları

Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

Bitkiler, mantarlar, bakteriler ve deniz omurgasızları tarafından sentezlenen kimyasallar, yeni ilaç isabetleri ve kurşunları için zengin bir kaynak olmuştur. Tıbbi uygulamada yaygın olarak kullanılan statinler, penisilin, paklitaksel, rapamisin veya artemisinin gibi ilaçlar ilk önce tanımlanmış ve doğal ürünlerden izole edilmiştir. Bununla birlikte, biyolojik olarak aktif uzmanlaşmış metabolitlerin doğal kaynaklardan tanımlanması ve izole edilmesi zorlu ve zaman alıcı bir süreçtir. Geleneksel olarak, bireysel metabolitler, biyokütlenin ekstraksiyonunu takiben karmaşık karışımlardan izole edilir ve saflaştırılır. Daha sonra, izole moleküller biyolojik aktivitelerini doğrulamak için fonksiyonel testlerde test edilir. Burada, biyolojik olarak aktif bileşikleri doğrudan karmaşık karışımlardan tanımlamak için hücresel membran afinite kromatografisi (CMAC) sütunlarının kullanımını sunuyoruz. CMAC sütunları, doğal fosfolipid çift katmanlı ortamlarına gömülü immobilize fonksiyonel transmembran proteinleri (TMP'ler) ile etkileşime giren bileşiklerin tanımlanmasına izin verir. Bu, aktivitesi yeni tanımlanan küçük moleküllü ilaç adayı ile modüle etmeyi amaçlayan TMP'yi bilmeyi gerektiren hedefli bir yaklaşımdır. Bu protokolde, çok sayıda sinir sistemi bozukluğu için ilaç keşfi için uygun bir hedef olarak ortaya çıkan immobilize tropomiyozin kinaz reseptörü B (TrkB) ile CMAC kolonlarının hazırlanmasına yönelik bir yaklaşım sunuyoruz. Bu makalede, CMAC kolonunu, TrkB reseptörlerini aşırı eksprese eden nöroblastom hücre hatları kullanılarak immobilize TrkB reseptörleri ile birleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, kolonun işlevselliğini ve TrkB reseptörleriyle etkileşime giren özel bitki metabolitlerinin tanımlanmasında kullanımını araştırmak için yaklaşımı sunuyoruz.

Protokolü takiben, iki CMAC kromatografik kolon birleştirildi: biri aşırı eksprese TrkB ile immobilize SH-SY5Y nöroblastom hücre zarı fragmanları ve diğeri SH-SY5Y TrkB-NULL hücre zarı fragmanları ile. Doğru şekilde monte edilmiş CMAC sütunu Şekil 1'de sunulmuştur ve hücre zarı fragmanı immobilizasyonunda yer alan adımlar Şekil 2'de sunulmuştur.
TrkB reseptörlerinin IAM üzerindeki immobilizasyonundan bu yana. Kişisel bilgisayar. DD2 k...

Protokol, fonksiyonel transmembran tropomiyozin kinaz reseptörü B proteinlerini içeren immobilize hücre zarı fragmanları ile hücre zarı afinite kromatografisi (CMAC) kolonlarının hazırlanmasını açıklar. CMAC kolonlarının, bu reseptörlerle etkileşime giren ve karmaşık doğal karışımlarda bulunan özel bitki metabolitlerinin tanımlanmasında kullanımı da açıklanmaktadır.

İmmobilize Tropomiyozin Kinaz Reseptörü B ile Etkileşime Giren Özel Bitki Metabolitlerini Tanımlamak için Hücresel Membran Afinite Kromatografisi Sütunları

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, ...

