Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Büyümesi ve Görüntülenmesi için Basit Bir Mikroakışkan Çip

Bu tekniğin temel avantajı, hayvanın cihazın içinde serbestçe büyüyebilmesi ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için sıkışıp kalabilmesidir. Cihaz birkaç kez yeniden kullanılabilir. Cihaz yapılırken temizlik, cihaz işlemleri sırasında sızıntıyı önlemek için tozsuz cihazlar üretebilmek için en önemli faktördür.

Bir kelime işlem yazılımında dikdörtgen şekiller kullanarak akış katmanı için bir ve kontrol katmanı için iki desen tasarlamaya başlamak ve polyester bazlı film üzerinde minimum sekiz mikrometre özellik boyutuna sahip bir lazer plotter yardımıyla fotoğraf maskelerini yazdırmak. Silikon gofretleri yükseklik ve genişlikte 2,5 santimetrelik kare parçalar halinde kesin. Bir dakika boyunca% 20 potasyum hidroksit ile temizleyin ve gofretleri deiyonize suda durulayın.

Akış için bir gofret ve kontrol katmanı için başka bir gofret kullanın. Parçaları 14 adet P-S-I sıkıştırılmış azot gazı ile kurutun ve ardından dört saat boyunca 120 santigrat derecede sıcak bir plakada dehidrasyon yapın. Soğuduktan sonra bir silikon parça alın, bir spin kodlayıcının mandren üzerine koyun ve gofreti yerinde tutmak için vakumu açın.

Silikon parçaya yaklaşık 20 mikrolitre hekzametildisilan koyun ve spin kodlayıcıyı kullanarak beş saniye boyunca 500 R-P-M'de ve ardından 3000 R-P-M'de 30 saniye boyunca kaplayın. Akış katmanına özgü yaklaşık 40 mikrometrelik düzgün bir fotodirenç kalınlığı elde etmek için, silikon gofreti yaklaşık 1,5 mililitre negatif fotodirenç ile kaplayın, beş saniye boyunca 500 R-P-M'de bir spin kodlayıcı kullanın ve ardından 30 saniye boyunca 2000 R-P-M kullanın. Kontrol katmanına özgü yaklaşık 40 mikrometrelik düzgün bir fotodirenç kalınlığı elde etmek için silikon parçasının kaplamasını ikinci gofret için hekzametildisilan ve negatif fotodirenç ile tekrarlayın.

Alternatif olarak, yaşlı hayvanlar için akış tabakasının kalınlığını yaklaşık 80 mikrometreye çıkarmak için, silikon gofretleri yaklaşık 1,5 mililitre negatif fotorezistli iki ile kaplayın, beş saniye boyunca 500 R-P-M'de spin kodlayıcıyı ve ardından 30 saniye boyunca 2000 R-P-M'yi kullanın. Daha önce fotodirenç kaplı silikon parçaların her ikisini de bir dakika boyunca 65 santigrat derecede sıcak bir plaka üzerinde pişirin ve ardından 10 dakika boyunca 95 santigrat derece pişirin. Soğuduktan sonra, yumuşak pişmiş silikon parçaları, U-V aydınlatıcısının pozlama aşamasına, fotodirenç kaplı yüzeyi U-V lambasına bakacak şekilde yerleştirin.

Sırasıyla akış ve kontrol katmanları elde etmek için bir ve iki desenli bir fotoğraf maskesi aracılığıyla 200 watt'lık bir lamba kullanarak iki parçayı ayrı ayrı U-V'ye 15 saniye boyunca maruz bırakın. Açıkta kalan iki silikon parçayı daha önce tarif edildiği gibi, kaplanmış katmanlar yukarı bakacak şekilde pişirin. Parçaları soğuttuktan sonra, silikon parçaları fotodirenç geliştirici çözümünde 20 dakika bekleterek desenleri geliştirin.

