Name: Osteoblast Biyoenerjetik Teknolojilerini İzlemek için Gerçek Zamanlı Hücre Metabolik Akı Analizörünü Kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T12:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Öğrenin, osteoblast biyoenerjetiğini gerçek zamanlı metabolik akı analizi ile inceleyin. Oksijen tüketimi ve ekstraselüler asidifikasyon oranlarını ölçerek ATP üretimini değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) Ulusal Artrit ve Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü (NIAMS) Grant AR072123 ve Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (NIA) Grant AG069795 (ERR'ye) tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Rodan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bone homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (23), 13361-13362 (1998).</li>
<li>Nakahama, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+communications+in+bone+homeostasis+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cellular communications in bone homeostasis and repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (23), 4001-4009 (2010).</li>
<li>Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblast-osteoclast+communication+and+bone+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis.</a> Cells. 9 (9), 2073(2020).</li>
<li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIRT3%2FSOD2+maintains+osteoblast+differentiation+and+bone+formation+by+regulating+mitochondrial+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">SIRT3/SOD2 maintains osteoblast differentiation and bone formation by regulating mitochondrial stress.</a> Cell Death and Differentiation. 25 (2), 229-240 (2018).</li>
<li>Baron, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+bone+resorption+by+the+osteoclast%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of bone resorption by the osteoclast.</a> The Anatomical Record. 224 (2), 317-324 (1989).</li>
<li>Tian, L., Rosen, C. J., Guntur, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Function+and+Metabolism+of+Cultured+Skeletal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Function and Metabolism of Cultured Skeletal Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2230, Clifton, N.J. 437-447 (2021).</li>
<li>Zanotelli, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ATP+utilization+during+metastatic+cell+migration+by+collagen+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of ATP utilization during metastatic cell migration by collagen architecture.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (1), 1-9 (2018).</li>
<li>Gonzales, S., Wang, C., Levene, H., Cheung, H. S., Huang, C. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+promotes+extracellular+matrix+biosynthesis+of+intervertebral+disc+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">ATP promotes extracellular matrix biosynthesis of intervertebral disc cells.</a> Cell and Tissue Research. 359 (2), 635-642 (2015).</li>
<li>Kruse, N. J., Bornstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolic+requirements+for+transcellular+movement+and+secretion+of+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The metabolic requirements for transcellular movement and secretion of collagen.</a> Journal of Biological Chemistry. 250 (13), 4841-4847 (1975).</li>
<li>Rendina-Ruedy, E., Guntur, A. R., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+lipid+droplets+support+osteoblast+function%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Intracellular lipid droplets support osteoblast function.</a> Adipocyte. 6 (3), 250-258 (2017).</li>
<li>Sinnott-Armstrong, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+variant+at+3q21.1+confers+an+increased+pleiotropic+risk+for+hyperglycemia+and+altered+bone+mineral+density%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A regulatory variant at 3q21.1 confers an increased pleiotropic risk for hyperglycemia and altered bone mineral density.</a> Cell Metabolism. 33 (3), 615-628 (2021).</li>
<li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li>
<li>Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+studies+of+bone+in+vitro%3A+I.+Normal+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolic studies of bone in vitro: I. Normal bone.</a> Journal of Biological Chemistry. 235, 1206-1210 (1960).</li>
<li>Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+studies+of+bone+in+vitro%3A+II.+The+metabolic+patterns+of+accretion+and+resorption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolic studies of bone in vitro: II. The metabolic patterns of accretion and resorption.</a> Journal of Biological Chemistry. 235, 1211-1214 (1960).</li>
<li>Adamek, G., Felix, R., Guenther, H. L., Fleisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+oxidation+in+bone+tissue+and+bone+cells+in+culture.+Characterization+and+hormonal+influences%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fatty acid oxidation in bone tissue and bone cells in culture. Characterization and hormonal influences.</a> The Biochemical Journal. 248 (1), 129-137 (1987).</li>
<li>Frey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt-Lrp5+signaling+regulates+fatty+acid+metabolism+in+the+osteoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Wnt-Lrp5 signaling regulates fatty acid metabolism in the osteoblast.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1979-1991 (2015).</li>
<li>Romero, N., Rogers, G., Neilson, A., Dranka, B. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRomero%2C+N+%22Quantifying+cellular+ATP+production+rate+using+agilent+seahorse+XF+technology%22">Quantifying cellular ATP production rate using agilent seahorse XF technology</a>. , (2018).</li>
<li>vander Windt, G., Chang, C., Pearce, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+bioenergetics+in+T+cells+using+a+Seahorse+Extracellular+Flux+Analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse Extracellular Flux Analyzer.</a> Current Protocols in Immunology. 113, 1(2016).</li>
<li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (117), e54918(2016).</li>
<li>Noel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+metabolic+assay+of+3-dimensional+spheroid+co-cultures+of+pancreatic+cancer+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation and metabolic assay of 3-dimensional spheroid co-cultures of pancreatic cancer cells and fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (126), e56081(2017).</li>
<li>Nicholls, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511(2010).</li>
<li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+Analyzer%3A+applications+for+aging+research%5BTitle%5D)+AND+%22GeroScience%22%5BJournal%5D)">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 Analyzer: applications for aging research.</a> GeroScience. 40 (3), 347-356 (2018).</li>
<li>What are the advantages of using Seahorse XF technology. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech">https://www.agilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech</a> (2018).</li>
<li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology+-+Series+A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li>
<li>XF cell energy phenotype test. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884</a> (2021).</li>
<li>Leung, D. T. H., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oxidative+stress%3A+Mitochondrial+function+using+the+seahorse+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of oxidative stress: Mitochondrial function using the seahorse system.</a> Methods in Molecular Biology. 1710, Clifton, N.J. 285-293 (2018).</li>
<li>XF ATP rate assay. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889</a> (2021).</li>
<li>XF cell mito stress test. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885</a> (2021).</li>
<li>XF cell mito fuel flex test. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888</a> (2021).</li>
<li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+and+osteoclast+progenitors+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56750(2018).</li>
<li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+uptake+and+Runx2+synergize+to+orchestrate+osteoblast+differentiation+and+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glucose uptake and Runx2 synergize to orchestrate osteoblast differentiation and bone formation.</a> Cell. 161 (7), 1576-1591 (2015).</li>
<li>Zoch, M. L., Abou, D. S., Clemens, T. L., Thorek, D. L. J., Riddle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+radiometric+analysis+of+glucose+uptake+and+distribution+in+mouse+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo radiometric analysis of glucose uptake and distribution in mouse bone.</a> Bone Research. 4, 16004(2016).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).</li>
<li>Kam, Y., Jastromb, N., Clayton, J., Held, P., Dranka, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKam%2C+Y+%22Normalization+of+agilent+seahorse+XF+data+by+in-situ+cell+counting+using+a+BioTek+cytation+5+application+note%22">Normalization of agilent seahorse XF data by in-situ cell counting using a BioTek cytation 5 application note</a>. , (2017).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Gerçek zamanlı hücre metabolik akı analizörü, farklı koşullar altında hücresel enerjileri keşfetmek için kullanılabilir. Protokol, BMSC'lerin verimli izolasyonunu, hücrelerin uygun hücre kültürü plakalarında kültürlenmesini ve hücre dışı akı analizörü kullanılarak çeşitli tahliller için kullanılabilecek olgun osteoblastlara farklılaşmasını göstermektedir. Ayrıca, sensör kartuşlarının hidrasyonu, enjeksiyon portlarının yüklenmesi, tahlilin yapılması, verilerin normalleştirilmesi ve veri analizleri dahil olmak üzere gerçek...