Bu dikey, hücre zarı afinitesi kromatografisi kolonlarının fonksiyonel transmembran reseptörleri ile birleştirilmesinde önemli adımlar sunmaktadır. Bu sütunlar, karmaşık ekstraktlarda bulunan ve immobilize transmembran reseptörleri ile etkileşime giren küçük moleküllerin tanımlanması için kullanılabilir. Hücresel membran afinite kromatografisi sütunları, karmaşık karışımlarda bulunan biyolojik olarak aktif bileşiklerin tanımlanmasını hızlandırır.Hücresel membran afinite kromatografisi sütunlarının kullanımı, bitki, mantar veya bakteri ekstraktları gibi karmaşık doğal matrislerde bulunan farmakolojik olarak aktif bileşiklerin tanımlanmasıyla ilgilenenler için özellikle ilgi çekici olabilir. Başlamak için, beş mililitre ultra saf deiyonize suda 120 benzamidin çözerek 200 milimolar benzamidin stok çözeltisi hazırlayın. Bir duman davlumbazında 10 mililitre etanol içinde 0.017 gram PMSF'yi çözerek 10 milimolar PMSF stok çözeltisi hazırlayın.Ticari olarak temin edilebilen proteaz inhibitörü karışımını bir mililitre ultra saf deiyonize suda çözerek 100X proteaz inhibitörü kokteyli hazırlayın. İyice karıştırın ve kokteylin 200 ila 300 mikrolitresini alın. 55.114 miligram ATP disodyum tuzu hidratını bir mililitre iyonize ultra saf suda çözerek 100 milimolar ATP stok çözeltisi hazırlayın.İyice karıştırın ve karışımın 100 mikrolitresini alın. 3.03 gram Tris-HCL, 2.9 gram sodyum klorür, 0.22 gram kalsiyum klorür susuz, 0.2 gram magnezyum klorür hekzahidrat ve 0.19 gram potasyum klorürü 500 mililitre ultra saf deiyonize suda çözerek tampon hazırlayın. 17.3 mililitre Tris tamponunu 0.3 mililitre benzamidin stok çözeltisi, 0.2 mililitre PMSF stok çözeltisi, 0.2 mililitre proteaz inhibitörü kokteyli, 20 mikrolitre ATP stok çözeltisi, iki mililitre gliserol ve 0.029 gram EDTA ile karıştırarak homojenizasyon tamponunu hazırlayın.Hidroklorik asit çözeltisi kullanarak pH'ı 7.4'e ayarlayın. Dört santigrat derecede hasat edilen hücreleri 400 x g'de beş dakika boyunca döndürün ve süpernatantı çıkarın ve kalan hücre peletini 10 mililitre 1X pH 7.4 buz gibi soğuk PBS ile yıkayın. Süpernatantı atın ve 20 mililitre homojenizasyon tamponu ekleyin.Konik tüpü buzun üzerine yerleştirin. Hücre süspansiyonunu 40 mililitrelik bir Zıplama homojenizatörü doku öğütücüye aktarın, 40 yukarı ve aşağı havane darbesi kullanarak süspansiyonu buz üzerinde manuel olarak homojenize edin. Homojenize hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın, peleti atın ve süpernatantı yeni bir konik tüpe aktarın.Hücre zarı peletini kaydedin ve süpernatanı atın. 8.7 mililitre tampon çözeltisini 0.1 mililitre PMSF stok çözeltisi, 0.15 mililitre benzamid stok çözeltisi, 0.1 mililitre proteaz inhibitörü kokteyli, 10 mikrolitre ATP stok çözeltisi, bir mililitre gliserol ve 0.2 gram sodyum kolat ile karıştırarak çözünür tamponunu hazırlayın. Çözünürizasyon tamponunu hücre zarı parçaları ile konik tüpe aktarın.Ve peleti yeniden askıya alın. Elde edilen karışımı 18 saat boyunca dört santigrat derecede 150 RPM'de döndürün. 18 saat sonra, çözünür karışımını 47.900 x g'de 30 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj yapın.100 miligram IAM ekleyin. Kişisel bilgisayar. DD2 parçacıklarını süpernatanta çevirir ve elde edilen süspansiyon karışımını bir saat boyunca dört santigrat derecede 150 RPM'de döndürür. 24 gram Tris-HCl, 23.4 gram sodyum klorür, 0.06 gram kalsiyum klorür, 5.85 gram EDTA ve 0.07 gram PMSF ekleyerek dört litre ultra saf deiyonize suda diyaliz tamponu hazırlayın.PMSF'yi önce küçük bir etanol hacminde çözün ve ardından tamponla beherin içine yavaşça ekleyin. Diyaliz tüpü hazırlamak için 10 santimetrelik selüloz membran diyaliz tüpünü kesin ve IAM içeren süspansiyonu aktarın. Kişisel bilgisayar. DD2 parçacıkları ve hücre zarı parçaları diyaliz tüpüne girer.Diyaliz tüpünün her iki ucunu diyaliz tüp klipsleriyle kapatın. Diyaliz tüpünü diyaliz tamponuna yerleştirin. 