Name: K18 hACE2 Transgenik Farelerde Viral Enfeksiyonun Canlı Görüntülenmesi ve Raporlayıcı İfade Eden Rekombinant SARS-CoV-2 Kullanılarak Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Öğrenin, K18 hACE2 transgenik farelerde SARS-CoV-2 enfeksiyonunun canlı görüntülenmesi ve ölçülmesi için biyolüminesan ve floresan raporlayıcı kullanımını. Bu yöntem, viral dinamikleri ve tedavi yanıtlarını değerlendirmede etkilidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

COVID-19 salgını sırasında tesislerimizi tamamen çalışır durumda ve güvenli tutma çabaları için enstitümüzdeki (Texas Biomedical Research Institute) üyelere teşekkür ederiz. Ayrıca, protokollerimizi zaman açısından verimli bir şekilde gözden geçirdikleri için Kurumsal Biyogüvenlik Komitemize (IBC) ve spell'e (IACUC) teşekkür ederiz. Sina Dağı'ndaki Icahn Tıp Fakültesi'nden Dr. Thomas Moran'a SARS-CoV çapraz reaktif 1C7C7 nükleokapsid (N) protein monoklonal antikorunu sağladığı için teşekkür ederiz. Martinez-Sobrido'nun laboratuvarındaki SARS-CoV-2 araştırması şu anda NIAID / NIH hibeleri RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 ve R43AI165089-01 tarafından desteklenmektedir; Savunma Bakanlığı (DoD) W81XWH2110095 ve W81XWH2110103'ü verir; Precision Therapeutic için San Antonio Ortaklığı; Teksas Biyomedikal Araştırma Enstitüsü Forumu; San Antonio'daki Teksas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi; San Antonio Tıp Vakfı; ve NIAID tarafından finanse edilen İnfluenza Araştırma ve Müdahale Mükemmeliyet Merkezi (CEIRR, sözleşme # 75N93021C00014) tarafından finanse edilen İnfluenza Patogenezi ve İletimi Araştırma Merkezi (CRIPT) tarafından.

