Virüs Benzeri Parçacık (VLP) Tabanlı Aşılarda Bir Yakalama Tahlili Kullanılarak Görüntülenen Antijenlerde Nötralizasyona Duyarlı Epitopların Tespiti
10 Şubat 2022
Burada, antijen gösteren virüs benzeri parçacıklar (VLP'ler) üzerindeki nötralizasyon epitoplarını tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. İnsan immün yetmezlik virüsünün (HIV) türevli VLP'lerin immün özürlülüğü, protein G-konjuge manyetik boncuklarla birleştirilmiş zarf glikoproteinlere özgü monoklonal antikorlar kullanılarak gerçekleştirilir. Yakalanan VLP'ler daha sonra viral çekirdek protein Gag spesifik antikorlar kullanan SDS-PAGE ve Batı blot analizine tabi tutulur.
Laboratuvarımda viral vektörler ve virüs benzeri parçacıklar veya VLP tabanlı aşılar için üretim sistemleri geliştiriyoruz. VLP yakalama tahlili, VLP'lerde görüntülenen hedef antijenlerin çok hassas bir şekilde algılanmasını sağlar. Bu testte, bu epitopların VLP yüzeyinde maruziyetini kanıtlamak için nötralizasyon epitoplarına karşı yönlendirilmiş geniş nötralize edici antikorlar kullanıyoruz.
Bu, aşı adayları için önemli bir kalite değerlendirmesidir, çünkü sadece nötralizasyona duyarlı epitopları gösteren VLP'ler aşılarda nötralize edici bir antikor yanıtı ortaya çıkarabilecektir. Manyetik boncukları yukarı ve aşağı pipetleyarak veya en az beş dakika boyunca 50 RPM'de bir rotator üzerinde karıştırarak başlayın. Bu arada, bNAB'ları içeren antikor çözeltisini hazırlayın.
Reaksiyon başına 200 mikrolitre antikor bağlama ve yıkama tamponunda her bNAB'dan 10 mikrogram kullanın. Her reaksiyon için, manyetik boncuk çözeltisinin 50 mikrolitresini 1,5 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne aktarın, ardından tüpleri manyetik ayırma rafına yerleştirin. Boncukların tüm boncukların toplandığından emin olmak için tüp topunda toplanana kadar bekleyin, ardından üst saltant çıkarın.
Mıknatısı çıkarın ve boncukları önceden hazırlanmış bNAB çözeltisinin 200 mikrolitresinde askıya alın. Oda sıcaklığında 50 RPM'de bir rotatorda karıştırırken 30 dakika ila üç saat kuluçkaya yatır. İnkübasyondan sonra, reaksiyon tüplerini manyetik ayırma rafı içine yerleştirin, bekleyin ve süpernatant çıkarın.
Tüpleri mıknatıstan çıkarın ve 200 mikrolitre antikor bağlama ve yıkama tamponunda yeniden askıya alarak boncukları yıkayın. Yıkamayı antikor bağlama ve yıkama tamponu ile tekrarlayın, bittiğinde mümkün olduğunca fazla yıkama tamponu çıkarın. Örnekleri boncuk bağlı bNAB'lara ekleyin.
Eklenen örnek hacim bir mililitrenin altındaysa, numune hacmini bir mililitreye ayarlamak için PBS ekleyin, ardından hafifçe pipetleme yaparak boncukları yeniden askıya alın. Numuneleri ve boncukları oda sıcaklığında bir rotatörde 2,5 saat kuluçkaya yatırarak boncukların süspansiyonda kalmasını ve çözeltinin kuluçka sırasında iyice karıştırılmasını sağlayın. Tüpleri mıknatısın üzerine yerleştirin ve süpernatantı çıkarın, ardından manyetik boncukları 200 mikrolitre yıkama tamponunda askıya alarak yıkayın.
Boncukları 100 mikrolitre yıkama tamponunda askıya alın ve süspansiyonu temiz, ısıya dayanıklı bir reaksiyon tüpüne aktarın. Tüpü manyetik ayırma rafı üzerine yerleştirin ve süpernatant tamamen çıkarın. Denatüre STS-PAGE örnekleri hazırlamak için, boncukları 20 ila 80 mikrolitre Laemmli tamponunda askıya alın ve beş dakika boyunca 95 santigrat derecede kuluçkaya bırakın.
