Çekiş Kuvveti Mikroskopisinde Uygulamalar için Hidrojel Desenleme Teknikleri Kullanılarak Hücre Yapışıklıklarının Kontrolü
29 Ocak 2022
UV'ye yakın litografi ve çekiş kuvveti mikroskopisi, mikropatterned hidrojeller üzerindeki hücresel kuvvetleri ölçmek için birleştirilir. Tek hücrelerin hedeflenen ışık kaynaklı salınımı, aynı numune üzerinde yüksek sayıda ölçüm sağlar.
Bu prosedürün genel amacı, 2D çekiş kuvveti mikroskopi çalışmaları için mikro desenli hidrojeller imal etmektir. Bu, önce methacrylated cam kapak kayması yaparak ve üzerinde bir poliakrilamid hidrojelinin ilk tabakasını oluşturarak gerçekleştirilir. İkinci adım, çekiş kuvveti mikroskopisi için floresan boncuklar içeren başka bir hidrojel tabaka oluşturmaktır.
Hidrojel, üzerine mikro desenli bir kapak kayması ile sandviç yapılır ve bu da mikro desenli matris proteinlerinin hidrojel yüzeyine aktarılmasına neden olur. Daha sonra, poliakrilamid hidrojel oda sıcaklığında 45 dakika polimerize etmek için bırakılır. Üst kapak kayması daha sonra dikkatlice çıkarılır.
Floresan mikroskopi görüntüleme, boncukların varlığını ve mikro desenli hücre dışı matris proteinlerinin başarılı transferini göstermek için kullanılır. Bu yöntem, hücrelerin ışığını ve salınımını kullanarak çeşitli çekiş kuvvetlerini verimli ve hassas bir şekilde ölçmeye yardımcı olur. Aynı örnekten daha fazla sayıda deneysel gözlem elde etmek mümkün.
Prosedürü gösteren joel Christian olacak, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi. Bir kabın içine 10 mililitre çift damıtılmış su ekleyin. Daha sonra çözeltiye 18,75 mililitre asetik asit, 18,75 mililitre 3 propil methakrilit ve 252,5 mililitre etanol ekleyin.
Çözelti tamamlandığında, kristalize bir tabağa aktarın. 24 milimetre yuvarlak kapak slipleri alın, hassas bir silme ile temizleyin ve özel yapılmış bir teflon rafa koyun. Daha sonra çözeltiye daldırın ve 15 dakika kuluçkaya yatırın.
Rafı alın ve etanol ile durulayın. Kapak kaymalarını hava akımı altında kurutun. Methacrylated kapak kaymaları oda sıcaklığında bir aya kadar saklanabilir.
15 milimetrelik yuvarlak bir kapak kayması alın ve bir Petri kabına yerleştirin. Kapak fişinin üst tarafını işaretlemek için elmas bir kalem kullanın. Daha sonra oksijen plazması tedavisi ile temizliğe devam edin.
Kapak fişi iki dakika boyunca 0,4 milibar ve 200 Watt'ta temizdir. Kapak kaymasının yüzeyine Poli-L-Lizin çözeltisinin% 0.01'inin 100 mikrolitresini pipetleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, kapak fişini 8,5 pH'da 10 milimolar ile yıkayın.
Fazla sıvıyı çıkar, ancak yüzeyi ıslak tutun. Pipet 10 milimolar pH 8.5 çözeltisinde mililitre başına 50 miligram pipet kapak kaymasının yüzeyine 100 miligram ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra, kapak kaymalarını 10 milimolar pH 8.5 ile durulayın.
Daha sonra yüzeye iki mikrolitre PLPP jel ve ardından 40 mikrolitre etanol ekleyin. Çözeltiyi homojenize etmek için Petri kabını hafifçe eğin. Çözeltinin polarize olmasını beş dakika bekleyin.
Kapak fişini 35 milimetrelik bir alt delik Petri kabının içine yerleştirin. Kapak fişini içeren Petri kabını mikroskop aşamasına yerleştirin. Odağı camın yüzeyine ayarlayın.
Önceden çizilmiş deseni yükleyin ve kilitleyin. Milimetre kare başına 30 milijoule UV dozu ile desenleme başlayın. Desenleme adımını tamamladıktan sonra desen kapağı fişini çıkar ve yüzeyi PBS ile durulayın.
Numuneyi, oda sıcaklığında bir saat boyunca PBS'de çözünmüş Alexa 488 ile eşleştirilmiş mililitre fibronektin başına 25 mikrogram ve mililitre fibrinojen başına 25 mikrogramlık 100 mikrolitre karışımı ile kuluçkaya yatırın. Hidrojel substratını hazırlamak için, methacrylated kapak fişini bir Petri kabına koymakla başlayın. Başlamak için, 15 mililitrelik Falcon tüpüne 9,55 mililitre çift damıtılmış su ekleyerek taze oksitlenmiş AgA çözeltisi hazırlayın.
