Primer Hastaya Özgü Aort Düz Kas Hücrelerinin İzolasyonu ve Yarı Kantitatif Gerçek Zamanlı Kasılma Ölçümleri In Vitro

Bu yöntem, araştırmacıların aynı anda birden fazla hasta hücre hattının hücre kasılmasını incelemelerini sağlar. Hastalıkları daha hızlı ve daha verimli bir şekilde incelememizi sağlar. Bu teknik, hücre kasılmasını gerçek zamanlı olarak ölçmemizi sağlar.

Bir saat içinde onlarca hücrenin kasılma değerlerini elde edebiliriz. İlk kez aort anevrizması olan bir grup hastada kas hücresi kasılmasının azaldığını gösterdik. Bu, tıbbi tedavi için yeni bir biyobelirteç veya hedef olabilir.

İki çift cerrahi forseps ve bir neşteri% 70 etanol içine batırarak ve daha sonra kurutarak sterilize ederek başlayın. Daha sonra, doku diseksiyonunun yapılacağı bir Petri kabında iki mililitre SMC ortamı pipetin. Sonraki pipet 2,5 mililitre SMC ortamı iki T-25 şişeye yerleştirilir.

Şişeleri etrafta döndürün, böylece küçük hacimli ortam tüm yüzeyi kaplar. Biyopsiyi görsel olarak inceleyin, üç aort katmanını, katmanları ayırt etmek için intima tarafında aterosklerotik plakların ve adventitial tarafta sümüksü bağ dokusunun varlığı ile tanımlayın. SMC'leri ortamdan izole etmek için, dokuyu önce intima plağı olan tarafı yukarı doğru yerleştirerek diğer iki katmanı çıkarın, daha sonra pembe üniform medial tabaka görünene kadar dokuyu ikinci forseps çifti ile aşağı iterken forseps ile dokudan çekerek katı plağı çıkarın.

Şimdi dokuyu çevirin ve adventitial tabakayı çekerek aynı prosedürü tekrarlayın, bu katman ortamdan kolayca ayrılmayacağı için tüm görünür parçaları gerektiği kadar denemede çıkardığınızdan emin olun. Medya tabakası izole edildikten sonra, medyayı forseps ile bastırarak ve hasarı en aza indirmek için temiz tek yönlü kesimler yaparak neşteri kullanarak dokuyu bir yönde keserek dokuyu küpler halinde kesin. Forseps kullanarak bu doku parçalarından 10 ila 20 tanesini T-25 flağının üst çeyreğine yerleştirin.

Daha önce tarif edildiği gibi iki çift cerrahi forseps ve bir neşter sterilize edildikten sonra, doku diseksiyonunun yapılacağı bir Petri kabında iki mililitre fibroblast ortamı pipetin. Daha sonra 2,5 mililitre fibroblast ortamını iki T-25 şişesine pipetleyin ve şişeleri döndürün, böylece küçük hacimli ortam tüm yüzeyi kaplar. Epidermisi tanınabilir bir cilt yüzeyiyle, bazen görünür saçlarla tanımlamak için biyopsiyi görsel olarak inceleyin, ardından karşı tarafta sarı ve sümüksü deri altı yağları arayın.

Epidermis ve deri altı yağ arasındaki tabaka, canlı fibroblastların kaynağı olan dermistir. Fibroblastları dermisten izole etmek için, üç katmanı da görünür kılmak için dokuyu dermis tarafına yerleştirerek diğer iki katmanı çıkarın. Daha sonra dokuyu forseps ile tutun ve dokuya zarar vermeden tüm epidermisi temiz bir çizgide kesin.

Şimdi dokuyu çevirin ve deri altı yağ ile sınıra paralel olarak dermis içinde keserek aynı prosedürü tekrarlayın. Dermis izole edildikten sonra, dokuyu forseps ile bastırarak ve neşteri kullanarak dokuyu bir yönde keserek küpler halinde kesin. Daha sonra forseps kullanarak bu doku parçalarından 10 ila 20 tanesini T-25 şişesinin üst çeyreğine yerleştirin.

Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve SMC'leri, jelatin kaplı ECIS plakasındaki 200 mikrolitre SMC ortamında kuyu başına 30.000 hücrelik bir tohumlama yoğunluğunda üçlü olarak tohumlayın. SMC'lerle birlikte plakayı, hücre kültürü inkübatöründe ECIS'in 96 kuyucuklu tutucusuna yerleştirin. Programı açmak için ECIS Applied BioPhysics yazılımına çift tıklayın ve Kurulum düğmesine basın.

Tüm elektrotların sol alt paneldeki Kuyu Konfigürasyonu etiketli tutucuyla temas edip etmediğini kontrol edin. Elektrotlar düzgün bir şekilde bağlanmazsa, ölçüme başlamadan önce tutucudaki plakayı ayarlayın. Şimdi aynı panelde Dizi türü'nü tıklatarak plaka türünü seçin.

Ardından, iki mikrolitre ve 150 mikrolitre hacme ayarlanmış iki pipet hazırlayın. Stimülasyona başlamadan önce, yazılımda İşaretle tuşuna basın ve bir yorum yerleştirin. Hücreleri uyarmak için kapağı çıkarın ve inkübatörün içindeki steril bir yüzeye yerleştirin.

Daha sonra, iyonomisin çalışma çözeltisinin iki mikrolitresini mümkün olduğunca çabuk her bir kuyucuğa pipetleyerek SMC büzülmesini indükleyin. Tüm hücreler uyarıldıktan sonra, ikinci pipeti kullanarak ortamı kuyucuklarda karıştırın. Deneyler arası ölçüm tekrarlanabilirliğini belirlemek için, dahil edilen tüm kontrol ve hasta hücre çizgilerinin iki bağımsız ölçümü, bu yöntemin bir aykırı hücre çizgisi dışında, güven aralığı dışında değişkenlik göstermediğini gösteren bir Bland-Altman grafiği olarak çizilmiştir.

Aynı deneyle tohumlanan ve aynı anda uyarılan iki kuyu, pratik olarak aynı sözleşmeye bağlı tepki eğrisini gösterdi. Gösterilen yanıtın iyonomisin stimülasyonu nedeniyle ozmotik stres değil de bir kasılma olup olmadığını doğrulamak için, ortam stimülasyondan sonra değiştirildi ve hücrelerin davranışı kaydedildi, bu da uyarılan hücrelerin elektrot üzerine tekrar yayılmaya başladığını gösterdi. Sağlıklı, dilate olmayan aortlardan kaynaklanan SMC'lerde kontraktil yanıt, abdominal aort anevrizması hastalarının medyan yanıtı %52'sine kıyasla %61'lik bir medyan yanıt göstermiştir.

Kontrol grubunun ortalama kontraktil yanıtı, normal değerlerden daha düşük kasılma değerlerine sahip dört hastayı tanımlamak için kullanıldı. Western blot analizi ve ardından yapılan niceleme, hücrelerin SMC belirteçlerini eksprese ettiğini doğruladı. SMC'nin proliferatif kapasitesini belirlemek için Ki67 için qPCR yapıldı.

Ki67 ekspresyonu tüm hücrelerde tespit edilebilirdi, ancak kontraktil çıktı ile korelasyon göstermedi. Hücreleri kasılma için uyarırken, aynı anda çok fazla kuyu pipet yapmamayı ve mümkün olduğunca hızlı pipet yapmaya çalışmamayı unutmayın. Bu prosedür biraz pratik gerektirebilir.

Bu yöntemi kullanarak, hastaları kasılmalarına ve normal kontraksiyonlarını düşürmelerine göre ayırdık, bu da bu hastaları ve sigara gibi klinik özelliklerine olan bağlantılarını araştırmamızı sağladı.