Boncukları çözeltiden ayırmak için tüpleri manyetik bir rafa yerleştirerek doğrudan SDS-PAGE ile devam edin. Alternatif olarak, örnekleri eksi 20 santigrat derecede saklayın. İlk olarak bNAB'ler kullanılarak hücre içermeyen hücre kültürü süpernatantı ve VLP peletlerinden yakalanan ve daha sonra viral çekirdek proteinleri tespit etmek için Batı leke analizine tabi tutulan VLP'lerin temsili bir sonucu burada gösterilmiştir.
Ele geçirme testi için kullanılan boncuklar, negatif kontrol görevi gören zarf glikoproteinlerinin nötralizasyon epitoplarına ve izotip antikorlarına karşı yönlendirilmiş üç farklı bNAB ile kaplanmıştır. İzotop antikor kaplı boncuklar kullanılarak, kel VLP'ler, yani Env negatif VLP'ler veya Env-displaying VLP'ler içeren VLP örneklerinde gag proteinleri saptanamadı ve VLP'lerin insan antikorlarıyla kaplı boncuklara spesifik olmayan bağlanmasının VLP yakalamasına aracılık etmediğini gösterdi. Kel VLP'ler de bNAB kaplı boncuklarla bağlanmadı ve sonuç olarak Batı blot analizinde hiçbir Gag proteini tespit edilemedi.
Buna karşılık, her üç bNAB de Env-proteinleri gösteren VLP'leri yakaladı, bu nedenle Gag proteinleri kolayca tespit edildi ve VIP'lerde görüntülenen Env-glikoproteinlerde nötralizasyon epitoplarının varlığını gösterdi. Bu en iyi rotasyon altında 500 mikrolitreden daha büyük hacimler kullanılarak elde edilir.
Alternatif olarak, yakalanan VLP'ler azaltıcı olmayan koşullar altında ele geçirilebilir. Bu, immün-elektron mikroskopisi kullanan VLP'lerin analizini veya görüntülenen antijenlerin yerel PAGE kullanılarak araştırılmasını sağlar.
Genel Bakış
Bu makale, bir yakalama deneyi (capture assay) kullanarak virüs benzeri partiküller (VLP'ler) üzerindeki nötralizasyon epitoplarının tespitine yönelik bir protokol sunmaktadır. Yöntem, aşı adaylarının değerlendirilmesi için kritik öneme sahip olan bu epitopların maruziyet düzeyini belirlemek amacıyla geniş spektrumlu nötralize edici antikorlar (bNAB'ler) kullanmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- İmmünoloji
- Aşı Geliştirme
- Viroloji
Arka Plan
- Virüs benzeri partiküller (VLP'ler), aşı geliştirme için önemlidir.
- Nötralizasyon epitopları, bir bağışıklık yanıtı uyandırmak için kritiktir.
- Bu epitopları tespit etmek için geniş spektrumlu nötralize edici antikorlar kullanılabilir.
- Etkili aşı adayları için VLP'lerin kalite değerlendirmesi esastır.
Çalışmanın Amacı
- VLP'ler üzerindeki nötralizasyon epitoplarını tespit etmek için hassas bir analiz yöntemi geliştirmek.
- Bu epitopların aşı etkinliğindeki önemini kanıtlamak.
- Alandaki araştırmacılar için ayrıntılı bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- bNAB'lar kullanılarak HIV kaynaklı VLP'lerin immünopresipitasyonu.
- VLP yakalama işlemi için protein G-konjuge manyetik boncukların kullanımı.
- Viral çekirdek proteinlerini tespit etmek için SDS-PAGE ve Western blot analizi.
- Etkili yakalama için VLP'lerin antikor kaplı boncuklarla iyice karıştırılması.
Temel Sonuçlar
- Env proteinleri sergileyen VLP'ler, bNAB'lar kullanılarak başarıyla yakalanmıştır.
- Env-negatif VLP'lerde hiçbir Gag proteini tespit edilmeyerek özgüllük doğrulanmıştır.
- Her üç bNAB da nötralizasyona duyarlı VLP'lere etkili bağlanma göstermiştir.
- Analiz başarısı, uygun karıştırma ve inkübasyon koşullarına bağlıdır.
Sonuçlar
- Bu analiz, VLP kalitesini değerlendirmek için güvenilir bir yöntem sunar.
- Nötralizasyon epitopları, immün yanıtın indüklenmesi için gereklidir.
