Sıralı Capillarity destekli Montaj yoluyla Mikroorganizmaların ve Mikropartiküllerin Deseni
November 4th, 2021
Bakteri ve kolloidler gibi bir sıvıda asılı mikro boyutlu nesneleri polidimetilsiloksisan substratında öngörülen dizilere desenleştirmek için mikroakışkan bir platformda kapilarite destekli montaj kullanan bir teknoloji sunuyoruz.
Bu yöntem, mikroakışkan bir kanal içinde kullanıcı tanımlı mikroorganizma kalıplarının üretilmesini sağlar. Desenlendikten sonra, mikroorganizmalar uzun vadeli fizyolojilerini ve yüksek verimle etkileşimlerini değerlendirmek için izlenebilir. Kılcal kuvvetlerin kullanılması, farklı malzeme sınıflarına uygulanabilir olan modelleme için spesifik olmayan bir rota sağlar.
Örneğin, kolloidal parçacıklar ve bakteriler. Dahası, ilgilenilen malzemenin mekansal düzenlemesinin zarif kontrolü ile büyük diziler üretilmesine izin verir. Bugüne kadar, yöntemi kolloidal parçacıklar ve mikrobiyal hücreler üzerinde test ettik ve uyguladık.
Sonuç olarak, malzeme mühendisliğinde ve ilaç taraması gibi nicel tek hücreli analiz gerektiren alanlarda uygulamalar bulabilir. Başlamak için, elastomeri çapraz bağlama maddesi ile karıştırarak bir PDMS karışımı hazırlayın. Ardından, hava kabarcıkları oluşana ve PDMS karışımı opak görünene kadar iki bileşeni eşit şekilde karıştırmak için karışımı kuvvetlice karıştırın.
Şimdi, tüm hava kabarcıkları giderilene ve karışım tekrar şeffaf görünene kadar karışımı vakumlu bir kurutucuda gazdan arındırın. Mikroakışkan çipin 400 mikrometre kalınlığında bir şablon zeminini elde etmek için, karışımın üç gramını silikon ustanın üzerine dökün ve silikon ustayı beş saniye boyunca 21 kez G'de ve 10 saniye boyunca 54 kez G'de döndürmek için bir spin kaplayıcı üzerine yerleştirin. Daha önce açıklandığı gibi sıkışmış hava kabarcıklarını gidermek için tekrar gaz verin.
Mikroakışkan çipin çatısı olarak hizmet edecek olan mikrokanalı yapmak için 20 gram PDMS karışımını 3D baskılı kalıba dökün ve daha önce açıklandığı gibi 30 dakika boyunca gazdan arındırın. Silikon gofreti ve 3D baskılı kalıbı en az iki saat boyunca 70 santigrat derecede pişirin, ardından PDMS'yi 3D baskılı kalıbın ana hatları boyunca kesin ve soyun. PDMS'yi mikrokanalların etrafında bir bıçakla kesin ve mikroakışkan kanalın giriş ve çıkışı olarak işlev görecek delikleri delin.
Şimdi PDMS'yi kesin ve silikon master'dan çıkarın ve PDMS katmanını, şablonların üzerine bağlanacak mikroakışkan kanalların aynı boyutlarına sahip daha küçük parçalara ayırın. Şablonları ve mikro kanalları beş dakika boyunca% 1'lik bir deterjan çözeltisi kullanarak nazikçe ovalayın ve ardından deiyonize suyla durulayın. Daha sonra, şablonları ve mikro kanalları deiyonize suyla durulamadan önce izopropanol ile durulayın.
Şimdi şablonları ve mikro kanalları oda sıcaklığında bir barda basınçlı hava ile bir dakika kurulayın. Şablonları ve mikro kanalları, yapıştırma yüzeyleri yukarı bakacak şekilde bir plazma temizleyiciye yerleştirin. Plazma temizleyiciyi açtıktan sonra, plazma şablonları ve mikro kanalları 40 saniye boyunca işlemden geçirir, ardından bunları plazma temizleyiciden çıkarın ve mikro kanalları hemen şablonların üzerine bağlayın.
PDMS hidrofobik iyileşmesini sağlamak için mikroakışkan çipleri beş gün boyunca 70 santigrat derecede bir fırında saklayın. Deney gününde, kutu inkübatörünü deneyden birkaç saat önce 37 santigrat dereceye ayarlayın, ardından şırınga pompasını ve ısıtılmış cam plakayı mikroskop aşamasına ayarlayarak kutu inkübatörününkiyle aynı sıcaklığı ayarlayın. Deneyden 90 dakika önce, mikroakışkan çipi% 100 etanol ile dolu bir kaba koyun ve kanalı% 100 etanol ile en az 10 dakika boyunca yıkayın, ardından mikroakışkan çipi vakumlu bir kurutucuya yerleştirin ve en az 30 dakika boyunca gazdan arındırın.