K18 hACE2 transgenik fareleri içeren protokoller, Teksas Biyomedikal Araştırma Enstitüsü (TBRI) Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Tüm deneyler, Ulusal Araştırma Konseyi40'ın Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki önerileri takip eder. Farelerle çalışırken uygun Kişisel Koruma Ekipmanı (KKD) gereklidir.
1. K18 hACE2 transgenik farelerin kullanımı
<ol><li>4-6 haftalık dişi B6.Cg-Tg (K18-ACE2) 2Prlmn / J fareleri (K18 hACE2 transgenik fareler) biyogüvenlik düzeyinde (BSL)-2 hayvan bakım tesisinde belirli patojensiz koşullar altında satın alın ve bakımını yapın.<ol>
<li>BSL2 tesislerine vardıktan sonra, hayvanların 7 gün boyunca alışmalarına izin verin ve enfeksiyonlar ve diğer deneysel prosedürler için BSL-3 hayvan tesisine aktarın.</li>
		<li>IACUC protokollerini takiben, kafes başına 4 fare yerleştirin. Hayvanın öldüğünden emin olmak için, rSARS-CoV-2 ile fareler enfeksiyonundan ve in vivo görüntülemeden sonra, ölümcül bir Fatal-Plus dozu (>100 mg / kg) ile hayvanları ötenazi yapın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Biyogüvenlik
NOT: Bu makalede, rSARS-CoV-2, daha önce açıklandığı gibi SARS-CoV-2 USA-WA1/2020 suşu için BAC tabanlı ters genetik sistemler kullanılarak üretilmiştir37. rSARS-CoV-2/Nluc veya rSARS-CoV-2/Venüs enfeksiyonlarını içeren tüm in vivo prosedürler, BSL-3 koşulları altında biyolojik bir güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir.
<ol><li>Bu makalede açıklanan tüm deneysel prosedürleri uygulamadan önce ve uyguladıktan sonra biyogüvenlik kabinini% 2 Wexicide ve% 70 Etanol dezenfektanı ile sırayla temizleyin.</li>
	<li>Her kullanımdan önce ve sonra tüm diseksiyon malzemelerini (makas, disseksiyon forsepsleri vb.) ve homojenizatörü sterilize edin.</li>
	<li>İzolasyon odasını temizleyin ve üreticinin talimatına göre her kullanımdan önce ve sonra MB10 tabletleri kullanarak dezenfekte edin.</li>
	<li>IBC ve IACUC yönergelerini takip eden prosedürler sırasında üretilen tüm biyolojik materyalleri atın.</li>
</ol>3. rSARS-CoV-2'nin in vivo karakterizasyonu
<ol><li>Fare enfeksiyonları<ol>
<li>Dişi 4-6 haftalık K18 hACE2 transgenik fareleri etiketli kafeslere yerleştirin, bir kulak punch kodu kullanarak her kafesteki fareleri tanımlayın ve kafes başına 4 fare yerleştirin. Vücut ağırlığı ve hayatta kalma için bir grup fareyi ve viral titrasyon ve görüntüleme için başka bir grup hayvanı kullanın.</li>
		<li>Enfeksiyondan önce, biyolüminesans sinyalini kolaylaştırmak için göğüs kafesini pektoral meme ucundan kasık meme başı bölgesine ventral tarafta tıraş edin.</li>
		<li>rSARS-CoV-2 inokulunu, steril 1x fosfat tampon salin (PBS) kullanarak steril koşullar altında toplam 50 μL hacimde 105 plak oluşturan birim (PFU)/fare ile hazırlayın. NOT: Viral seyreltmede kullanılacak rSARS-CoV-2 miktarını şu formülle hesaplayın: virüs gerekli = (fare başına 105 PFU / 50 μL) x son hacim) / stok viral titre.</li>
		<li>Virüs inokulumunu buz üzerinde soğutulmuş halde tutun.</li>
		<li>Alaycı virüslü (1x PBS) ve rSARS-CoV-2/WT ile enfekte olmuş fareleri dahili kontrol olarak kullanın. Alaycı enfekte fareleri rSARS-CoV-2 ile enfekte olmuş farelerden ayrı bir kafese yerleştirin.</li>
		<li>Bir anestezi odasında% 5 izofluran gazlı sedasyon kullanarak fareleri anestezi altına alın ve% 3 izofluran ile koruyun.</li>
		<li>Postüral reaksiyon ve sağ refleks onaylandıktan sonra, fareyi dorsal yassı pozisyona getirin.</li>
		<li>Farenin boynunu işaret parmağı ve başparmak arasında sürün ve hayvanı sırt pozisyonunda tutmak için kuyruğu pembemsi parmağınızla elin avucuna doğru tutun.</li>
		<li>50 μL virüs inokülumu içeren pipet ucunu burun deliğine yerleştirin ve çözeltiyi yavaşça çıkarın. İnokulum damlasının kaybolduğunu gözlemleyerek virüs inokulumunun solunduğundan ve reflü olmadığından emin olun.</li>
	</ol></li>
	<li>rSARS-CoV-2/Nluc ile enfekte olmuş biyolüminesans izleme K18 hACE2 transgenik fareler (Şekil 1 ve Şekil 2) NOT: Bu deney şematik gösterimi izler ve Şekil 1'de görüntülenen virüsleri kullanır. İn vivo görüntüleme sistemi (IVIS) için izofluran anestezi bağlantısı gereklidir. Gerekli enstrümanlar ve sistemler için Malzeme Tablosu'na bakınız.<ol>
<li>Görüntüleme yazılımını başlatın ve parametreleri ayarlayın, görüntü modunu Biyolüminesans olarak tıklatın, filtreyi açın ve pozlama süresini otomatik olarak ayarlayın.</li>
		<li>IVIS makinesini başlattıktan sonra, fareleri hala biyogüvenlik kabininin içindeyken izolasyon odasına yerleştirin. İzofluran içeren fareleri% 5'lik bir konsantrasyonda indükleyin. Postüral reaksiyon kaybı ve sağa doğru refleks doğrulandıktan sonra,% 3 izofluran ile devam edin.</li>
		<li>Fareler anestezi uygulandıktan sonra, onları izolasyon odasından çıkarın ve retro-orbital olarak 1x PBS'de (son hacim 100 μL / fare) 1:10 seyreltilmiş lusiferaz substratını 25 G iğne ile uygulayın.</li>
		<li>Lusiferaz substrat uygulamasından sonra, görüntüleme prosedürü sırasında hayvanı anestezi altında tutmak için fareleri göğüsleri yukarı bakacak şekilde ve burun boşluğuna manifold konisinin içine yerleştirin.</li>
		<li>İzolasyon odacığını IVIS makinesine aktarın ve IVIS görüntüleyici kapağını kapattıktan hemen sonra, başlatılacak yazılım programında Al'ı seçin (Şekil 2A).</li>
		<li>Elde edilen biyolüminesans görüntülerini analiz etmek için, hassas sinyali belirlemek ve akıyı ölçmek için yazılımdaki ROI (ilgi bölgesi) aracını kullanın (Şekil 2B).</li>
		<li>Ölçüm'e tıklayın ve sistemin çeşitli parametreler tarafından sağlanan çıktı ölçümleriyle karşılaştırılabilir mutlak foton emisyonunu sağlamak için fotonlardaki biyolüminesansı değerlendirmeye başlamasına izin verin.</li>
		<li>Enfeksiyondan 1, 2, 4 ve 6 gün sonra görüntü fareleri.</li>
		<li>Görüntülemeden sonra fareleri tekrar kafese yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>rSARS-CoV-2/Venüs ile enfekte olmuş K18 hACE2 transgenik farelerde floresan analizi (Şekil 3 ve Şekil 4) NOT: Bu deney, Şekil 3'te gösterilen şematik gösterimi ve rSARS-CoV-2'yi izler. Gerekli enstrümanlar ve sistemler için Malzeme Tablosu'na bakınız.<ol>
<li>Görüntüleme yazılımını başlatın ve parametreleri ayarlayın, uyarma (500 nm) ve emisyon filtrelerini (530 nm) ayarlayın, görüntü modunu Floresan olarak tıklayın ve pozlama süresini otomatik olarak ayarlayın.</li>
		<li>İntraperaton olarak, ölümcül bir Fatal-Plus dozu (>100 mg / kg) kullanarak fareleri ötenazi yapın. Ötanazi sonrasında, kesi yerini% 70 etanol ile dezenfekte edin.</li>
		<li>Cımbız kullanarak cildi çekin, sternumdan karnına bir kesi yapın ve kesiyi yanlardan makasla kesin. Akciğerlerdeki kan miktarını en aza indirmek ve görüntüleme sırasında yüksek arka plan sinyallerinden kaçınmak için hepatik damarı kesin.</li>
		<li>Makas kullanarak sternumu kesin ve göğüs kafesini açın. Daha sonra, trakeanın ucunu makasla kesin ve akciğerleri cımbızla çıkarın.</li>
		<li>Eksize edilen akciğerleri 2 mL 1x PBS içeren 6 delikli bir plakaya yerleştirin ve fazla kanı çıkarmak için durulayın. %70 etanol kullanarak numuneler arasındaki cerrahi aletleri dezenfekte ederek ve temizleyerek numuneler arasında kontaminasyon olasılığını en aza indirin.</li>
		<li>IVIS makinesini başlattıktan sonra, akciğerleri siyah bir tepsiye yerleştirin ve dokuları birbirinden ayırın.</li>
		<li>Tepsiyi biyogüvenlik kabininin içindeki izolasyon odasının içine yerleştirin ve ardından izolasyon odasını IVIS'e aktarın. Kapıyı kapatın ve görüntüleme sistemini başlatmak için Edin'e tıklayın (Şekil 4A).</li>
		<li>Floresanı analiz etmek için, ROI aracını kullanın ve her bir ciğerin etrafına yatırım getirisi çekin. Her bir yatırım getirisini manuel olarak ölçün ve ardından verilen ortalama radyant verimlilik değerlerini kullanın ve alay virüslü farelerinkilerden çıkarın (Şekil 4B).</li>