Desen göründüğünde, parçaları saf izopropil alkol ile durulayın ve azot gazı kullanarak hafifçe kurulayın. Silikon parçalarını, kaplanmış yüzeyi yukarı bakacak şekilde bir kurutucuda tutun. Bir cam kızağa 50 mikrolitre saf T-C-P-F-O-S dökerek parçaları silan buharlarına maruz bırakın.

Slaytı bir kurutucunun içine yerleştirin ve iki saat boyunca inkübe edin. P-D-M-S'yi elastomer tabanı kürleme maddesi ile karıştırarak plastik bir kapta yapın ve üç dakika boyunca sürekli karıştırın. P-D-M-S karışımını, tüm hava kabarcıklarını gidermek için 30 dakika boyunca bir kurutucuda gazdan arındırın.

Kontrol katmanı silikon gofretlerini bir Petri kabına yerleştirin ve silikon parçaların üzerine beş milimetre kalınlığında bir P-D-M-S karışım tabakası dökün. P-D-M-S dökme işleminden sonra, P-D-M-S karışımının gazını giderme işlemini tekrarlayın. Silikon gofreti, 200 ila 500 militorr vakum basıncı uygulayan iplikçi kamyona bakan akış katmanı olacak şekilde yerleştirin.

Silikon gofrete yaklaşık bir mililitre P-D-M-S dökün. Yaklaşık 80 mikrometre kalınlığında bir tabaka elde etmek için bir spin kaplayıcı kullanarak kodlayın. İki silikon gofreti spin kaplı P-D-M-S ile pişirin ve P-D-M-S katmanlarını altı saat boyunca sıcak hava konveksiyonlu bir fırında 50 santigrat derecede dökün.

Parçalar soğuduktan sonra, keskin bir bıçak kullanarak kontrol tabakasının etrafındaki silikon parçadan beş milimetre kalınlığındaki P-D-M-S tabakasını kesin ve silikon substrattan soyun. P-D-M-S membran sapmaları için immobilizasyon kanalını ve izolasyon kanalı girişlerini gaz hatlarına bağlamak üzere P-D-M-S bloğunun rezervuarında bir Harris zımba kullanarak yaklaşık bir milimetre çapında iki delik açın. Silikon parçayı, kaplamalı P-D-M-S katmanıyla, P-D-M-S kaplamalı yüzeyi plastik bir tepsi üzerine bakacak şekilde birinci desene yerleştirin.

Delinmiş P-D-M-S bloğunu, kalıplanmış tarafı yukarı bakacak şekilde tepside ikinci desenli olarak tutun. Plastik tepsiyi bir plazma temizleyicinin içinde tutun ve düşük vakum uygulayarak iki P-D-M-S yüzeyini iki dakika boyunca 18 watt hava plazmasına maruz bırakın. Plazma ile işlenmiş iki bloğu çıkarın ve plazma ile işlenmiş bir ve iki desenin yüzeylerine birlikte bastırarak blokları nazikçe bağlayın.

Yapıştırılmış desenleri sıcak hava konveksiyonlu fırında iki saat boyunca 50 santigrat derecede pişirin. Yapıştırılmış cihazı fırından çıkardıktan sonra, silikon gofretten desen bir ve desen iki ile kesin ve Harris zımbayı kullanarak akış katmanının giriş ve çıkış rezervuarlarında delikler açın. Yapıştırılmış P-D-M-S bloğunu, akış tabakası yukarı bakacak şekilde plastik bir tepsiye yerleştirin ve aynı tepside temiz bir kapak camı bulundurun.

Kapak camındaki blokları iki dakika boyunca 18 watt hava plazmasına maruz bırakın. Menekşe bir oda görmek için vakum basıncını ayarlayın. Plazmaya maruz kalan P-D-M-S bloğunu kapak camına yerleştirin ve yapıştırılmış yapıyı iki saat boyunca 50 santigrat derecede bir fırında pişirin.

Gelecekteki herhangi bir deney için cihazı temiz bir odada saklayın. Cihazı alın, stereo mikroskopa koyun ve tüpleri takın. Bir microflex tüpü sıkıştırılmış azot gazı hattına ve diğer ucunda üç yönlü bir konektöre bağlayın.