Şimdi etanolün damıtılmış suyla değiştirilmesi ve çipin vakumla en az 30 dakika arıtılması. Kanalda kalan sıvı izlerini gidermek için mikroakışkan çipi 10 dakika boyunca 70 santigrat derecede fırına koyun. Bir mililitre MOPS ortamını bir santrifüj şişesine pipetleyin ve 10 mikrolitre 0.132 molar potasyum fosfat ekleyin.
Aliquot gece kültürünün 100 mikrolitresini santrifüj şişesine ve kültürü iki dakika boyunca 2.300 kez G'de santrifüj edin. Peleti % 0.015 Tween 20 ve% 0.01 potasyum fosfat ile% 0.01 taze MOPS ortamında yeniden askıya almak için süpernatantı yavaşça atın ve bakteriyel süspansiyonu bir mililitrelik bir şırıngaya yükleyin. Şırıngayı ve boru bağlantısını sabitlemek için, doğrudan boruya bir iğne yerleştirin.
Şimdi şırıngayı şırınga pompasına monte edin ve süspansiyon, süspansiyon şablon bölgesini tuzaklarla kaplayana kadar kanalın yukarı akış kısmında bulunan girişten mikroakışkan çipe enjekte edin. Bakteriyel süspansiyonu geri çekmek ve modelleme işlemini mikroskop yazılımı aracılığıyla izlemek için şırınga pompasını dakikada 0,07 ila 0,2 mikrolitre akış hızına ayarlayın. Şablon hücrelerle desenlendikten sonra, mikroakışkan kanalı hızlı bir şekilde boşaltmak için geri çekilme akış hızını artırın ve daha önce en az 30 dakika boyunca gazdan arındırılmış ve 30 santigrat derecede önceden ısıtılmış taze LB ile yıkayın.
Şimdi kanalı nazikçe yıkamak için şırınga pompasını dakikada iki mikrolitrelik bir akış hızına ayarlayın. Kanal doldurulduktan sonra, akış hızını tekrar artırın. İstenilen büyütme ve zaman aralığında büyüyen bakterilerin görüntülerini elde edin.
Pipet 900 mikrolitrelik %0,015'lik bir ara 20 sulu çözeltiyi bir santrifüj şişesine ve ardından orijinal kolloidal süspansiyonun 100 mikrolitresini pipetle içine yerleştirin. Süspansiyonu bir dakika boyunca 13.500 kez G'de santrifüj yapın ve süpernatantı yavaşça sulu Ara 20 çözeltisi ile değiştirin. Kolloidal süspansiyonu bir mililitrelik bir şırıngaya yükleyin ve şırıngayı mikroakışkan boru ile çipe bağlayın.
Süspansiyonu, kanalın yukarı akış kısmındaki orta bölümde bulunan girişten mikroakışkan çipe enjekte edin ve şablon kaplanana kadar süspansiyonu kademeli olarak itin. Kolloidal süspansiyonu dakikada 0,07 ila 0,2 mikrolitre akış hızında geri çekin ve mikroskop yazılımı ile modelleme işlemini görüntüleyin. Menisküs şablonun sonuna hızlı bir şekilde ulaştığında akış hızını artırın.
Düz kanal geometrisi, analiz edilen 5.000 tuzağın% 83'ünü biriktiren bir floresan Escherichia coli suşunun sabit fazlı hücrelerini modellemek için kullanıldı. Desenli bakteriler, kanalın taze LB ile doldurulmasından itibaren 1.5 saat içinde farklı zamanlarda büyümeye devam etti. Büyüme yeniden başladıktan sonra, tek bakteri hücreleri, bir yüzey tabakası oluşana ve tek hücre çözünürlüğü kaybolana kadar genişleyen bireysel koloniler oluşturmaya başladı. 55.000 tuzak üzerinde yapılan analiz, analiz edilen tuzakların sırasıyla% 93 ve% 89'unda iki ve bir mikrometre çapında parçacıklar tarafından yapılan yeşil-kırmızı dimerlerin oluştuğunu göstermiştir.
Ve tuzakların% 52'sinde yeşil-kırmızı-yeşil düzelticiler oluştu. Desenli parçacıklar arasındaki mesafe, zıt yönlerde iki biriktirme gerçekleştirilerek hassas bir şekilde kontrol edilebilir, böylece bu parçacıklar her tuzağın zıt uçlarında yakalanır. Modelleme işlemi sırasında yoğuşmayı önlemek için şablon boyunca eşit sıcaklığın sağlanması önemlidir.