		<li>Görüntüleme tamamlandıktan sonra, dokuları aynı gün analiz için buzun üzerine veya daha sonra işlenmek üzere -80 ° C'de saklamak üzere kuru buz dondurma için bir kriyotüp içine yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>rSARS-CoV-2/Nluc (Şekil 2A-C) ve rSARS-CoV-2/Venüs ile enfekte olmuş K18 hACE2 transgenik farelerin akciğer parlak alan görüntülemesi ve patoloji skorlaması (Şekil 4A-C)<ol>
<li>rSARS-CoV-2 / Nluc, rSARS-CoV-2 / WT ile enfekte olmuş ve alaycı enfekte olmuş farelerin biyolüminesansını görüntüledikten sonra, fareleri kafeslerine geri döndürün. Ötanazi ve fare akciğerlerinin ex vivo parlak alan görüntülemesi ile devam edin (Şekil 2A).</li>
		<li>Enfekte farelerin akciğerlerinin ex vivo floresansını görüntüledikten sonra, akciğerlerin parlak alan görüntülerini alın (Şekil 4A).</li>
		<li>ImageJ kullanarak akciğer yüzeyindeki brüt lezyonları analiz edin (Şekil 2C ve 4C).</li>
		<li>ImageJ'de analiz edilecek akciğer görüntüsünü açın.</li>
		<li>Pikselin cm'ye oranını hesaplayın, Düz aracını kullanın ve görüntünün gerçek uzunluğunu ölçün.</li>
		<li>Seçtikten sonra, uzunluk için piksellerin uzunluğunu hesaplamak üzere Analiz > Ölçü'ye tıklayın.</li>
		<li>Analiz > Set Scale'e tıklayın ve önceki adımdan hesaplanan sayıları girin.</li>
		<li>Freehand Selections aracını kullanın ve tüm akciğer yüzeyini seçin. Toplam akciğer alanını ölçmek için Analiz > Ölç'e tıklayın.</li>
		<li>Akciğer bölgesinin geri kalanını seçmek için > Seçimini Düzenle > Ters Yap'a tıklayın, ardından arka planı kaldırmak için Delete veya back space tuşuna basın.</li>
		<li>Seçilen alanı kaldırın, ardından Görüntü > > Renk Eşiğini Ayarla'ya tıklayın.</li>
		<li>Patolojik lezyon alanını seçmek için, mevcut tıkanıklık ve kanama seviyelerine bağlı olarak Parlaklık'ı minimum (1 ila 50 arasında) ve maksimum (50 ila 200 arasında) olarak ayarlayın.</li>
		<li>Patolojik lezyonlar seçildikten sonra, eşik renk panelinin altındaki Seç'e tıklayın, ardından patolojik alanları ölçmek için Analiz > Ölçüm'e tıklayın.</li>
		<li>Brüt lezyonların yüzdesini şu formülle hesaplayın: patolojik alanın % 'si = (patolojik alanın / toplam akciğer yüzeyinin ölçümü) x 100.</li>
	</ol></li>
	<li>Viral titrasyonlar (Şekil 2D ve Şekil 4D)<ol>
<li>Görüntüleme üzerine, farelerin ötenazisini tamamlayın ve akciğerleri, beyni ve burun mukozasını toplayın.</li>
		<li>Akciğerleri, beyni ve burun mukozasını ayrı steril doku homojenizatörlerine yerleştirin ve 1 mL soğuk 1x PBS ekleyin.</li>
		<li>Pelet hücresi kalıntılarına 10 dakika boyunca 21.500 x g'de santrifüj yaparak numuneleri homojenize edin. Süpernatantları toplayın ve yeni bir steril tüpe aktarın ve peleti atın.</li>
		<li>Viral titrasyonlar aynı gün gerçekleştiriliyorsa, süpernatantları 4 °C'de saklayın. Alternatif olarak, homojenize numunelerin süpernatantını daha sonra değerlendirilene kadar -80 °C'de dondurun.</li>
		<li>Doku homojenatlarından elde edilen süpernatantların kullanılması, 10 kat seri seyreltmeler yapar ve süpernatantın her bir seyreltmesinin 1 mL'si ile Vero E6 hücrelerinin akan tek katmanlarını enfekte eder (6 kuyucuklu plaka formatı, 1.2 × 106 hücre / kuyu, üçlü).</li>
		<li>Virüsün nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 1 saat boyunca adsorbe olmasına izin verin.</li>
		<li>Viral adsorpsiyondan sonra, hücreleri 1 mL 1x PBS ile yıkayın ve nemlendirilmiş% 5 CO 2 inkübatöründe nemlendirilmiş% 5 CO 2 inkübatöründe72 saat boyunca% 1 Agar içeren 2 mL enfeksiyon sonrası ortamda inkübe edin.</li>
		<li>Kuluçkadan sonra, plakaları 4 ° C'de 24 saat boyunca% 10 nötr tamponlu formalin içinde etkisiz hale getirin, tüm plakanın suya batırıldığından emin olun.</li>
		<li>Plakaları BSL3'ten çıkarın ve hücreleri 1 mL 1x PBS ile üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 1 mL% 0.5 Triton X-100 ile geçirgenleştirin.</li>
		<li>Hücreleri, 37 ° C'de 1 saat boyunca 1 x PBS'de 1 mL% 2.5 sığır serum albümini (BSA) ile bloke edin, ardından SARS-CoV nükleokapsid (N) proteini çapraz reaktif monoklonal antikorun (1C7C7) 1 mL'lik 1 mL'lik inkübasyonu, 37 ° C'de 1 saat boyunca% 2.5 BSA'da seyreltilir.</li>
		<li>Hücreleri 1 mL 1x PBS ile üç kez yıkayın ve üreticilerin talimatlarına göre ABC kitini ve DAB Peroksidaz Substrat kitini kullanarak plakları geliştirin.</li>
		<li>Viral titreleri PFU / mL olarak hesaplayın. NOT: PFU/mL = seyreltme faktörü x plak sayısı x (1 mL/inokulum hacmi) formülü ile hesaplayın.</li>
	</ol></li>
	<li>rSARS-CoV-2/Nluc ile enfekte olmuş K18 hACE2 transgenik farelerin dokularında Nluc aktivitesi (Şekil 2E)<ol>
<li>Üreticilerin talimatlarını izleyerek bir luferaz testi kullanarak mock, rSARS-CoV-2 / WT ve rSARS-CoV-2 / Nluc ile enfekte K18 hACE2 transgenik farelerden organ homojenatlarında Nluc varlığını ölçün.</li>
	</ol></li>
	<li>Morbidite ve mortalitenin değerlendirilmesi (Şekil 2F, G ve Şekil 4E, F)<ol>
<li>4-6 haftalık dişi K18 hACE2 transgenik farelere intranazal olarak 10adet 5 PFU rSARS-CoV-2/WT, rSARS-CoV-2/Venüs, rSARS-CoV-2/Nluc veya bölüm 3.1'de açıklandığı gibi alay ile enfekte olun.</li>
		<li>Gıda alımından kaynaklanan ağırlık değişimini en aza indirmek için fareleri 12 gün boyunca aynı anda izleyin ve tartın. İnsancıl bir son noktaya ulaştıklarından beri başlangıçtaki vücut ağırlıklarının% 25'ini kaybeden fareleri ötenazi yapın ve bu fareleri viral enfeksiyona yenik düştüklerini not edin.</li>
		<li>12 gün sonra, viral enfeksiyondan kurtulan fareleri ötenazi yapın ve vücut ağırlığı değişimi ve hayatta kalma yüzdesini hesaplayın.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronavirus+biology+and+replication%3A+implications+for+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).</li>
<li>Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus-2+%28SARS-CoV-2%29%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update.</a> Cureus. 12 (3), 7423(2020).</li>
<li>Su, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology%2C+genetic+recombination%2C+and+pathogenesis+of+coronaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses.</a> Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).</li>
<li>Cui, J., Li, F., Shi, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+evolution+of+pathogenic+coronaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Origin and evolution of pathogenic coronaviruses.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019).</li>
<li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+characterisation+and+epidemiology+of+2019+novel+coronavirus%3A+implications+for+virus+origins+and+receptor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding.</a> Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).</li>
<li>Evans, J. P., Liu, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+host+factors+in+SARS-CoV-2+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of host factors in SARS-CoV-2 entry.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847(2021).</li>
<li>Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+SARS-CoV-2+with+SARS-CoV+and+influenza+pandemics%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics.</a> Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).</li>
<li>Alfaraj, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+predictors+of+mortality+of+Middle+East+Respiratory+Syndrome+Coronavirus+%28MERS-CoV%29+infection%3A+A+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Travel+Medicine+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study.</a> Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).</li>
<li>Harvey, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+variants%2C+spike+mutations+and+immune+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).</li>