Ardından 0,5 mililitre AgA ekleyin. Daha sonra çözeltiye 42 miligram sodyum meta piruvat ekleyin. Çözeltiyi çalkalayıcıda dört saat ayarlayın.
Daha sonra tablo 1'e göre akrilamid, bis-akrilamid ve çift damıtılmış suyu karıştırarak stok çözeltisini hazırlayın. Stok çözeltisi dört santigrat derecede bir yıla kadar saklanabilir. 99,3 mikrolitre stok çözeltisini 0,5 mikrolitre amonyum persülfat %1 ve 0,2 mikrolitre TEMED ile karıştırarak alt tabaka için çalışma solüsyonunu hazırlayın.
Çözeltiden 10 mikrolitre alın ve pipet damlası olarak methacrylated kapak kaymasına alın. Damlacık üzerine dikkatlice 15 milimetrelik yuvarlak bir kapak kayması yerleştirin ve polimerize olması için 45 dakika bekleyin. Ardından, üst kapak kaymasını neşterle ayırın.
Daha sonra 93,3 mikrolitre stok çözeltisini bir mikrolitre oksitlenmiş HEA, beş mikrolitre floresan boncuk, 0,5 mikrolitre amonyum persülffat% 1 ve 0,2 mikrolitre TEMED ile karıştırarak üst tabaka için çalışma solüsyonunu hazırlayın. Çözeltiden beş mikrolitre alın ve alt katman hidrojel üzerine damla açısından pipetleyin. Damlacık üzerine dikkatlice bir mikro desenli kapak kayması yerleştirin.
Polimerize olması için 45 dakika bekleyin. Kapak fişini neşterle yavaşça ayırın. Ve kapak fişini özel delinmiş altı kuyu plakasının altına yapıştırın.
Kuyulara PBS ekleyin. Hücreleri görmek için PBS'yi altı kuyu plakasından aspire edin. Fibroblastlar için, L-glutamin içeren yüksek glikoz DMEM ekleyin ve% 10 FPS ve% 1 penisilin ve streptomisidin ile destekleyin.
Hücreleri bir gecede 37 santigrat derece ve%5 CO2'de kuluçkaya yatırın. Mikroskopi aşaması için CO2'yi ve ısıtmayı açın. Ardından mikroskobu açın ve kuyu plakasını sahneye yerleştirin.
Aydınlatma desenini ayarlayın ve ilgi çekici hücreleri işaretleyin. Hidrojel yüzeyine yeniden odaklanın. Brightfield kanalındaki hücrelerin görüntüsünü alın.
Boncukların görüntüsünü deforme durumda çekmek için kanala geçin. Daha sonra lazer kanalına geçin ve hücreyi üç dakika boyunca desene göre aydınlatın. Bu, milimetre kare başına 6.000 milijoule'lik bir doza karşılık gelir.
Daha sonra, kanalı değiştirin ve boncukların görüntüsünü biçimlendirilmemiş durumda alın. Çekiş kuvvetlerini hesaplamak için, yanal sürüklenme için zaten düzeltilmiş floresan boncuk görüntülerini açın. Çekiş kuvvetlerinin tam analizi ekli komut dosyasında ayrıntılı olarak yer almaktadır.
Hücrelerin hidrojel yüzeyindeki mikro desenli bölgelere seçici yapışmasını doğrulamak için, örnekler önceden etiketlenmiş matris proteinleri kullanılarak floresan mikroskopi ve hücreleri görselleştirmek için brightfield mikroskopisi ile görüntülenmiştir. Poliakrilamid hidrojellerin mekanik özellikleri, farklı miktarlarda akrilamid ve bis-akrilamid karıştırılarak değişmektedir. Hidrojel sertliği atomik kuvvet mikroskopisi ile nanoindentasyon deneyleri ile değerlendirildi.
Poliakrilamid hidrojelin mikron büyüklüğündeki bölgelerini seçici olarak aydınlatmak için mekansal, temporally kontrollü, ultraviyole lazer ışını aydınlatması uygulandıktan sonra çekiş kuvveti ölçümleri yapıldı. Çekiş kuvvetleri, genelleştirilmiş çapraz doğrulama ile seçilen bir düzenlileştirme parametresi ile düzenli fttc kullanılarak yeniden inşa edilmiştir. Işık ve mikro desen hücrelerinin kullanımı ile birlikte çekim kuvveti mikroskopisine dayanan model modüler yaklaşımımız çok yönlüdür ve çözünürlüğünü ve hassasiyetini artırmak için diğer mikroskopi ve görüntüleme kurulumu ile daha fazla kullanılabilir.
Genel Bakış
Bu çalışma, hücresel kuvvetleri mikro desenli hidrojeller üzerinde ölçmek için yakın-UV litografi ve çekme kuvveti mikroskopisini birleştirir. Yöntem, tek hücrelerin hedefli ışıkla indüklenen salınımını sağlayarak aynı numuneden yüksek sayıda ölçümün yapılmasını kolaylaştırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Biyofizik
Arka Plan
- Çekmeli güç mikroskopis, hücresel mekaniğin incelenmesi için esastır.