Osteoblast tarafından kemik oluşumuna, kemiklerin osteoklastlar tarafından koordineli yıkımı veya emilimi eşlik eder. Osteoblastik kemik oluşumu ve osteoklast rezorpsiyonu arasındaki denge, iskelet homeostazı için gerekli olan kemik döngüsünü veya yeniden şekillenmesini tanımlayan birleştirilmiş bir süreçtir. Osteoblast disfonksiyonu kemik oluşumunun bozulmasına yol açar ve osteoporoz 1,2,3 dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarla sonuçlanır. Kemik iliği stromal kök hücrelerinin (BMSC'ler) osteoblast öncüllerine ve olgun osteoblastlara ex vivo/in vitro farklılaşması, zamanla kültür damarında mineralize kemik matriksinin oluşması ve birikmesi ile sonuçlanır 4,5,6. Osteoblast tarafından yapılan bu kemik oluşumu önemli miktarda hücresel enerji gerektirir. Spesifik olarak, kollajen sentezi ve sekresyonunun hücresel ATP'ye büyük ölçüde dayandığı gösterilmiştir: ADP oranları ve muhtemelen mineralize vezikül kaçakçılığı ve sekresyonu ek ATP 7,8,9,10,11 gerektirir. Birçok araştırmacı, osteoblastogenez ve osteoblast fonksiyonu sürecinin, kemik oluşumunun metabolik talebini karşılamak için yeterli bir enerji kaynağı gerektirdiğini göstermiştir 12,13,14,15,16. Bu nedenle, bu yöntemin amacı, gerçek zamanlı hücre metabolik akı analizörünü kullanarak osteoblast farklılaşması boyunca birincil, murin stromal hücrelerin biyoenerjetik durumunu karakterize etmektir. Bu teknikler, iskelet homeostazının daha iyi anlaşılmasına yardımcı olur ve bu da sonuçta iskelet bozukluklarını iyileştirebilecek yeni terapötik seçeneklerin geliştirilmesine yol açabilir.
Gerçek zamanlı hücre metabolik akısı analizörü, sırasıyla mitokondriyal ve glikolitik ATP üretimine karşılık gelen canlı osteoblastların oksijen tüketim hızını (OCR) ve hücre dışı asitleşme hızını (ECAR) ölçmek için kullanılabilir. Bu metodolojinin temeli, glikozun laktata dönüştürülmesinde glikoliz sırasında laktat başına bir H + iyonunun salınmasıdır ve bu da ECAR değerlerine yansıyan ortam pH'ını değiştirir. Tersine, TCA (trikarboksilik asit) döngüsü sırasında, mitokondri yoluyla oksidatif fosforilasyon, oksijen kullanarak veya tüketerek CO2 üretir ve bu nedenle OCR'nin izlenmesi bu metabolik süreci yansıtır. Analizör, hücre dışı mikro ortamda hem OCR hem de ECAR'ı aynı anda ve gerçek zamanlı olarak ölçer, bu da hücresel biyoenerjetik 6,17'yi incelerken muazzam bir potansiyele izin verir. Ek olarak, bu tahlillerin yapılması nispeten basittir ve deneysel hedefe bağlı olarak kolayca özelleştirilebilir. Benzer teknikler, bağışıklık sisteminin T hücresi metabolik regülasyonunu18,19, kanser başlangıcını ve progresyonunu 20 ve metabolik sendromlara katkıda bulunan diğer birçok hücre tipi21,22'yi daha iyi anlamak için kullanılmıştır.
Gerçek zamanlı metabolik akı analizörünün alternatif tekniklere göre avantajları arasında (1) canlı hücrelerin hücresel biyoenerjetik değerlerini gerçek zamanlı olarak ölçme yeteneği, (2) nispeten az sayıda hücreyle tahlil yapabilme yeteneği (5.000 hücre kadar düşük hücre gerektirir), (3) yüksek verimli 96 kuyucuklu bir sistemde birden fazla tedaviyi paralel olarak manipüle etmek için enjeksiyon portları, (4) normalizasyon için radyoaktif etiketsiz otomatik hücre görüntüleyicisinin kullanılması18, 23,24. Aşağıdaki yöntemler, analizörü kullanarak osteoblast farklılaşması boyunca murin BMSC'lerde hücresel biyoenerjetik izlemenin genelleştirilmiş ancak ayrıntılı bir tanımını sağlamayı amaçlamaktadır. Rutin olarak gerçekleştirilen tahlilleri içerecektir; Bununla birlikte, birçok teknik ve yöntemde olduğu gibi, bireysel laboratuvarların deneyleri için belirli ayrıntıları belirlemeleri şiddetle tavsiye edilir.