<li>Dong, E., Du, H., Gardner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interactive+web-based+dashboard+to+track+COVID-19+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time.</a> Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).</li>
<li>Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARS-CoV-2+%28COVID-19%29+by+the+numbers%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers.</a> Elife. 9, 57309(2020).</li>
<li>Roussel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2%3A+fear+versus+data%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2: fear versus data.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947(2020).</li>
<li>Scialo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2%3A+One+year+in+the+pandemic.+What+have+we+learned%2C+the+new+vaccine+era+and+the+threat+of+SARS-CoV-2+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants.</a> Biomedicines. 9 (6), 611(2021).</li>
<li>Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19</a> (2021).</li>
<li>Dougan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bamlanivimab+plus+Etesevimab+in+Mild+or+Moderate+Covid-19%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19.</a> New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).</li>
<li>Ledford, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COVID+antibody+treatments+show+promise+for+preventing+severe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease.</a> Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).</li>
<li>Tuccori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+preclinical+discovery+and+development+of+bamlanivimab+for+the+treatment+of+novel+coronavirus+infection+%28COVID-19%29%3A+reasons+for+limited+clinical+use+and+lessons+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).</li>
<li>Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+inpatient+administration+of+casirivimab+and+imdevimab+antibody+cocktail+for+the+treatment+of+COVID-19+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia.</a> Cureus. 13 (5), 15280(2021).</li>
<li>O'Brien, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+REGEN-COV+antibody+combination+in+early+SARS-CoV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22medRxiv%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection.</a> medRxiv. , (2021).</li>
<li>Beigel, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remdesivir+for+the+treatment+of+Covid-19+-+Final+report%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Remdesivir for the treatment of Covid-19 - Final report.</a> New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+convalescent+plasma+therapy+on+time+to+clinical+improvement+in+patients+with+severe+and+life-threatening+COVID-19%3A+A+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial.</a> Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).</li>
<li>Polack, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+the+BNT162b2+mRNA+Covid-19+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine.</a> New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).</li>
<li>Oliver, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advisory+committee+on+immunization+practices%27+interim+recommendation+for+use+of+Pfizer-BioNTech+COVID-19+vaccine+-+United+States%2C+December+2020%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Report%22%5BJournal%5D)">The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine - United States, December 2020.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).</li>
<li>Oliver, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advisory+committee+on+immunization+practices%27+interim+recommendation+for+use+of+Janssen+COVID-19+vaccine+-+United+States%2C+February+2021%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Report%22%5BJournal%5D)">The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine - United States, February 2021.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emission+spectra+of+bioluminescent+reporters+and+interaction+with+mammalian+tissue+determine+the+sensitivity+of+detection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo.</a> Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210(2005).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
<li>Nogales, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorescent+and+bioluminescent+bireporter+Influenza+A+Virus+to+evaluate+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections.</a> Journal of Virology. 93 (10), 00032(2019).</li>
<li>Nogales, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+fluorescent-expressing+influenza+B+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus.</a> Virus Research. 213, 69-81 (2016).</li>
<li>Welsh, D. K., Noguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cellular bioluminescence imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).</li>
<li>Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+real-time+in+vivo+imaging+of+an+influenza+reporter+virus+reveals+dynamics+of+replication+and+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread.</a> Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).</li>
<li>Schoggins, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+reporter+viruses+reveal+viral+dynamics+in+interferon+receptor-deficient+mice+and+sensitivity+to+interferon+effectors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).</li>
<li>Luker, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+of+herpes+simplex+virus+type+1+infection+and+therapy+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice.</a> Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid+antiviral+screening+assay+based+on+eGFP+reporter+virus+of+Mayaro+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus.</a> Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).</li>
<li>Kirui, J., Freed, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+validation+of+a+highly+sensitive+bioluminescent+HIV-1+reporter+vector+that+simplifies+measurement+of+virus+release%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release.</a> Retrovirology. 17 (1), 12(2020).</li>
<li>Shang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+stable+eGFP+enterovirus+71+for+antiviral+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening.</a> Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).</li>
<li>Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+stable+luciferase+dengue+virus+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening.</a> Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).</li>
<li>Ye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+SARS-CoV-2+from+a+single+bacterial+artificial+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome.</a> mBio. 11 (5), 02168(2020).</li>
<li>Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+recombinant+Zika+virus+from+a+bacterial+artificial+chromosome+cDNA+clone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537(2019).</li>
<li>Chiem, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bifluorescent-based+assay+for+the+identification+of+neutralizing+antibodies+against+SARS-CoV-2+variants+of+concern+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo.</a> Journal of Virology. , (2021).</li>
<li>Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals.+8th+edn%5BTitle%5D)+AND+%22National+Research+Council+%28US%29%22%5BJournal%5D)">Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn.</a> National Research Council (US). , National Academies Press. (2011).</li>
<li>Ye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+SARS-CoV-2+infection+dynamic+in+vivo+using+reporter-expressing+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).</li>
</ol>

