DetectSyn: Sinaps Yoğunluğundaki Değişiklikleri Tespit Etmek için Hızlı, Tarafsız Bir Floresan Yöntemi

DetectSyn, sinapslardaki değişiklikleri hızlı bir şekilde tanımlamak için yakınlık ligasyonu testi teknolojisinden yararlanır. Ayrıca sonuçları analiz etmek için bir protokol sağlıyoruz. DetectSyn'in temel avantajı, analiz edilebilen dokunun geniş bölgelerinde sonuçların ne kadar hızlı elde edilebildiğidir.

Başlamak için, hücreleri rahatsız etmeden bloke edici çözeltiyi plastik bir Pasteur pipetle dikkatlice çıkarın. Ardından büyük bir plastik Petri kabını Parafilm ile hizalayın. Forseps kullanarak, kapak fişlerini dikkatlice Parafilm'e aktarın.

Kapak kaymasının üstüne 60 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ekleyin ve antikor çözeltisinin kapak kaymasının kenarlarına dökülmemesini sağlayın. Nem sağlamak ve numunelerin inkübasyon sırasında kurumasını önlemek için, daha küçük bir Petri kabına ultra saf su ekleyin ve kabı dikkatlice kapak fişlerinin etrafına yerleştirin. Daha sonra daha büyük Petri kabını örtün ve kültürlenmiş hücreleri oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Birincil antikor ile inkübasyondan sonra, kapak kapaklarından birincil antikor çözeltisini bir kağıt havluya dikkatlice vurmak için forseps kullanın ve kapak fişlerini 500 mikrolitre PBS ile doldurulmuş orijinal 24 delikli plakalarına aktarın. Daha sonra numuneleri PBS ile her biri 10 dakika boyunca üç kez orbital çalkalayıcı üzerinde nazik bir ajitasyonla yıkayın. Son yıkamadan sonra, kapak kaymalarını büyük Petri kabına geri aktarın ve kapak kaymasının üstüne 40 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin.

Petri kabını örtün ve numuneleri bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ligasyon için, ligazı soğuk bir blokta tutarken, ligasyon stoğunu kullanarak ligaz 1 ila 40 arasında seyreltin ve hemen kapak fişlerine 40 mikrolitre ligaz karışımı ekleyin. Petri kabını örtün ve örnekleri 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Amplifikasyon için, polimeraz 1280'i amplifikasyon stoğunu kullanarak soğuk bir blok üzerinde seyreltin. Daha sonra kapak fişlerine 40 mikrolitre amplifikasyon karışımı ekleyin ve numuneleri 37 santigrat derecede 100 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, montaj için, üç mikrolitre montaj ortamını bir slaytın üzerine bırakın.

Kapak kaymasından fazla yıkama tamponuna dokunun ve kapak kaymasını hücreler aşağı bakacak şekilde montaj ortamına yerleştirin. Kapak kaymasını yerinde tutmak için kenarları az miktarda şeffaf oje ile kapatın. Dilimlenmiş dokunun montajı için, bir doku dilimini hazırlanan slayda dikkatlice aktarın ve düz bir şekilde yerleştirin.

Daha sonra doku dilimine 5 ila 10 mikrolitre montaj ortamı bırakın. Doku diliminin üzerine bir cam kapak kayması yerleştirin ve daha önce gösterildiği gibi kapak kaymasını şeffaf oje ile kapatın. Konfokal mikroskopla dijital görüntüleme için, arka plan gürültüsünü azaltmak ve floresan sinyalini geliştirmek için her floresan kanalın kazancı, ofset ve lazer gücünü ayarlayın.

Floresan sinyalin aşırı doygun olmadığından emin olun. Kültür nöronları için, ND Edinme sekmesi altında, Dosyaya Kaydet'e tıklayın. Ardından, Gözat altında, görüntüyü kaydetmek için bir dosya seçin ve dosya adını girin.

Ardından, Z sekmesi altında, Aralık Tarafından Tanımlanan Simetrik Mod seçeneğini belirleyin. Odağı en iyi harita iki düzlemine ayarlayın ve bu odak düzlemini z yığınının ortası olarak ayarlamak için Göreli düğmesine tıklayın. Ardından, aralığı bir mikrometre adımıyla beş mikrometreye ayarlayın ve Z hareketi sırasında Aktif Deklanşörü kapat'ı işaretleyin.