Tahlil seçimi ve mevcut farklı tahlil türleri: Deneysel sonuçların güvenilirliğini ve tutarlılığını sağlarken, hücrelerin biyoenerjetik özelliklerini incelemek için çok çeşitli tahlil kitleri ve reaktifleri mevcuttur. Ek olarak, masaüstü yazılımı kolayca özelleştirilebilen tahlil şablonları da sunar. Tahlil, kullanıcının farklı metabolik parametreleri ölçme ihtiyaçlarına göre tanımlanabilir. Bu tahliller, deneysel hedefe ve / veya bilimsel soruya dayanarak çeşitli şekillerde değiştirilebilir. Örneğin, dört enjeksiyon portuyla, her metabolik yola özgü hücresel yanıtı analiz etmek için tahlil ortamına birden fazla bileşik enjekte edilebilir.
Hücre enerjisi fenotip testi: Bu tahlil, canlı hücrelerin metabolik fenotipini ve metabolik potansiyelini ölçer. Bu tahlil, yola özgü metabolizma hakkında genelleştirilmiş bir fikir edinmek için ilk adım olarak da önerilir. Hücre enerji potansiyelini anlamak için oligomisin A-ATP sentaz inhibitörü ve Karbonil siyanür 4-(triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP)-bir mitokondriyal ayrışma ajanı karışımı enjekte edilir. Oligomisin A enjeksiyonu, ATP'nin sentezini inhibe eder, bu da hücrelerin enerji taleplerini karşılamalarını sağlamak için glikoliz (ECAR) oranında bir artışa neden olur; Öte yandan, FCCP enjeksiyonu, mitokondriyal membranın depolarizasyonu nedeniyle daha yüksek OCR ile sonuçlanır. Temel olarak, bu tahlil bazal metabolik solunumu ve ikili enjeksiyonları, itmeleri veya stresleri takiben metabolik yanıtı gösterir. Bu parametrelere dayanarak, yazılım daha sonra hücreleri aerobik, sessiz, glikolitik veya zaman içindeenerjik durum 25,26 olarak sınıflandırarak hücrelerin OCR ve ECAR'ını çizer.
ATP gerçek zamanlı üretim hızı testi: Bu, hücresel ATP üretimini aynı anda glikoliz ve mitokondriyal solunumdan ölçer. Bu tahlil, iki enerji yolundan metabolik kaymaları nicel olarak ölçer ve zaman içinde mitokondriyal ve glikolitik ATP üretim oranları hakkında veri sağlar. Tahlil, bazal OCR ve ECAR verilerini elde eder, ardından oligomisin A enjeksiyonu yoluyla mitokondriyal ATP üretim hızını ve rotenon + antimisin A karışımı enjeksiyonu yoluyla glikolitik ATP üretim hızını hesaplar (mitokondriyal fonksiyonun toplam inhibisyonu), mitokondriyal asitleşme ile sonuçlanır17,27.
Hücre mitokondrisi stres testi (veya hücre mito stres testi): Bu, ATP'ye bağlı solunum yoluyla mitokondriyal fonksiyonu ölçer, hücresel biyoenerjetik faktörleri nicelleştirir, mitokondriyal disfonksiyonu tanımlar ve hücrelerin strese tepkisini ölçer. Bir tahlilde bazal ve yedek solunum kapasitesi, ATP'ye bağlı solunum, maksimal solunum ve mitokondriyal olmayan oksijen tüketimi gibi çeşitli parametreler elde edilebilir. Bu tahlil, oligomisin A, FCCP (mitokondriyal ayrışma ajanı), bunların mitokondriyal fonksiyon üzerindeki etkisini etkili bir şekilde analiz etmek için rotenon / antimisin A inhibitörlerinin bir karışımı olan sıralı enjeksiyonları içerir28.
Esneklik mito yakıt esnek testi: Bu, mitokondriyal solunum hızını, üç birincil mitokondriyal yakıtın inhibitörlerinin varlığı ve yokluğu ile oksidasyonu ile ölçer. Glikoz, glutamin ve yağ asitlerinin sıralı inhibisyonu, hücrelerin bağımlılığını, kapasitesini ve esnekliğini ve enerji talebini karşılamak için hücrelerin çeşitli hücresel yollara bağımlılığını ölçmeye yardımcı olur. Mitokondri, diğer yakıtları oksitleyerek tıkanmış ilgi yolunun taleplerini karşılayamadığında, hücreler bağımlılık durumuna girer. Hücrelerin kapasitesi, diğer iki alternatif yolun inhibisyonu ve ardından ilgilenilen yolun inhibisyonu ile hesaplanır. Hücrelerin esnekliği, mitokondrinin inhibe edilmiş yolun yakıt ihtiyaçlarını telafi etme ve karşılama yeteneğini anlamada yardımcı olur. Hücrelerin bağımlılığının hücrelerin kapasitesinden çıkarılmasıyla hesaplanır. Tahlil parametrelerini etkili bir şekilde hesaplamak için üç farklı inhibitör bağımsız olarak veya ikisinin karışımı olarak kullanılır. 