24 saat sonra, diyaliz tüpünü taze hazırlanmış diyaliz tamponuna yerleştirin ve 24 saat daha diyalize devam edin.IAM'yi yıkamak için kullanılacak 10 milimolar pH 7.4 amonyum asetat tamponu hazırlayın. Kişisel bilgisayar. DD2 partikülleri ve kolon karakterizasyon deneylerinde 0.778 gram amonyum asetat bir litre ultra saf deiyonize suda çözülür. 48 saatlik diyalizden sonra, diyaliz tüpünü diyaliz tamponundan çıkarın ve diyaliz tüpünün içeriğini 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın.Süpernatantı atın ve kalan peleti 10 mililitre amonyum asetat tamponu ile üç kez yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, kalan peleti bir mililitre amonyum asetat tamponunda yeniden askıya alın. İyice karıştırın ve CMAC kromatografi sütununu elde etmek için 5 x 20 cam sütunu paketlemek için elde edilen bulamacı kullanın.Sütunu paketlemek için, daha önce amonyum asetat tamponu ile ıslatılmış bir alt filtreyi filtre tutucuya yerleştirin. Filtre tutucuyu cam kolona takın ve tutucunun konumunu sabitlemek için kolon kapağını vidalayın. Kolonu dikey olarak bir parmak kelepçesine yerleştirin ve laboratuvar standına sabitleyin.Kolonun altına bir beher yerleştirin, bulamacın küçük bir hacmini, pipet ucunu cam sütun duvarına doğru tutan tek kanallı bir pipetleyici ile yavaşça cam sütuna aktarın. Paketleme işlemini hızlandırmak için, tamponu sabit yatağın üstünden her adım arasında bir mikropipetle çıkarın. Bir üst filtre yerleştirin ve adaptör ünitesini, sabit fazın üzerinde kalan tampon kalmayacak şekilde vidalayın.Adaptör ünitesinin konumunu adaptör kilidi ile sabitleyin. Kolonu yüksek performanslı bir sıvı kromatografi pompasına bağlayın ve kolonunu gece boyunca amonyum asetat tamponuyla yıkamak için akış hızını dakikada 0,2 mililitreye ayarlayın. Daha uzun süre saklamak için, kolonu, amonyum asetat tamponunda% 0.05 sodyum azid çözeltisi ile çalıştırın, sodyum azid ile çalışırken bir laboratuvar önlüğü, güvenlik gözlükleri ve eldivenler giyin ve dört santigrat derecede saklayın.IAM.Kişisel bilgisayar. DD2 partikülleri ile immobilize nöroblastom TrkB hücre zarı fragmanları ve BDNF varlığında floresan partiküller ile sonuçlandı. TrkB null hücre zarı kapsüllenmiş IAM partiküllerinde veya TrkB hücre zarı kapsüllenmiş IAM partiküllerinde olduğu gibi BDNF kullanılmadığında floresan gözlenmedi. İmmobilize TrkB reseptörlerine bir milimolar, 750 nanomolar, 500 nanomolar ve 300 nanomolar'ın 7, 8-DHF konsantrasyonlarını artıran fonksiyonel bir CMAC kolonu, retansiyon süresinde konsantrasyona bağlı bir değişiklik gösteren tipik bir frontal afinite kromatogramı gösterilmiştir.İşlevsel olmayan bir CMAC kolonu, marker ligandın retansiyonunda konsantrasyona bağlı değişikliklerin eksikliğini gösterdi. Bir CMAC negatif kontrol kolonu, spesifik olmayan etkileşimleri dışlamak için hedeflenen proteini ifade etmeyen, hücre zarı fragmanlarını hareketsiz hale getirerek hazırlandı. % 0.2 sulu Gotu kola ekstraktının eklenmesi, agonist bağlanma bölgesi için rakip ligandların varlığını gösteren 7, 8-DHF retansiyonunda önemli bir azalma ile sonuçlandı.CMAC negatif TrkB null kolonunda 7, 8-DHF retansiyonunun azalmaması, bu kolonda fonksiyonel TrkB reseptörlerinin eksikliğini daha da doğruladı. Eksik pik kromatografi yaklaşımı, TrkB sütununda güçlü bir şekilde tutulan bir bileşiği tanımlarken, TrkB null sütununda erken salınım yaparak spesifik etkileşimi gösterir. Hızlı hücresel membran afinitesi kromatografi sütunu için reseptör kaynağınızı bilmek çok önemlidir.Homojenizasyon ve çözündürme tamponlarını doğru şekilde tasarlamak için literatürü kontrol ettiğinizden emin olun. Bu protokolde hazırlanan hücresel membran afinite kromatografisi kolonu, yeni potansiyel ilaç isabetlerini tanımlamak ve immobilize reseptör ile doğal ligandları arasındaki etkileşimin doğasını karakterize etmek için kullanılmıştır.