- Bu protokol, etkili aşıların geliştirilmesine yardımcı olabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
VLP yakalama testi, antijen sergileyen virüs benzeri parçacıklar üzerindeki nötralizasyona duyarlı epitopların varlığını doğrulayarak, aşı adayı kalitesini değerlendirmek için hassas bir yöntem sunar. Bu, nötralize edici B hücresi yanıt potansiyelinin erkenden öngörülmesini sağlayarak aşı geliştirme süreçlerindeki devam/dur kararlarını destekler. Test, maliyetli preklinik ve klinik aşamalardan önce zarf glikoproteinlerinin yapısal bütünlüğünü doğrulayarak biyolojik riski azaltır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: VLP yüzeylerinde nötralizasyon-hassas epitopların açığa çıktığını doğrulayarak, aşı immunojenitesinin terapötik hipotez sorgulamasını mümkün kılar.
- Operasyonel Değer: Hedef doğrulamadaki riskleri azaltmak için epitopa özgü bağlanma kanıtları aracılığıyla geniş spektrumlu nötralize edici antikorları fonksiyonel problar olarak kullanır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Yapısal bütünlüğü korunmuş partiküllerin izole edilmesi yoluyla, sonraki immünolojik analizler için antijen sunan VLP'lerin hazırlanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Western blot aracılığıyla viral çekirdek proteinlerinin (örneğin Gag) kantitatif tespitini sağlayarak analiz standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliğini destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Epitop maruziyetini insanlardaki öngörülen nötralize edici antikor yanıtlarıyla ilişkilendirerek, VLP üretiminden immünolojik uygunluğa kadar olan sürekliliği ortaya koyar.
- Operasyonel Değer: Hayvan challenge çalışmaları öncesinde koruyucu immünite uyandırabilen VLP'leri tanımlayarak, risk ayarlı ilerleme kararlarını destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu analiz, keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürece uygun olup, aday seçimine temel oluşturmak amacıyla üretim sonrası VLP karakterizasyonunu immünojenisite testinden önceye konumlandırır.
- Keşif Biyolojisi: VLP'lerin bilişsel antijenleri doğal konformasyonda sergilediğini doğrulayarak aşı konstrüktlerinin biyolojik risklerinin azaltılmasını destekler.
- Tarama: Env-pozitif VLP'lerin spesifik yakalanması ve Env-negatif kontrollerde sinyal yokluğu aracılığıyla analiz hazırlığını onaylar.
- Analitikler: Yakalanan VLP verimi ve bütünlüğü için kantitatif bir vekil olarak Gag proteinlerinin Western blot sonuçlarını üretir.
- Translasyonel Araştırma: Nötralizasyona duyarlı epitopların maruziyetini doğrulayarak, biyofiziksel VLP kalitesini immünolojik öngörü değeriyle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla antijen hedefi ve serotip genelinde VLP tabanlı aşı adayları için yeniden kullanılabilir bir QC platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Nötralize edici epitop maruziyetinin doğrudan değerlendirilmesi yoluyla aşı etkinliğinde öngörücü güven.
- Operasyonel Değer: Manyetik boncuklar kullanılarak gerçekleştirilen standartlaştırılmış yakalama ve yıkama adımları, laboratuvarlar ve üretim partileri arasında tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Fonksiyonel epitoplardan yoksun VLP'leri filtreleyerek, geç aşama biyolojik başarısızlık riskini azaltır ve daha iyi devam/durdur kararları alınmasını sağlar.
- Portföy Etkisi: Yapısal ve fonksiyonel kalite metriklerine dayalı olarak VLP adaylarının riskle uyumlu önceliklendirilmesini kolaylaştırır.
Uygulama Hususları
- İmmünopresipitasyon, antikor kullanımı ve manyetik boncuk tabanlı ayırma tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Protein A/G konjuge manyetik boncuklara, geniş spektrumlu nötralize edici antikorlara ve Western blot cihazlarına erişime bağlıdır.
- Verimli yakalama sağlamak için boncuk-VLP karıştırma hacimlerinin (>500 µL) ve rotasyon koşullarının standardize edilmesini gerektirir.
- HIV dışı VLP'ler için antikor seçimi ve farklı antijen hedefleri için tampon optimizasyonu dahil olmak üzere adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Yüksek titreli bNAb ihtiyacı ve yoğun paketlenmiş VLP dizilerindeki potansiyel sterik engel gibi pratik sınırlamaları kapsar.