2-siyano-3-(1-fenil-1H-indol-3-il)-2-propenoik asit (UK5099), glikolizde piruvat taşıyıcısını bloke ederek glikozun oksidasyonunu inhibe eder. Bis-2-(5-fenilasetamido-1,3,4-tiadiazol-2-il) (BPTES) etil sülfür glutamin oksidasyon yolunu inhibe eder ve etomoksir uzun zincirli yağ asitlerinin oksidasyonunu inhibe eder29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig01.jpg"> Şekil 1: Osteoblastların kültürlenmesi ve analiz için hazırlanması için metodolojinin şematik gösterimi. Murin BMSC'ler uzun kemiklerden izole edilir, kültürlenir ve 25.000 hücre / kuyu yoğunluğunda 96 kuyucuklu plakalarda tohumlanır. Bu hücrelerin Osteoblast spesifik ortamlarda kültürlenmesi, farklılaşmalarına başlamak için% 80-100 akıcılığa ulaştıklarında başlar. Tahliller farklılaşmanın farklı aşamalarında gerçekleştirilir. Kartuş plakaları tahlilden bir gün önce nemlendirilir. Tahlil gününde, sensör kartuşlarının portlarına tahlil gereksinimlerine göre farklı inhibitörler enjekte edilir ve 96 delikli kalibrasyon plakasına bir kalibrasyon tamponu eklenir. Kalibrasyondan sonra, gerçek zamanlı hücre metabolik akı testi yapılır, ardından gerçek zamanlı hücre metabolik akı analizörü verilerini hücre sayısı ile normalleştirmek için mikroplaka görüntüleyiciyi kullanarak hücre kültürü mikroplakası görüntülenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63142/63142fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>% 0.25 Tripsin EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>2-siyano-3- (1-fenil-1H-indol-3-il) -2-propenoik asit</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>PZ0160</td><td>UK5099</td></tr><tr><td>Antimisin A</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Askorbik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544-100G</td><td></td></tr><tr><td>Bis-2- (5-fenilasetamido-1,3,4-tiadiiyazol-2-il) etil sülfür</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>SML0601</td><td>BPTES</td></tr><tr><td>Karbonil siyanür 4- (triflorometoksi) fenilhidrazon</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C2920</td><td>FCCP</td></tr><tr><td>Cytation 5 görüntüleme okuyucu</td><td>BioTek</td><td>N / A</td><td>Mikroplaka görüntüleyici</td></tr><tr><td>Etomoksir sodyum tuzu hidrat</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>E1905</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Çözelti (20 mM)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>sığır serumu Sigma'dan Oleik Asit-Albümin</td><td>- Aldrich</td><td>O3008</td><td></td></tr><tr><td>Oligomisin A - 5 mg</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>R8875-1G</td><td></td></tr><tr><td>Denizatı XF 1.0 M Glikoz Çözeltisi</td><td>Agilent Technologies</td><td>103577-100</td><td></td></tr><tr><td>Denizatı XF 100mM Piruvat Çözüm</td><td>Agilent Technologies</td><td>103578-100</td><td></td></tr><tr><td>Denizatı XF 200mM Glutamin çözeltisi</td><td>Agilent Technologies</td><td>103579-100</td><td></td></tr><tr><td>Denizatı XF DMEM ortamı</td><td>Agilent Technologies</td><td>103575-100</td><td>DMEM tahlil ortamı 5mM HEPES, pH 7.4, fenol kırmızısı, sodyum bikarbonat, glikoz, piruvat ve L-glutamin içermez</td></tr><tr><td>Denizatı XFe96 Analizörü</td><td>Agilent Technologies</td><td>S7800B</td><td>Gerçek Zamanlı Metabolik akı analizörü</td></tr><tr><td>Denizatı XFe96 FluxPak</td><td>Agilent Technologies</td><td>102416-100</td><td>XFe96 Sensör kartuşları, Hücre kültürü mikroplakaları ve Denizatı XF Kalibrant çözümünü içerir</td></tr><tr><td>Hücre görüntüleme 1.1.0.11 yazılımı</td><td>Agilent Technologies - BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wave yazılımı 2.6.1</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-gliserol fosfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422-50G</td><td></td></tr></tbody></table>