Bu amaçla, şablonun altına ısıtılmış bir cam plaka yerleştirir ve kutu inkübatörü ile aynı sıcaklığa yerleştiririz. Bu yöntem, kantitatif tek hücre analizini içeren çeşitli biyolojik çalışmalarda kullanılabilir. Benzersiz bir avantaj, aynı deneysel arenada büyük istatistikler sağlayan binlerce hücrenin modellenmesine izin veren yüksek verimli doğasıdır.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, bakteri ve koloidler gibi mikro boyutlu nesneleri tanımlı dizilişler halinde düzenlemek için kapiller kuvvetlerin yardımıyla montaj kullanan bir mikroakışkan platform sunmaktadır. Bu yöntem, mikroorganizmaların uzun vadeli fizyoloji ve etkileşimlerinin izlenmesine olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikroakışkanlar
- Biyoteknoloji
- Mikrobiyoloji
Arka Plan
- Mikroakışkan kanallar, küçük hacimli sıvıların hassas manipülasyonunu sağlar.
- Kapiller kuvvetler çeşitli malzemelerin düzenlenmesi için kullanılabilir.
- Mikroorganizma davranışının anlaşılması çeşitli uygulamalar için kritik öneme sahiptir.
- Mevcut yöntemler, kullanıcı tanımlı desenler için esneklikten yoksun olabilir.
Çalışmanın Amacı
- Kullanıcı tanımlı mikroorganizma desenleri üretmek için bir yöntem geliştirmek.
- Düzenlenmiş mikroorganizmaların uzun vadeli fizyolojisini değerlendirmek.
- Kapitlerin farklı malzeme sınıfları boyunca uygulanabilirliğini keşfetmek.
Kullanılan Yöntemler
- Mikroakışkan kanallardaki kapiller kuvvetlerin yardımıyla montaj.
- Kolloid partiküllerin ve mikrobiyal hücrelerin düzenlenmesi.
- Düzenleme sonrası mikroorganizmaların izlenmesi.
- Mekansal düzenleme kontrolünün değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Kullanıcı tanımlı mikroorganizma desenleri başarılı bir şekilde oluşturuldu.
- Yöntem, malzemelerin mekansal düzenlemesinde kontrol sağladı.
- Uzun vadeli mikroorganizma izlemesi mümkündü.
- Kapiller kuvvetler, çeşitli malzemeler için çok yönlü bir yaklaşım sağladı.
Sonuçlar
- Teknoloji, mikroorganizmaların düzenlenmesi için yeni bir yaklaşım sunmaktadır.
- Mikrobiyal etkileşimleri incelemede potansiyel uygulamalara sahiptir.
- Yöntem, farklı malzeme türleri için uyarlanabilirdir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This microfluidic platform enables high-throughput, user-defined patterning of microorganisms and microparticles, supporting quantitative single-cell analysis in drug discovery and microbial ecology studies. By combining geometric control with environmental modulation, it enhances predictive confidence in target validation and phenotypic screening workflows. The method addresses a key discovery-stage challenge: achieving reproducible spatial arrangements for mechanistic de-risking of microbial interactions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise spatial patterning of microbial strains for interaction studies.
- Operational Value: Supports biological de-risking by allowing controlled co-culture configurations to clarify pathway dependencies.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating quantitative data on distance-dependent microbe-microbe interactions under defined conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by depositing thousands of individual cells with high spatial fidelity.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through capillary-force-driven patterning applicable across material classes.
- Screening Readiness: Enables reliable compound evaluation by providing large arrays of patterned microorganisms for high-throughput monitoring.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant systems by coupling single-cell deposition with microfluidic environmental control for microbial physiology studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Connects discovery through preclinical validation by enabling long-term monitoring of growth and colony formation post-patterning.
- Predictive De-risking: Focuses on mechanistic insights from patterned arrays, such as green-red dimer and trimer formation rates, to inform translational decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification, supporting hypothesis testing and assay readiness for antimicrobial or probiotic candidate evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled patterning of microbial strains to study interaction dynamics.
- Screening: Describes assay readiness through high-throughput patterning of microorganisms, allowing quantitative imaging of growth and interaction over time.
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as trap occupancy rates (e.g., 83% for E. coli, 93% for 2μm particles) that help compare conditions and material behaviors.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling long-term physiology monitoring under controlled environmental conditions, relevant for microbial ecology translation.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable platform for patterning diverse materials, including bacteria and colloids, across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in microbial interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of patterning across microbial and colloidal systems.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in antimicrobial development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative single-cell interaction data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, plasma bonding, and hydrophobic recovery of PDMS.
- Depends on instrumentation including syringe pumps, heated stages, plasma cleaners, and microscopy systems for patterning and monitoring.
- Necessitates cross-team standardization of channel preparation, bacterial suspension handling, and environmental control protocols.
- Involves adaptation considerations for different microorganism sizes, growth rates, and colloidal material properties.
- Includes practical limitations such as the need for uniform temperature to prevent condensation and potential loss of single-cell resolution during colony expansion.