cellular-membrane-affinity-chromatography-columns-to-identify

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Test protein-protein etkileşim protein işlevsellik diseksiyon için vazgeçilmezdir. Burada, bir...

Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro</em

Burada tam 15 N etiketli Arabidopsis thaliana hücre kültürleri etiketlenmemiş bir karışımına dayanan deterjan dayanıklı ve deterjan çözünür membran içine bitki plazma zarlarının parçalanması için ve in vivo güçlü bir yöntem açıklanmaktadır. Prosedür sinyal süreçleri anlamak için karşılaştırmalı proteomik çalışmalar için uygulanır.

Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Süspansiyon Hücre Kültürleri

Yöntem bitki özleri, ince katman kromatografisi (TLC) ile ayırma antibakteriyel metabolitlerin tespit etmek için iletişim bioautography açıklanmaktadır. Yöntem sığır işkembe için yerel aşırı amonyak üreten bakteri (HAB) inhibe kırmızı yonca fenolik bileşiklerin taranması uygulanır.

İnce tabaka kromatografi (TLC) Ayırımı ve bitki özleri Biyodenemeler Antimikrobiyal Bileşikler tanımak

Protein-protein ve protein-metaboliti etkileşimler tüm hücresel fonksiyonları için önemlidir. Burada, biz seçim bir protein ile bu etkileşimlerin paralel analiz sağlayan bir protokol tanımlamak. Bizim iletişim kuralı bitki hücre kültürleri için optimize edildi ve benzeşme arıtma kütle spektrometresi tabanlı protein ve metaboliti algılama ile birleştirir.

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Burada protein alma kompleksleri (TOC-TIC kompleksi) dokunun etiketini kullanarak kloroplast arıtma için kanıtlanmış ve test iletişim kuralı mevcut. Tek benzeşimi yalıtım Protokolü potansiyel olarak herhangi bir protein için uygulanabilir ve kütle spektrometresi ile yeni etkileşim ortaklar tanımlamak için kullanılan.

Kloroplast Translocon Protein kompleksleri dokunun etiketini kullanarak benzeşme arıtma

Bu prosedürde, Bir DsRed tabanlı epitop ligand protein A alternatif olarak, ham bitki özleri veya hücre kültürü supernatants monoklonal antikorların yakalanması için son derece seçici afinite reçine üretmek için immobilize edilir.

Affinity Kromatografi Reçiyatlarının Hızlı Gelişimi İçin Aktif Çapraz Bağlantılı Agarose - Örnek Olay Olarak Antikor Yakalama

Burada açıklanan Nicotiana benthamiana yaprak dokusunda NLR bağışıklık reseptörünün TIR etki alanının etkileşim ortaklarının belirlenmesi için bir yakınlık etiketleme yöntemidir. Ayrıca Nicotiana ve diğer bitki türlerinde bu tekniği kullanarak ilgi diğer proteinler arasındaki etkileşimlerin belirlenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlanır.

Protein-Protein Etkileşim Ağlarının Planta Özdeşleştirilmesinde TurboID Tabanlı Yakınlık Etiketlemesi

Bir plazma membran reseptörü kinazının membran kaçakçılığı olaylarını incelemek için burada yaygın olarak kullanılan birkaç yöntem tanıtılmaktadır. Bu yazıda bitki materyali hazırlama, farmakolojik tedavi ve konfokal görüntüleme kurulumu dahil olmak üzere ayrıntılı protokoller açıklanmaktadır.

Stoma Soy Hücrelerinde Membran Kaçakçılığı Olaylarını İncelemek için Görüntü Tabanlı Yöntemler

Hızlı kütle spektrometresi (MS)/kütle spektrometresi (MS) tabanlı tropan alkaloidlerinin açıklanması ve sınıflandırılması için hem tropan içeren numunelerin ön replikasyonu hem de izolasyon için yeni alkaloidlerin keşfi için yararlı bir yöntem sunuyoruz.

Doğal Ürün Araştırmalarında Sıvı Kromatografi Tandem Kütle Spektrometresinin Uygulamaları: Bir Vaka Çalışması Olarak Tropan Alkaloidleri

Burada, bir kriyojenik sıcaklıkta katı hal öğütme ile memeli hücrelerin bozulması Elde edilen hücre tozu, bir hücre, ekstrenin üretilmesi ve antikor-bağlı mikron çaplı paramanyetik taneler üzerine afinite yakalama ile ilgili protein kompleksleri izole etmek için protokoller tarif eder.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Keşfedin hücresel membran afinite kromatografisi sütunları hazırlama yöntemini, immobilize TrkB reseptörleriyle etkileşen bitki metabolitlerini tanımlamak için. Bu teknik, karmaşık doğal ekstrelerdeki biyolojik olarak aktif bileşiklerin hızlı tespitini sağlar.

İmmobilize Tropomiyozin Kinaz Reseptörü B ile Etkileşime Giren Özel Bitki Metabolitlerini Tanımlamak için Hücresel Membran Afinite Kromatografisi Sütunları (Video) | JoVE Journal

İmmobilize Tropomiyozin Kinaz Reseptörü B ile Etkileşime Giren Özel Bitki Metabolitlerini Tanımlamak için Hücresel Membran Afinite Kromatografisi Sütunları

Daha fazla video keşfet