osteoblast biyoenerjetik teknolojilerini İzlemek için gerçek zamanlı hücre metabolik akı analizörünü kullanma

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Osteoblastlarla kemik oluşumu, iskelet homeostazını korumak ve nihayetinde kırılmayı önlemek için uygun kemik edinimi ve kemik döngüsü için gerekli bir süreçtir. Hem pik kemik kütlesini optimize etmek hem de çeşitli kas-iskelet sistemi hastalıklarıyla (yani menopoz sonrası osteoporoz, anoreksiya nervoza, tip 1 ve 2 diabetes mellitus) mücadele etmek amacıyla, kemik biyolojisi alanında, osteoblastları farklılaşma süreçleri boyunca tam olarak karakterize etmek için inanılmaz çabalar sarf edilmiştir. Olgun osteoblastların matriks proteinlerini ve mineralizasyon veziküllerini salgılamadaki birincil rolü göz önüne alındığında, bu işlemlerin inanılmaz miktarda hücresel enerji veya adenozin trifosfat (ATP) aldığı belirtilmiştir. Genel hücresel enerji durumu genellikle hücresel biyoenerjetik olarak adlandırılır ve hücresel ihtiyaçları karşılamak için ATP'yi türetmek için substrat kullanılabilirliğini algılayan bir dizi metabolik reaksiyon içerir. Bu nedenle, mevcut yöntem, osteoblast farklılaşmasının çeşitli aşamalarında Gerçek zamanlı hücre metabolik akı analizörü kullanarak birincil, murin kemik iliği stromal hücrelerinin (BMSC'ler) izole edilmesi ve biyoenerjetik durumlarının izlenmesi sürecini detaylandırmaktadır. Önemli olarak, bu veriler metabolik profilin osteoblast farklılaşması boyunca dramatik bir şekilde değiştiğini göstermiştir. Bu nedenle, fizyolojik olarak ilgili bu hücre tipinin kullanılması, bir hücrenin biyoenerjetik durumunun genel işlevi nasıl düzenleyebileceğini tam olarak anlamak için gereklidir.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig06.jpg"> Şekil 6: Kontrol ve tedavi grubunun hücresel biyoenerjetik profilini kendi standart hatalarıyla anlamak için rutin olarak yapılan analizler için temsili grafikler . (A) Hücre enerjisi fenotip testi. Grafik, kontrolün glikolizini (ECAR) ve mitokondriyal solunumu (OCR) ve iki tedavi grubunu (n = 3) temsil eder. Oligomisin A ve ...