Üç konektörlerden bir ve iki boruyu sırasıyla membranları izole eden tuzağa bağlayın. İki microflex boruyu üç yönlü stopcock'un iki çıkış portuna bağlayın. İki tüpün diğer ucunu sekiz milimetre uzunluğunda 18 gauge iğneye bağlayın.

Giriş portundan bir mikro pipet kullanarak akış katmanını M-9 tamponu ile doldurun. Her iki tüpü de iğneye bağlı uçtan deiyonize suyla doldurun. İki iğneyi, izolasyon ve yakalama membranını birbirine bağlayan delinmiş deliklere yerleştirin.

Azot gazı regülatörünü 14 P-S-I'de açın ve suyu kontrol katmanlarındaki mikroakışkan kanallardan, yani tuzak ve izolasyon membranlarından cihaza itmek için üç vanayı bir tüpten çevirin. Kanallar suyla doldurulduktan ve astarlandıktan sonra üç yönlü stopcock'u kullanarak basıncı serbest bırakın. Akış kanalından ek ortam akıtarak kabarcıkları çıkarın.

Şekil, mikroakışkan çipin içinde büyüyen ve floresan görüntüleri yakalamak için her sekiz ila 10 saatte bir hareketsiz hale getirilen P-S-3-2-3-9'un görüntülerini göstermektedir. İfade paternindeki varyasyon, aynı genin gelişimin farklı aşamalarında farklı hücrelerde eksprese edildiği zamansal gen düzenlemesinin bir örneğini temsil eder. Caenorhabditis elegans'ın bireysel W-D-I-S-5-1 genotipinin görüntülenmesi, sırasıyla L-2, Geç L-2, L-3 ve L-4 gelişim aşamalarında birincil, ikincil üçüncül ve kuaterner süreçleri içeren her P-V-D nöronunda menorah benzeri dallanmış dendritik mimariyi göstermektedir.

Buradaki şekil, P-V-D gelişimi ve cihaz tarafından yetiştirilen hayvanları ve N-G-M plakalarında yetiştirilenleri karşılaştırmaktadır. Solucan gelişiminin farklı aşamalarındaki S-P ve Q-P sayıları yaşla birlikte artmıştır. Caenorhabditis elegans, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için gerekli yeterli felce neden olmak için üç milimolar levamisol damlası ile tedavi edildi.

S-P değerleri, N-G-M plakalarında yetiştirilen benzer evreli hayvanlardan ölçüldüğünde ve bir Agar slaytında üç milimolar levamisol kullanılarak görüntülendiğinde önemli ölçüde farklı değildi. Ayrıca, biri kuyrukta bulunan ve ikincisi vulvanın yakınında bulunan iki P-V-C hücre gövdesi arasındaki mesafe, hem cihazda yetişen hayvanlarda hem de N-G-M plakalarında yetiştirilenlerde birbirinden ayrıldıkça artar. Şekil, mikroakışkan cihazın içinde büyüyen hayvanlardan gelen dokunma reseptör nöronlarının yüksek çözünürlüklü görüntüsünü temsil etmektedir.

Montaj, mitokondri ve nöronal süreci vurgulayan ardışık zaman noktalarında tüm P-L-M-R nöronal sürecini temsil eder. Grafik, saatte 10.4 mikrometrelik bir eğimle arttığı gözlenen toplam nöronal süreç uzunluğunu temsil etmektedir. Mikrofabrikasyon cihaz, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için C-eleganları hareketsiz hale getirmek ve yerinde tutmak için yüksek basınçlı azot gazı varlığında saptırılmış ince bir P-D-M-S membranı kullanır.

Bu prosedür, C-elegans'ta uzun bir süre boyunca aralıklı gözlemlere ihtiyaç duyan hücresel ve hücre altı süreçlerin uzunlamasına çalışmalarını sağlayabilir.