Virüs Benzeri Parçacık (VLP) Tabanlı Aşılarda Bir Yakalama Tahlili Kullanılarak Görüntülenen Antijenlerde Nötralizasyona Duyarlı Epitopların Tespiti

Laboratuvarımda viral vektörler ve virüs benzeri parçacıklar veya VLP tabanlı aşılar için üretim sistemleri geliştiriyoruz. VLP yakalama tahlili, VLP'lerde görüntülenen hedef antijenlerin çok hassas bir şekilde algılanmasını sağlar. Bu testte, bu epitopların VLP yüzeyinde maruziyetini kanıtlamak için nötralizasyon epitoplarına karşı yönlendirilmiş geniş nötralize edici antikorlar kullanıyoruz.

Bu, aşı adayları için önemli bir kalite değerlendirmesidir, çünkü sadece nötralizasyona duyarlı epitopları gösteren VLP'ler aşılarda nötralize edici bir antikor yanıtı ortaya çıkarabilecektir. Manyetik boncukları yukarı ve aşağı pipetleyarak veya en az beş dakika boyunca 50 RPM'de bir rotator üzerinde karıştırarak başlayın. Bu arada, bNAB'ları içeren antikor çözeltisini hazırlayın.

Reaksiyon başına 200 mikrolitre antikor bağlama ve yıkama tamponunda her bNAB'dan 10 mikrogram kullanın. Her reaksiyon için, manyetik boncuk çözeltisinin 50 mikrolitresini 1,5 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne aktarın, ardından tüpleri manyetik ayırma rafına yerleştirin. Boncukların tüm boncukların toplandığından emin olmak için tüp topunda toplanana kadar bekleyin, ardından üst saltant çıkarın.

Mıknatısı çıkarın ve boncukları önceden hazırlanmış bNAB çözeltisinin 200 mikrolitresinde askıya alın. Oda sıcaklığında 50 RPM'de bir rotatorda karıştırırken 30 dakika ila üç saat kuluçkaya yatır. İnkübasyondan sonra, reaksiyon tüplerini manyetik ayırma rafı içine yerleştirin, bekleyin ve süpernatant çıkarın.

Tüpleri mıknatıstan çıkarın ve 200 mikrolitre antikor bağlama ve yıkama tamponunda yeniden askıya alarak boncukları yıkayın. Yıkamayı antikor bağlama ve yıkama tamponu ile tekrarlayın, bittiğinde mümkün olduğunca fazla yıkama tamponu çıkarın. Örnekleri boncuk bağlı bNAB'lara ekleyin.

Eklenen örnek hacim bir mililitrenin altındaysa, numune hacmini bir mililitreye ayarlamak için PBS ekleyin, ardından hafifçe pipetleme yaparak boncukları yeniden askıya alın. Numuneleri ve boncukları oda sıcaklığında bir rotatörde 2,5 saat kuluçkaya yatırarak boncukların süspansiyonda kalmasını ve çözeltinin kuluçka sırasında iyice karıştırılmasını sağlayın. Tüpleri mıknatısın üzerine yerleştirin ve süpernatantı çıkarın, ardından manyetik boncukları 200 mikrolitre yıkama tamponunda askıya alarak yıkayın.

Boncukları 100 mikrolitre yıkama tamponunda askıya alın ve süspansiyonu temiz, ısıya dayanıklı bir reaksiyon tüpüne aktarın. Tüpü manyetik ayırma rafı üzerine yerleştirin ve süpernatant tamamen çıkarın. Denatüre STS-PAGE örnekleri hazırlamak için, boncukları 20 ila 80 mikrolitre Laemmli tamponunda askıya alın ve beş dakika boyunca 95 santigrat derecede kuluçkaya bırakın.

Boncukları çözeltiden ayırmak için tüpleri manyetik bir rafa yerleştirerek doğrudan SDS-PAGE ile devam edin. Alternatif olarak, örnekleri eksi 20 santigrat derecede saklayın. İlk olarak bNAB'ler kullanılarak hücre içermeyen hücre kültürü süpernatantı ve VLP peletlerinden yakalanan ve daha sonra viral çekirdek proteinleri tespit etmek için Batı leke analizine tabi tutulan VLP'lerin temsili bir sonucu burada gösterilmiştir.

Ele geçirme testi için kullanılan boncuklar, negatif kontrol görevi gören zarf glikoproteinlerinin nötralizasyon epitoplarına ve izotip antikorlarına karşı yönlendirilmiş üç farklı bNAB ile kaplanmıştır. İzotop antikor kaplı boncuklar kullanılarak, kel VLP'ler, yani Env negatif VLP'ler veya Env-displaying VLP'ler içeren VLP örneklerinde gag proteinleri saptanamadı ve VLP'lerin insan antikorlarıyla kaplı boncuklara spesifik olmayan bağlanmasının VLP yakalamasına aracılık etmediğini gösterdi. Kel VLP'ler de bNAB kaplı boncuklarla bağlanmadı ve sonuç olarak Batı blot analizinde hiçbir Gag proteini tespit edilemedi.

Buna karşılık, her üç bNAB de Env-proteinleri gösteren VLP'leri yakaladı, bu nedenle Gag proteinleri kolayca tespit edildi ve VIP'lerde görüntülenen Env-glikoproteinlerde nötralizasyon epitoplarının varlığını gösterdi. Bu en iyi rotasyon altında 500 mikrolitreden daha büyük hacimler kullanılarak elde edilir.

Alternatif olarak, yakalanan VLP'ler azaltıcı olmayan koşullar altında ele geçirilebilir. Bu, immün-elektron mikroskopisi kullanan VLP'lerin analizini veya görüntülenen antijenlerin yerel PAGE kullanılarak araştırılmasını sağlar.