Gerçek zamanlı hücre metabolik akısı testi, pH ve oksijen sensörlerini kullanarak mitokondriyal ve glikolitik adenozin trifosfat üretimine karşılık gelen oksijen tüketim oranını ve hücre dışı asitleşme oranını ölçer. Bu yazıda osteoblastların enerji durumunu ve hücresel biyoenerjetik durumun karakterizasyonu ve yorumlanmasını anlamak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Osteoblast Biyoenerjetik Teknolojilerini İzlemek için Gerçek Zamanlı Hücre Metabolik Akı Analizörünü Kullanma

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Bu yöntem, ATP üretim hızı gibi hücresel enerjileri belirlemede ve ayrıca gerçek zamanlı olarak belirli bir metabolite yönelik hücresel tercihi belirlemede yararlıdır. Başlamak için, 200 mikrolitre XF kalibrant ekleyin ve yardımcı plakayı tahlilden en az bir saat önce inkübe edin. Takviyeli XF DMEM kullanarak 80 mililitre XF tahlil ortamı hazırlayın.Oligomisin A, rotenon ve antimisin A'yı buz üzerinde çözün. Kullanmadan önce bileşikleri çözündürmek için yukarı ve aşağı pipetleyin. Her tüpe üç mililitre hazırlanmış tahlil ortamı ekleyin, A ve B etiketli 26.4 mikrolitre 2.5 milimolar oligomisin A tüpüne ve 3.1 mikrolitre 12.67 milimolar rotenon, 4.1 mikrolitre 9.4 milimolar antimisin A ve 30 mikrolitre Kanca lekesini B tüpüne ekleyin.Ve son olarak, bu bileşiklerin 20 mikrolitresi, 200 mikrolitre tahlil ortamındaki hücrelere yüklenecektir. Hücre kültürü mikroplakasını 37 santigrat derece inkübatörden çıkarın ve mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin. Tahlil ortamını su banyosundan çıkarın.Hücreleri iki kez 200 mikrolitre önceden ısıtılmış tahlil ortamı ile nazikçe yıkayın ve kuyu başına 200 mikrolitre tahlil ortamı ekleyin. Hücrelerin kuyucuklara yapışmış kalmasını sağlamak için mi