- Mikro desenli hidrojeller, hücre yapışması için kontrollü bir ortam sağlar.
- Yakın-UV litografi, hücre dışı matris proteinlerinin hassas desenlendirilmesini sağlar.
- Hücresel kuvvetlerin verimli ölçümü, hücre davranışı hakkındaki anlayışımızı geliştirebilir.
Çalışmanın Amacı
- Çekmeli güç mikroskopis için mikro desenli hidrojeller üretmek.
- Hücresel kuvvet ölçümlerinin doğruluğunu ve verimliliğini artırmak.
- Lisansüstü bir öğrenciyi gösterici olarak kullanarak hücresel çekme kuvvetlerini ölçme prosedürünü göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Metakrilatlı cam kapak camlarının hazırlanması.
- Floresan boncuklarla poliakrilamid hidrojel katmanlarının oluşturulması.
- Başarılı desen aktarılması doğrulama için floresan mikroskopi kullanımı.
- Mikro desenleme için yakın-UV litografi uygulaması.
Ana Sonuçlar
- Mikro desenli hidrojellerin başarılı üretimi.
- Hücresel çekme kuvvetlerini verimli bir şekilde ölçme kabiliyetinin gösterilmesi.
- Tek bir numuneden yüksek sayıda ölçüm elde edilmesi.
- Görüntüleme yoluyla boncuk varlığının ve desen aktarılması doğrulaması.
Sonuçlar
- Birleşik yöntem, hücresel mekaniğin çalışmasını geliştirir.
- Işıkla indüklenen hücre salınımı, tekrarlanabilir ölçümlere izin verir.
- Bu yaklaşım, daha ileri araştırmalar için çeşitli hücre tiplerine uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Standardizing cell adhesion patterns enables reproducible traction force measurements, addressing variability in cell shape and force output that limits throughput in mechanobiology assays. This approach supports predictive confidence in target validation by providing quantitative, deformation-based readouts of cellular mechanotransduction pathways. The method enhances assay reliability for early discovery workflows where mechanical phenotype correlates with drug response or target engagement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by controlling adhesion geometry to isolate force-dependent signaling pathways.
- Operational Value: Reduces biological noise from heterogeneous cell spreading, improving assay consistency across replicates.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking of targets involved in mechanosensing, such as YAP/TAZ or integrin-linked kinases.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantifiable traction force matrices for comparing compound effects on cellular contractility.
- Operational Value: Allows sequential force measurements from the same sample via localized UV release, increasing data density per well.
- Assay Readiness: Produces reusable hydrogel substrates with defined adhesive islands compatible with high-resolution imaging and bead-based displacement tracking.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links in vitro mechanical phenotypes to disease-relevant models where altered traction forces indicate pathological states.
- Preclinical Utility: Enables dose-response profiling of compounds targeting cytoskeletal regulators or focal adhesion components.
- Risk-Adjusted Advancement: Identifies mechanotoxic liabilities early by detecting aberrant force generation in patterned cellular systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, particularly for pathways where mechanical signaling modulates target validity or compound efficacy.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by enabling controlled application and release of mechanical cues to dissect force-dependent signaling nodes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative displacement readouts of embedded beads as a proxy for cellular traction forces across conditions.
- Analytics: Employs regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC) to reconstruct traction fields, providing standardized force maps for comparative analysis.
- Translational Research: Connects mechanical output to phenotypic outcomes only when supported by disease models showing traction force alterations in fibrosis, cancer, or stem cell differentiation.
- Enterprise Reuse: Positions the hydrogel patterning workflow as a modular, adaptable platform for mechanophenotyping across multiple projects and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing confounding variables in cellular force measurements.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput through standardized adhesion patterns and sequential sampling via light-induced release.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of mechanobiological liabilities that may lead to late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on mechanical phenotype concordance with disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in photolithography, hydrogel chemistry, and fluorescence microscopy for pattern fabrication and bead tracking.
- Depends on UV illumination systems with spatial control and polyacrylamide synthesis capabilities for tunable elasticity.
- Necessitates standardization of protein coating protocols and UV dosing to ensure consistent adhesion patterns across batches.
- Involves adaptation considerations when extending to 3D models or primary cells with distinct adhesion kinetics.
- Practical limitations include UV-induced hydrogel degradation over repeated cycles and bead photobleaching during prolonged imaging.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:22
Preparation of Methacrylated Coverslips
2:39
Micropatterning of Extracellular Matrix Proteins on Glass Coverslips
5:31
Fabrication of Patterned Polyacrylamide Hydrogels
9:15
Local Release of Cell Traction Forces by UV-A Laser Illumination
10:26
Image Processing, Particle Image Velocity and Calculation of Traction Forces
10:55
Results
11:56
Conclusion