Dalga Boyu sekmesi altında, Optik Yapılandırma altında önceden yapılandırılmış alma ayarlarıyla optik düğmenin adını seçin ve Şimdi Çalıştır'a tıklayın. Dilimlenmiş doku için, elde et menüsünden Büyük Görüntüyü Tara'yı seçin, ardından yakalama panelinin altında, önceden yapılandırılmış alma ayarlarına sahip optik düğmeyi seçin. Ayrıca, bu panelde doğru hedefi seçin.

Ardından, alan panelinin ve göz merceğinin altında, ilgilenilen bölgenin veya yatırım getirisinin sınırlarını ayarlamak için ok tuşlarını kullanın. Ardından Büyük resmi dosyaya kaydet'e tıklayın ve görüntü için bir kaydetme yolu dosya adı oluşturun. Son olarak, kurulum panelinin altında, Çok Kanallı Yakalama'nın işaretli olduğundan emin olun.

Ardından, optik yapılandırma altında önceden yapılandırılmış alma ayarlarıyla optik düğmenin adını seçin. ImageJ'de, görüntü menüsüne gidip Ayarla'ya ve ardından Eşik'e tıklayarak eşik seçeneğini açın. Görüntünün koyu arka planı varsa Koyu Arka Plan seçeneğini belirleyin.

Ardından, daha önce belirlenen optimize edilmiş eşik ayarlarına göre eşiğin üst ve alt sınırlarını ayarlayın ve Uygula'ya tıklayın. Kültürlü hücreler için, dendritler ve soma dahil olmak üzere her nöron için bir ROI çizmek üzere MAP2 kanalını ve serbest bir el ROI aracını kullanın. Dilimlenmiş doku için, dilim görüntüsünün içinde ilgilenilen alanı kapsayan serbest bir el yatırım getirisi çizin.

Ardından, Analiz menüsünü açıp Ölç'e tıklayarak YG alanını elde edin. Her yatırım getirisindeki punta sayısını tespit etmek için, parçacık analizi gibi otomatik bir algılama aracı kullanın. Analiz Edildi menüsünden, Analiz Edilen Parçacıklar'ı seçin ve puncta boyutu çapını tanımlayın.

Ardından, göster açılır menüsünden, Bindirme Maskeleri seçeneğini belirleyin, ardından Sonuçları görüntüle seçeneğini işaretleyin ve Tamam'ı tıklayın. Punta sayısını tek tek YG'nin alanına bölmek için, sonuçlardan her bir resmin sonuçlarını kopyalayıp bir e-tabloya yapıştırın. Hangi dosyadan ve verilerden elde edildiğimizi belirleyin ve YG alanını punta sayısına bölün.

Son olarak, numuneleri kontrol etmek için sonuçları normalleştirmek için, kontrol numunelerinin sonuçlarının ortalamasını alın ve tüm numunelerin elde edilen sonuçlarını kontrolün ortalamasına bölün. GABAB agonisti baklofen, hızlı antidepresan Ro-256981'in in vitro etkinliği için gereklidir. Sinaps oluşumundaki bir artış, beyaz puntadaki bir artışla gösterilmiştir.

Baklofen olmadan sinaps oluşumunda artış görülmez. Hızlı antidepresanın in vivo intraperitoneal enjeksiyonu, salin kontrolüne kıyasla sinaps oluşumunda artışa neden olur. Teknik kontrol görüntülerinde bazı puntalar görünse de, genellikle diğer panellerdeki büyük punta'ya kıyasla beyaz spesifikasyon tarafından gösterilenle aynı boyutta değildir.

Dahası, bu punta, soma içinde görünen bazı puntaların gösterdiği gibi aynı yerde değildir. DetectSyn, bir hastalık durumu veya ilaç tedavisi nedeniyle sinapslardaki değişiklikleri tanımlayabilir. Bu yöntem, sinapsların gelişimini veya parçalanmasını etkileyen bozuklukları inceleyen herhangi bir araştırma alanına içgörü sağlamaya yardımcı olabilir.