Yazarlar, araştırmanın açıklanan çalışma ile ilgili olarak herhangi bir ticari, finansal ve finansal olmayan veya kişisel çıkar çatışması olmaksızın yürütüldüğünü beyan eder.

Bu protokol, viral enfeksiyonları in vivo izlemek için muhabir genlerini eksprese eden bu rSARS-CoV-2'yi kullanmanın fizibilitesini göstermektedir. Her iki muhabir eksprese eden rekombinant virüs, SARS-CoV-2 enfeksiyonlarını in vivo olarak incelemek için mükemmel bir araç sağlar. Tanımlanan ex vivo (rSARS-CoV-2/Venüs) ve in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) görüntüleme sistemleri, SARS-CoV-2 enfeksiyonunun dinamiklerini, viral patogenezi anlamak ve viral enfeksiyondan sonra farklı zamanlarda enf...

Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2), Coronaviridae ailesindeki Betacoronavirus soyuna ait zarflı, pozitif anlamlı, tek sarmallı bir RNA virüsüdür1. Bu viral aile Alfa, Beta, Gama ve Delta-koronavirüs1'e ayrılmıştır. Alfa ve Betakoronavirüsler esas olarak memelileri enfekte ederken, Gama ve Deltakoronavirüs neredeyse sadece kuşları enfekte eder2. Bugüne kadar, yedi koronavirüs (CoV) tür bariyerlerini aştı ve insan koronavirüsleri (HCoV) olarak ortaya çıktı: iki alfa-CoVs (HCoV-229E ve HCoV-NL63) ve beş beta-CoVs (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, Orta Doğu solunum sendromu koronavirüs [MERS-CoV] ve SARS-CoV-2) 3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV ve SARS-CoV-2 oldukça patojeniktir ve ciddi alt solunum yolu enfeksiyonuna neden olur7. SARS-CoV-2'nin ortaya çıkmasından önce, CoV'lerin neden olduğu iki salgın salgın vardı: 2002-2003 yılları arasında Çin'in Guangdong Providence kentinde SARS-CoV, vaka ölüm oranı (CFR) yaklaşık% 9.7; ve 2012'den günümüze kadar Orta Doğu'da MERS-CoV, yaklaşık% 34'lük bir CFR ile 7,8. SARS-CoV-2, genel CFR'nin% 3.4 ila% 49 arasında bir CFR'ye sahiptir ve altta yatan koşullar daha yüksek bir CFR 8,9'a katkıda bulunur. SARS-CoV-2, Aralık 2019'da Çin'in Wuhan kentinde keşfinden bu yana, dünya çapında 242 milyondan fazla insan enfeksiyonundan ve4,9 milyondan fazla insan ölümünden 7,10,11,12 sorumludur. Özellikle, 2020'nin sonlarından bu yana, yeni SARS-CoV-2 endişe varyantları (VoC) ve ilgi çekici varyantlar (VoI), bulaşma ve antijenite 9,13 ve COVID-19 pandemisinin genel yönü dahil olmak üzere virüs özelliklerini etkilemiştir. SARS-CoV-2 enfeksiyonlarının tedavisi için şu anda sadece bir Amerika Birleşik Devletleri (ABD) bulunmaktadır. Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) terapötik antiviral (remdesivir) ve bir Acil Kullanım İzni (EUA) ilacı (baricitinib, remdesivir ile kombinasyon halinde uygulanacak)14. Ayrıca 6 onaylı EUA monoklonal antikoru vardır: REGEN-COV (birlikte uygulanan casirivimab ve imdevimab), sotrovimab, tocilizumab ve bamlanivimab ve etesevimab birlikte uygulanır 15,16,17,18,19. Şu anda sadece bir FDA onaylı profilaktik aşı olan Pfizer-BioNTech ve diğer iki profilaktik aşı (Moderna ve Janssen) EUA onaylı 20,21,22,23,24 olmuştur. Bununla birlikte, kontrolsüz enfeksiyon oranı ve VoC ve VoI'nin ortaya çıkmasıyla SARS-CoV-2 hala insan sağlığı için bir tehdit oluşturmaktadır. Bu nedenle, SARS-CoV-2 enfeksiyonunu ve halen devam eden COVID-19 pandemisini kontrol etmek için etkili profilaktik ve terapötikleri tanımlamak için acilen yeni yaklaşımlara ihtiyaç vardır.
SARS-CoV-2'yi incelemek, enfekte hücrelerde ve / veya doğrulanmış hayvan enfeksiyon modellerinde virüsün varlığını tanımlamak için zahmetli teknikler ve ikincil yaklaşımlar gerektirir. Ters genetiğin kullanımı, viral enfeksiyonların biyolojisindeki önemli soruları cevaplamak için rekombinant virüslerin üretilmesine izin vermiştir. Örneğin, ters genetik teknikler viral enfeksiyon, patogenez ve hastalık mekanizmalarını ortaya çıkarmak ve anlamak için araçlar sağlamıştır. Benzer şekilde, ters genetik yaklaşımlar, viral patogenezdeki katkılarını anlamak için viral proteinlerden yoksun rekombinant virüslerin mühendisliğinin yolunu açmıştır. Ek olarak, viral enfeksiyonların tedavisi için profilaktik ve / veya terapötik yaklaşımların belirlenmesi de dahil olmak üzere, in vitro ve in vivo uygulamalar için muhabir genlerini eksprese eden rekombinant virüsler üretmek için ters genetik teknikleri kullanılmıştır. Floresan ve biyolüminesan proteinler, hassasiyetleri, stabiliteleri ve yeni teknolojilerin geliştirilmesine dayanan kolay tespitleri nedeniyle en sık kullanılan muhabir genleridir25,26. In vitro, floresan proteinlerin enfekte hücrelerde virüslerin lokalizasyonu için daha iyi bir seçenek olarak hizmet ettiği gösterilmiştir, lusiferazlar ise niceleme çalışmaları için daha uygundur27,28,29. İn vivo, lusiferazlar tüm hayvan görüntülemede floresan proteinlere göre tercih edilirken, enfekte hücrelerin tanımlanmasında veya ex vivo görüntülemede floresan proteinler tercih edilir30,31,32. Muhabir tarafından ifade edilen rekombinant virüslerin kullanımı, flavivirüsler, enterovirüsler, alfavirüsler, lentivirüsler, arenavirüsler ve influenza virüsleri 28,33,34,35,36 dahil olmak üzere birçok ailedeki virüslerin incelenmesi için güçlü bir araç olarak hizmet etmiştir.
SARS-CoV-2'yi incelemek ve gerçek zamanlı SARS-CoV-2 enfeksiyonunu in vivo olarak karakterize etmek için ikincil yaklaşımlara duyulan ihtiyacın üstesinden gelmek için, E. coli'de tek bir kopya olarak tutulan daha önce tanımlanmış bakteriyel yapay kromozomlarımızı (BAC) tabanlı ters genetiğimizi kullanarak biyolüminesan (nanolusiferaz, Nluc) veya floresan (Venüs) proteinlerini eksprese eden replikasyon yetkin rekombinant (r) SARS-CoV-2 ürettik. bakterilerde yayılması sırasında virüs dizilerinin toksisitesini en aza indirmek için37,38. Özellikle, rSARS-CoV-2 / Nluc ve rSARS-CoV-2 / Venüs, rSARS-CoV-2 / WT benzeri patojeniteyi in vivo olarak göstermiştir. rSARS-CoV-2 / Venüs'ten gelen yüksek Venüs ekspresyonu seviyesi, enfekte K18 hACE2 transgenik farelerin akciğerlerinde viral enfeksiyonun in vivo görüntüleme sistemi (IVIS) 39 kullanılarak tespit edilmesine izin verdi. Venüs ekspresyon seviyeleri, akciğerlerde tespit edilen viral titrelerle iyi korelasyon gösterdi ve Venüs ekspresyonunun SARS-CoV-2 enfeksiyonunun geçerli bir vekili olarak kullanılmasının fizibilitesini gösterdi. rSARS-CoV-2 / Nluc kullanarak, viral enfeksiyonun dinamiklerini gerçek zamanlı olarak izleyebildik ve K18 hACE2 transgenik farelerde aynı IVIS yaklaşımını kullanarak SARS-CoV-2 enfeksiyonunu in vivo olarak uzunlamasına değerlendirebildik.