using-real-time-cell-metabolic-flux-analyzer-to-monitor-osteoblast

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Hücrelerinde mitokondriyal fonksiyon profil için bir yöntem bir açıklaması sağlanmaktadır. Bazal solunum hızı, solunum ATP bağlantılı, proton kaçak ve rezerv kapasitesi: mitokondriyal Profil üretilen bir deneyde ölçülebilir dört parametre mitokondriyal fonksiyon sağlar.

C2C12 Myoblast Hücreler kullanarak Bioenerjetik bilgileri Deney

Bu protokol, hücre dışı akı testi ile primer lösemik hücrelerin hücre dışı asitlenme oranını (ECAR) ve oksijen tüketim oranını (OCR) ölçmek için biyokimyasal bir yaklaşım sağlar. Bu hücrelerin metabolik profilinin değerlendirilmesi, taleplerinin karakterize edilmesine yardımcı olarak kişiselleştirilmiş tedaviye yol açar.

Hücre Dışı Akı Deneyi: Hücrelerin Metabolik Profilini Ölçmek İçin Bir Yöntem

Kaynak:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Oroboros EnstrümanlarıBu video, canlı ve geçirgen memeli hücrelerinde mitokondriyal solunumu değerlendirmek için oksijen akışının nasıl kullanıldığını açıklamaktadır. Farklı solunum durumlarını karakterize etmek için digitonin, metabolik substratlar, ADP, bir ayırıcı ve bir inhibitörün sıralı kullanımını gösterir. Ortaya çıkan oksijen akışı profili, tanımlanmış koşullar altında mitokondriyal fonksiyonu ve enerji...