<table><tbody><tr><td>% 0.5 Triton X-100</td><td>J.T.Baker</td><td>X198-07</td><td>Oda sıcaklığında saklayın (RT)</td></tr><tr><td>% 1 DEAE-Dextran</td><td>MP Biyomedikaller</td><td>195133</td><td></td></tr><tr><td>% 10 Formalin çözeltisi, nötr tamponlu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Oxoid</td><td>LP0028</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu Hücre Kültürü Plakası</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>% 5 Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu Hücre Kültürü Plakası</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu Hücre Kültürü Plakası</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>Afrika yeşil maymun böbrek epitel hücreleri (Vero E6)</td><td>ATCC</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr><tr><td>Ami HT</td><td>Spektral Aletler Görüntüleme</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aurası Görüntüleme Yazılımı 3.2.0</td><td>Spectral Instruments Görüntüleme</td><td></td><td>Görüntü analiz yazılımı</td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA),% 35</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>4 & deg'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Hücre kültürü sınıfı su</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta (DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td>4 &°C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Anestezi gaz makinesi</td><td>Veteriner Anestezi Sistemleri A.Ş.</td><td>VAS 2001R</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-050</td><td>-20 °C Mağazası; C</td></tr><tr><td>Dört ila altı haftalık dişi K18-hACE2 transgenik fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prizma Sürüm 9.1.0</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td>RT'de</td></tr><tr><td>Mağaza MARS Veri Analiz Yazılımı</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MB10 tabletler</td><td>QUIP Laboratuvarları</td><td>MBTAB1.5</td><td>RT'de Mağaza</td></tr><tr><td>Nano-Glo Luciferase Test Reaktifi</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td>Bu reaktif, Nluc aktivitesini ölçmek için kullanılır. -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96 Kuyulu</td><td>Mikroplakalar ThermoFisher Scientific</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96 Kuyulu Mikroplakalar</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin / L-Glutamin (PSG) 100x</td><td>Corning</td><td>30-009-CI</td><td>-20 & ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>PHERAstar FSX</td><td>BMG LABTECH</td><td>PHERAstar FSX</td><td></td></tr><tr><td>Precelleys Evolution homojenizatör</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000062-PEVO0-A</td><td></td></tr><tr><td>Yumuşak doku homojenleştirici CK14 & ndash 7 mL</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000940-LYSK0-A</td><td></td></tr><tr><td>T75 EasYFlask</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC-HRP Kiti, Peroksidaz</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>PK-4002</td><td>ABC kiti ve DAB Peroksidaz Substrat kiti</td></tr></tbody></table>

k18 hace2 transgenik farelerde viral enfeksiyonun canlı görüntülenmesi ve raporlayıcı İfade eden rekombinant sars-cov-2 kullanılarak Ölçülmesi

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19) pandemisine şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) neden olmuştur. SARS-CoV-2, bugüne kadar dünya çapında 242 milyondan fazla enfeksiyondan ve 4,9 milyondan fazla ölümden sorumlu olmuştur. Diğer virüslere benzer şekilde, SARS-CoV-2'yi incelemek, enfekte olmuş hücrelerde ve / veya hayvan modellerinde virüs varlığını tespit etmek için deneysel yöntemlerin kullanılmasını gerektirir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, biyolüminesan (nanoluferaz, Nluc) veya floresan (Venüs) proteinlerini eksprese eden replikasyon yetkin rekombinant (r) SARS-CoV-2 ürettik. Bu muhabir eksprese eden rSARS-CoV-2, Nluc ve Venüs muhabir genlerinin ekspresyonuna dayanarak in vitro ve in vivo viral enfeksiyonların izlenmesine izin verir. Burada çalışma, daha önce tarif edilen K18 insan anjiyotensin dönüştürücü enzim 2 (hACE2) transgenik fare enfeksiyon modelinde in vivo görüntüleme sistemleri (IVIS) kullanarak SARS-CoV-2 enfeksiyonunu tespit etmek ve izlemek için rSARS-CoV-2 / Nluc ve rSARS-CoV-2 / Venüs'ün kullanımını açıklamaktadır. Bu rSARS-CoV-2/Nluc ve rSARS-CoV-2/Venüs, rSARS-CoV-2/WT benzeri patojeniteyi ve viral replikasyonu in vivo olarak göstermektedir. Önemli olarak, Nluc ve Venüs ekspresyonu, enfekte farelerde viral enfeksiyonları in vivo ve ex vivo olarak doğrudan izlememize izin verir. Bu rSARS-CoV-2/Nluc ve rSARS-CoV-2/Venüs, SARS-CoV-2'nin biyolojisini in vivo olarak incelemek, viral enfeksiyonu ve ilişkili COVID-19 hastalığını anlamak ve SARS-CoV-2 enfeksiyonuyla mücadele etmek için etkili profilaktik ve/veya terapötik tedavileri tanımlamak için mükemmel bir seçeneği temsil etmektedir.

K18 hACE2 transgenik farelerde rSARS-CoV-2/Nluc enfeksiyonu (Şekil 1 ve 2) Şekil 1A, in vivo enfeksiyonları değerlendirmek için kullanılan rSARS-CoV-2/WT (üstte) ve rSARS-CoV-2/Nluc (altta) modellerinin şematik bir temsilini göstermektedir. Şekil 1B, K18 hACE2 transgenik farelerde rSARS-CoV-2 / Nluc enfeksiyon dinamiklerini değerlendirmek için uygulanan şematik akış şemasını göstermekted...

Bu protokol, SARS-CoV-2 enfeksiyonlarını in vivo olarak incelemek için gereken ikincil yaklaşımların ihtiyacının üstesinden gelmek için K18 hACE2 transgenik farelerde lusiferaz ve floresan eksprese eden rekombinant (r) SARS-CoV-2 ve bir in vivo görüntüleme sistemi (IVIS) kullanarak viral enfeksiyonların dinamiklerini açıklamaktadır.

K18 hACE2 Transgenik Farelerde Viral Enfeksiyonun Canlı Görüntülenmesi ve Raporlayıcı İfade Eden Rekombinant SARS-CoV-2 Kullanılarak Ölçülmesi