Canlı ve geçirgen hücrelerde mitokondriyal solunumu değerlendirmek için oksijen akısı ölçümleri

Bu video, hücre dışı akı analizörü kullanarak aktive edilmiş insan NK hücrelerinde enerji metabolizmasını analiz etme yöntemini göstermektedir. Elektron taşıma zinciri komplekslerinin farklı inhibitörleri, oksijen tüketim oranı veya OCR ile ölçülen ATP sentezini etkiler ve hücresel metabolizma ve biyoenerjetik hakkında bilgi sağlar.

Hücre dışı akı analizörü kullanılarak insan NK hücrelerinde enerji metabolizmasının gerçek zamanlı izlenmesi

Metabolik yeniden programlama, M1 ve M2 makrofaj polarizasyonu için bir özellik ve önkoşuldur. Bu el yazması, fare kemik iliği türevli makrofajlarda glikoliz ve mitokondriyal fonksiyonun temel parametrelerinin ölçümü için bir testi açıklamaktadır. Bu araç, belirli faktörlerin makrofajın metabolizmasını ve fenotipini nasıl etkilediğini araştırmak için uygulanabilir.

Gerçek zamanlı Ekstrasellüler Flux Analizi Polarize M1 ve M2 Kemik İliği-türevli Makrofagların Metabolik Karakterizasyonu

İnsan retinal pigment epitel hücrelerinin (H-RPE) metabolik durumu, sağlıklarını ve işlevlerini yansıtır. Burada, yüksek çözünürlüklü respirometri kullanarak H-RPE'nin gerçek zamanlı metabolik akısını incelemek için optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır.

Primer İnsan Retinal Pigment Epitel Hücrelerinde Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanılarak Biyoenerjetik Biyoenerjetik Analizinin Gerçek Zamanlı Analizi

Metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanarak fare ve insan nötrofillerinin ve HL60 hücrelerinin mitokondriyal solunumunu ölçen kademeli protokolleri açıklıyoruz.

Nötrofillerin mitokondriyal biyoenerjetik profilinin gerçek zamanlı ölçümü

Burada, kemik iliği, dalak ve enfarktüslü kalpten makrofajların çıkarılması ve ardından canlı hücrelerdeki metabolik akışın değerlendirilmesi için yöntemleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Dalak ve Kardiyak Makrofajlarda ve Kemik İliği Monositlerinde Ex Vivo Metabolik Akının Analizi

Plazma zarını seçici olarak geçirimli hale getiren bir protokol sunuyoruz; böylece kültürlenmiş hücrelerde mitokondriyal oksidatif fosforilasyonu (OXPHOS) değerlendirmek için substratlar ve inhibitörlerin hedefli şekilde teslim edilmesini sağlıyoruz ve genellikle bu tür analizleri engelleyen plazma zarı taşıma engellerini aşıyoruz. Bu teknikle, OXPHOS fonksiyonunun muskarinik agonistler ve antagonistler tarafından nasıl modüle edildiğini gösterdik.

Digitonin-permeabilize BE(2)-C nöroblastom hücrelerinde oksidatif fosforilasyon bağlanmasının kolinergik ligand-bağımlı modülasyonu

Biz gelecekteki nükleik asit temelli tedaviler için daha iyi kontrol ve sentez üniforma ve özelleştirilebilir polyplexes sağlaması bekleniyor polielektrolit polyplexes oluşumunu araştırmak için yeni ve güçlü bir entegrasyon sahipliği yapacaktır (QD-FRET) ve Mikroakiskan sunuyoruz.

Birleştiren QD FRET Mikroakiskan Real-Time DNA Nanocomplex Self-Meclis Monitör

Öğrenin, osteoblast biyoenerjetiğini gerçek zamanlı metabolik akı analizi ile inceleyin. Oksijen tüketimi ve ekstraselüler asidifikasyon oranlarını ölçerek ATP üretimini değerlendirin.

Osteoblast Biyoenerjetik Teknolojilerini İzlemek için Gerçek Zamanlı Hücre Metabolik Akı Analizörünü Kullanma

Daha fazla video keşfet