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Protokolümüz, SARS-CoV-2 enfeksiyonunun K18 insan ACE2 transgenik fare modelinde in vivo ve ex vivo canlı görüntüleme viral tespiti ve viral izleme için floresan veya ışıldayan eksprese eden rekombinant SARS-CoV-2'nin kullanımını tanımlamıştır. Bu tekniğin temel avantajı, K18 insan ACE2 transgenik fare modelinde SARS-CoV-2'nin in vivo ve ex vivo çalışmaları için viral tespitin ve izlemenin uygulanması ve fizibilitesinedir. K18 insan ACE2 transgenik fare modelinde SARS-CoV-2'nin in vivo görüntülenmesinin kullanılması, SARS-CoV-2 enfeksiyonunun in vivo tedavisi için terapötikleri değerlendirmek için mükemmel bir seçenek sunmaktadır.SARS-CoV-2 muhabirlerinin uygulanması, patojeniteyi, viral replikasyonu ve trofizmi in vivo olarak değerlendirmek için mükemmel bir seçenek sunmaktadır. SARS-CoV-2'yi eksprese eden lusiferaz ile yapılan in vivo çalışmalar için, biyolüminesans sinyalini iyileştirmek için farelerin tıraş edilmesi ve substrat enjeksiyonundan sonra hızlı görüntüleme yapılması önerilir. İn vivo görüntüleme sistemini veya IVIS'i başlatarak ve parametreleri ayarlayarak biyolüminesans izlemeye başlayın, görüntü modunu Biyolüminesans olarak tıklayın, ardından filtreyi açın ve pozlama süresini Otomatik olarak ayarlayın.Daha sonra, önceden traş edilmiş ve anestezi uygulanmış bir fareyi izolasyon odasından çıkarın ve PBS'de 1 ila 10 oranında seyreltilmiş lusiferaz substratının 100 mikrolitresini fareye retro-orbital olarak uygulamak için 25 gauge iğne kullanın. Ardından fareyi tekrar izolasyon odasına yerleştirin, izolasyon odasını hipotermiyi önlemek için bir ısıtma bileşeni ile donatılmış IVIS makinesine aktarın ve yazılım programında Al'ı seçerek görüntülemeyi başlatmak için IVIS görüntüleyici kapağını kapatın. Elde edilen biyolüminesans görüntülerini analiz etmek için, hassas sinyali belirlemek ve akıyı ölçmek için yazılımdaki ROI veya ilgi alanı aracını kullanın.Görüntüleme yazılımını başlatın ve parametreleri ayarlayın. Görüntü modunu Floresan olarak tıklayın, uyarımı 500 nanometrede ve emisyon filtrelerini 530 nanometrede ayarlayın ve maruz kalma süresini Otomatik olarak ayarlayın.Eksize edilmiş akciğerleri iki mililitre 1X PBS içeren 6 delikli bir plakaya yerleştirin ve fazla kanı çıkarmak için durulayın. %70 etanol kullanarak numuneler arasındaki ameliyat aletlerini dezenfekte edin ve temizleyin. IVIS makinesini başlattıktan sonra, akciğerleri siyah bir tabakaya yerleştirin ve dokuları birbirinden ayırın.Daha sonra tepsiyi biyogüvenlik kabininin içindeki izolasyon odasının içine yerleştirin ve ardından izolasyon odasını IVIS'e aktarın. IVIS görüntüleyici kapağını kapatın ve görüntüleme sistemini başlatmak için Al'a tıklayın. Floresanı analiz etmek için, ROI aracını kullanın ve her bir ciğerin etrafına yatırım getirisi çekin.Her yatırım getirisini manuel olarak ölçün ve ardından verilen ortalama radyant verimlilik değerlerini kullanın ve alay virüslü farelerden çıkarın. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, dokuları daha sonra işlenmek üzere eksi 80 santigrat derecede saklamak üzere kuru buz dondurma için bir kriyotüp içine yerleştirin. Doku homojenatlarından elde edilen süpernatı kullanarak, on kat seri seyreltme gerçekleştirin ve Vero E6 hücrelerinin akan tek katmanlarını, üçlü olarak her bir süpernatant seyreltmenin bir mililitresi ile enfekte edin.Virüsün nemlendirilmiş% 5 karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede bir saat boyunca adsorbe olmasına izin verin. Bir kez yapıldıktan sonra, hücreleri bir mililitre 1X PBS ile yıkayın ve daha sonra hücreleri, nemlendirilmiş% 5 karbondioksit inkübatöründe 72 saat boyunca 37 santigrat derecede nemlendirilmiş% 1 agar içeren% 1 agar içeren iki mililitre enfeksiyon sonrası ortamda inkübe edin. Kuluçkadan sonra, plakaları% 10 nötr tamponlu formalin içinde 24 saat boyunca dört santigrat derecede inaktive ederek tüm plakanın suya batırılmasını sağlayın.Plakaları biyogüvenlik seviyesi üçten çıkarın ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir mililitre% 0.5 Triton X-100 ile üç kez yıkayın. Daha sonra, geçirgenleştirilmiş hücreleri 37 santigrat derecede bir saat boyunca bir mililitre 2.5 sığır serum albümini veya BSA ve PBS ile bloke edin, ardından 37 santigrat derecede bir saat boyunca 2.5 BSA'da seyreltilmiş SARS-CoV nükleokapsid proteini çapraz reaktif monoklonal antikoru 1C7C7'nin mililitre başına bir mililitre bir mikrogramda inkübasyon. Hücreleri bir mililitre 1X PBS ile üç kez yıkayın ve üreticinin talimatlarına göre ABC ve diaminobenzen veya DAB, peroksidaz substrat kitlerini kullanarak plakları geliştirin, ardından viral titreleri mililitre başına plak oluşturan birimler olarak hesaplayın.Çalışmada, biyolüminesan nanolusiferaz veya Nluc'un kolayca tespit edildiği ve farelerin rSARS-CoV-2 Nluc ile enfekte olduğu, ancak rSARS-CoV-2 vahşi tip veya sahte enfekte olanların enfekte olmadığı gözlenmiştir. Kantitatif analizler, enfeksiyon sonrası farklı günlerde Nluc yoğunluğunu gösterdi. rSARS-CoV-2 Nluc ile enfekte olmuş farelerin akciğer yüzeyindeki brüt lezyonlar, rSARS-CoV-2 vahşi tip enfekte gruptakilerle karşılaştırılabilirdi.Ek olarak, viral titreler tespit edildi ve rSARS-CoV-2 Nluc ile enfekte olmuş fareler, enfeksiyondan sonraki farklı günlerde tüm organlarda rSARS-CoV-2 vahşi tipi ile enfekte olanlarla karşılaştırılabilirdi. Aynı zamanda, Nluc aktivitesi sadece rSARS-CoV-2 Nluc ile enfekte olmuş farelerin organlarında tespit edildi. Ayrı bir sahte enfekte ve virüs bulaşmış fare grubu, vücut ağırlığı ve sağkalımındaki değişiklikler için 12 gün boyunca izlendi.rSARS-CoV-2 Nluc ve rSARS-CoV-2 vahşi tipi ile enfekte olmuş fareler vücut ağırlıklarının% 25'ini kaybetti ve hepsi enfeksiyondan yedi ila sekiz gün sonra viral enfeksiyona yenik düştü. rSARS-CoV-2 Venüs enfeksiyonundan sonra, Venüs ekspresyonu, rSARS-CoV-2 Venüs ile enfekte olmuş farelerin tüm akciğerlerinde kolayca tespit edildi, ancak rSARS-CoV-2 vahşi tipi veya sahte enfekte olanlarla enfekte olmayanlar tespit edilmedi. Kantitatif analizler, Venüs yoğunluğunun enfeksiyondan iki gün sonra zirveye ulaştığını ve enfeksiyon ve enfekte farelerin akciğerleri boyunca azaldığını gösterdi.Akciğer yüzeyinin görüntüleri, rSARS-CoV-2 Venüs ile enfekte olmuş farelerin brüt lezyonlarının, rSARS-CoV-2 vahşi tip enfekte farelerinkiyle karşılaştırılabilir olduğunu ortaya koydu. Ayrıca, rSARS-CoV-2 Venüs enfeksiyonu, tüm organlarda rSARS-CoV-2 vahşi tipi ile enfekte olmuş farelerde gözlenenlerle karşılaştırılabilir viral titrelerle sonuçlandı. rSARS-CoV-2 Venüs ve rSARS-CoV-2 vahşi tipi ile enfekte olmuş fareler, vücut ağırlıklarının% 25'ini kaybetti ve enfeksiyon sonrası dokuzuncu günde hayatta kalma olmadan viral enfeksiyona yenik düştü.SARS-CoV-2'yi ifade eden muhabirin sonuçları, viral enfeksiyonun geçerli vekilleri olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, bu, SARS-CoV-2 enfeksiyonunun tedavisi için karşı önlemlerin hızlı bir şekilde tanımlanmasına ve değerlendirilmesine yol açabilir.

live-imaging-quantification-viral-infection-k18-hace2-transgenic-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Synaptically bağlı nöronların izleme için bir yöntem tarif edilmektedir. Biz bir ilgi hücre popülasyonu tanımlı genetik hücre tiplerinden sinaptik girdi alıp almadığını soruşturma yönündeki bir hücrenin TVA özgüllüğü kullanın.

Genetiği Tanımlı Nöral Devre arasında Tracing Viral

Source: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the procedure for infecting mammalian cells with green fluorescent protein (GFP)-encoding pseudovirus, monitoring viral replication and spread by fluorescence microscopy, and collecting virus-containing supernatant for downstream applications.

Production and Collection of Pseudovirus Particles Using Mammalian Cell Culture

Source: Morales Vasquez, D., et al. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the protocol for carrying out plaque assay–based viral titration for quantifying infectious virus levels in tissue sample collected from a virus–infected mouse model.

Plaque Assay–Based Quantification of Viral Load in an Infected Mouse Tissue Sample

Bu videoda, rekombinant lusiferaz ve floresan protein eksprese eden bi-raportör Influenza A virüsü kullanılarak fare modellerinde viral enfeksiyonları izlemek için bir yöntem gösterilmektedir. Bu yöntem, hem in vivo hem de ex vivo çalışmalara olanak tanıyarak araştırmacıların viral dinamikler ve müdahalelerin etkileri hakkında bilgi edinmelerini sağlar.

Viral Enfeksiyonları İzlemek için Bir Luciferase-Floresan Muhabir İnfluenza Virüsü

Bu video, SARS-CoV-2 subgenomik RNA'nın uzamsal dağılımını görselleştirmek için Hibridizasyon Zincir Reaksiyonu (HCR)-Floresan Yerinde Hibridizasyon (FISH) uygulamasını göstermektedir. HCR'yi immünofloresan teknikleriyle birleştirmek, tek hücre düzeyinde konak-virüs etkileşimleri hakkında bilgi sağlama potansiyeline sahiptir.

SARS-CoV-2'yi Görselleştirmek için İmmüno-RNA Floresan In Situ Hibridizasyonun Kullanılması

Bu spektral farklı raportör florofor safha spesifik ifadesi ile bir viral enfeksiyon ve gen ifadesinin gerçek zaman ölçümünü sağlayan bir flüoresan raportör ineklerdeki çiçek hastalığı virüsünün kullanımını tarif eder. Bu detay doğru virüs çoğaltma, küçük moleküllü inhibisyonuna yanıt olarak etkilendiği aşama belirlenmesi için, bir plaka-bazlı yöntem.

Gen İfade Tüm Dönemlerinde Viral Fonksiyonu sayısallaştırabilmek için vaksiniya Reporter Virüsler

Influenza A virüsleri (IAVs) yıllık salgınlara ve ara sıra salgınlara neden olan bulaşıcı solunum patojenleridir. Burada, yeni bir rekombinant luciferase ve floresan ifade iki muhabir IAV (BIRFLU) kullanarak vivo viral enfeksiyonları izlemek için bir protokol açıklar. Bu yaklaşım in vivo IAV çalışma için mükemmel bir araç ile araştırmacılar sağlar.

Canlı Görüntüleme ve Viral Enfeksiyon Quantification için Bir Luciferase-floresan Reporter Grip Virüsü

Burada, şiddetli akut solunum sendromu coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA'yı görselleştirmek için RNA floresan in situ hibridizasyonunu (RNA-FISH) immünofluoresans ile birleştiren basit bir yöntemi açıklıyoruz. Bu protokol, SARS-CoV-2 RNA konakçı etkileşimlerinin moleküler özelliklerinin tek hücre düzeyinde anlaşılmasını artırabilir.

Immuno RNA-Floresan In Situ Hibridizasyonu Kullanılarak SARS-CoV-2'nin Görselleştirilmesi

Burada açıklanan protokol, sars-CoV-2 spike proteinine karşı nötralize edici antikorları ölçmek için hızlı ve etkili bir yöntemi özetlemektedir, iyileşen serum örneklerinin gelişmiş yeşil floresan protein etiketli veziküler stomatit virüsü psödotip ile enfeksiyonu inhibe etme yeteneğini değerlendirerek spike glikoprotein ile.

Psödovirüs Enfeksiyonunun Yüksek Verimli Floresan Görüntülemesi Kullanılarak SARS-CoV-2 Nötralize Edici Antikorların Tespiti

Bu protokolde, rekombinant SARS-CoV-2 spike'a konjuge edilen kuantum noktaları, hücre bazlı testlerin, plazma zarındaki hACE2'ye ve ardından bağlı proteinlerin sitoplazmaya endositozunu izlemek için hücre bazlı tahlilleri izlemesini sağlar.

HEK293T Hücrelerinde Bağlanma ve Endositozu İzlemek için Kuantum Nokta Konjuge SARS-CoV-2 Spike Trimerlerinin Yüksek Verimli Konfokal Görüntülemesi

Burada, yetişkin farelerde adeno-ilişkili virüsü (AAV) sistemik olarak uygulamak için fare lateral kuyruk veni enjeksiyonu için optimize edilmiş bir protokolü detaylandırıyoruz. Ek olarak, AAV transdüksiyonunu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan tahlillerin protokollerini açıklıyoruz.

Yetişkin farelerde lateral kuyruk veni enjeksiyonu yoluyla adeno ilişkili virüsün tutarlı bir şekilde verilmesi

Öğrenin, K18 hACE2 transgenik farelerde SARS-CoV-2 enfeksiyonunun canlı görüntülenmesi ve ölçülmesi için biyolüminesan ve floresan raporlayıcı kullanımını. Bu yöntem, viral dinamikleri ve tedavi yanıtlarını değerlendirmede etkilidir.

K18 hACE2 Transgenik Farelerde Viral Enfeksiyonun Canlı Görüntülenmesi ve Raporlayıcı İfade Eden Rekombinant SARS-CoV-2 Kullanılarak Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal

K18 hACE2 Transgenik Farelerde Viral Enfeksiyonun Canlı Görüntülenmesi ve Raporlayıcı İfade Eden Rekombinant SARS-CoV-2 Kullanılarak Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet