Osteoblast Biyoenerjetik Teknolojilerini İzlemek için Gerçek Zamanlı Hücre Metabolik Akı Analizörünü Kullanma

Gerçek zamanlı hücre metabolik akısı testi, pH ve oksijen sensörlerini kullanarak mitokondriyal ve glikolitik adenozin trifosfat üretimine karşılık gelen oksijen tüketim oranını ve hücre dışı asitleşme oranını ölçer. Bu yazıda osteoblastların enerji durumunu ve hücresel biyoenerjetik durumun karakterizasyonu ve yorumlanmasını anlamak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Bu yöntem, ATP üretim hızı gibi hücresel enerjileri belirlemede ve ayrıca gerçek zamanlı olarak belirli bir metabolite yönelik hücresel tercihi belirlemede yararlıdır. Başlamak için, 200 mikrolitre XF kalibrant ekleyin ve yardımcı plakayı tahlilden en az bir saat önce inkübe edin. Takviyeli XF DMEM kullanarak 80 mililitre XF tahlil ortamı hazırlayın.

Oligomisin A, rotenon ve antimisin A'yı buz üzerinde çözün. Kullanmadan önce bileşikleri çözündürmek için yukarı ve aşağı pipetleyin. Her tüpe üç mililitre hazırlanmış tahlil ortamı ekleyin, A ve B etiketli 26.4 mikrolitre 2.5 milimolar oligomisin A tüpüne ve 3.1 mikrolitre 12.67 milimolar rotenon, 4.1 mikrolitre 9.4 milimolar antimisin A ve 30 mikrolitre Kanca lekesini B tüpüne ekleyin.

Ve son olarak, bu bileşiklerin 20 mikrolitresi, 200 mikrolitre tahlil ortamındaki hücrelere yüklenecektir. Hücre kültürü mikroplakasını 37 santigrat derece inkübatörden çıkarın ve mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin. Tahlil ortamını su banyosundan çıkarın.

Hücreleri iki kez 200 mikrolitre önceden ısıtılmış tahlil ortamı ile nazikçe yıkayın ve kuyu başına 200 mikrolitre tahlil ortamı ekleyin. Hücrelerin kuyucuklara yapışmış kalmasını sağlamak için mikroskop altındaki hücreleri kontrol edin. D5 ve E8 kuyularındaki hücrelerin tutarlı bir tek katmanla yapıştırıldığından ve yıkama adımı sırasında yıkanmadığından emin olun.

Hücre görüntüleme yazılımı, otomatik odaklamayı ve otomatik pozlamayı ayarlamak için bu iki kuyuyu kullanır. Bilgisayarda ekipmanın yanındaki masaüstü yazılımını açın. Oyun kumandası yazılımının sol alt köşesindeki bağlantı durumunu kontrol edin.

Şablonlar'a gidin ve XF ATP oranı tahlil şablonunu veya uygun tahlil şablonunu seçin. Ekranın üst kısmındaki Grup Tanımları'nı seçin ve grupları tanımlayın. plaka haritası düzenini seçin ve tanımlanan gruplara bağlı olarak kuyuları atayın.

Cihaz protokolünü doğrulayın. Eklenen bileşiklerin doğru listelendiğinden emin olun ve gelecekteki referanslar için proje bilgilerini ekleyin. Tahlil Çalıştır'a tıklayın.

Bu, sonuç dosyası depolama konumunun seçilmesini ister. Sonuç dosyasının kaydedileceği konumu seçin. Dosyayı tahlil tarihi ile kaydedin ve Çalıştırmayı Başlat'a tıklayın.

Sensör kartuşunu ve yardımcı program plakasını tepsiye yerleştirin ve kalibrasyonu başlatmak için Hazırım'a tıklayın. Bilgisayardaki hücre görüntüleme yazılımını açın. Mikro plakalı görüntüleyicinin açık olduğundan ve bağlantı noktalarının bilgisayara bağlı olduğundan emin olun.

Sıcaklığın 37 santigrat dereceye ayarlandığından ve bağlantı durumunun hazır olarak yeşil renkle vurgulanması gerektiğinden emin olmak için ekranın sol alt köşesindeki durum çubuğunu kontrol edin. Görüntüleme işlemini başlatmak için plaka barkodunu tarayın. Hücre plakasına bir ad verin ve Kaydet'e basın.

Parlak alan ve floresan görüntüler buraya kaydedilecektir. Brightfield Taraması Gerçekleştir'e tıklayın ve bir sonraki ekranda, Plaka ve Tarama Menüsü görüntüleme seçeneklerini gösterir. Tahlilden önce Brightfield Taramasını Başlat'ı seçin.

Hücre kültürü mikro plakasını ve plaka kapağını tepsi tutucuya yerleştirin ve A1 işaretini A1 ile iyice hizalayın. Tepsiyi Kapat'a tıklayın. Brightfield görüntü alımı, bir sonraki ekranda bir plaka haritasıyla birlikte görünür.

Scan All Wells'e tıklayın ve 30 ila 35 dakika boyunca tarayın. Kalibrasyon tamamlandığında, yazılım Yük Hücresi Plakası iletişim kutusunu görüntüler. Ardından, yardımcı program tepsisini bir hücre kültürü mikro plakasıyla değiştirmek için Tepsiyi Aç'a tıklayın.

Hücre kültürü plakasının mikro plaka görüntüleyicide olduğunu unutmayın. Taramadan sonra, hücre kültürü mikroplakasını çıkarın ve tahlili gerçekleştirmek için analizöre yerleştirin. Ardından, tahlili başlatmak için Yük Hücre Plakası'na tıklayın.

Tahlil başlayana kadar bekleyin ve tahmini tamamlanma süresini görüntüleyin. Tahlil tamamlandıktan sonra, yazılım Boşaltma Sensörü Kartuşu ve Hücre Plakası iletişim kutusunu görüntüler. Çıkar'a tıklayın ve hücre kültürü mikroplakasını analizörden çıkarın.

Sensör kartuşunu dikkatlice çıkarın ve hücre plakası kapağını yerine takın. Tahlil Tamamlandı iletişim kutusu görüntülenir. Ardından, tahlil sonucu dosyasını açmak veya verileri normalleştirmek için Sonuçları Görüntüle'ye tıklayın.

Tahlil tamamlandıktan sonra, el tipi barkod okuyucu ile plaka barkodunu tarayın. Plaka zaten görüntülenmişse, yeni bir isim gerektirmez. Floresan ve Hücre Sayısı'nı seçin.

Hücre plakasını tepsi tutucuya yerleştirin ve Tepsiyi Kapat'a tıklayın. Görüntü alma penceresinde, görüntülemeye başlamak için Tüm Kuyuları Tara'yı seçin. Görüntüleme ve hücre görüntüleme uygulamasındaki floresan görüntüleri ve hücre sayımlarını, birkaç kuyucuğa rastgele tıklayarak gözden geçirin.

Floresan görüntüleme tamamlandıktan sonra, ek referanslar için görüntüleri dışa aktarın. Görüntüleme ve hücre sayımı tamamlandıktan sonra, sonuç dosyasını açın ve Normalleştir'e tıklayın. İçe Aktar'a tıklayın ve tahlili hücre sayısıyla otomatik olarak normalleştirmek için masaüstü yazılımı için Uygula'yı seçin.

Oligomisin A ve FCCP stresör karışımı enjeksiyonu, kontrol grubunun temel aktivitesini arttırdı. Stresörler, bir grubun kontrolünde ve tedavisinde anlamlı derecede yüksek bir enerji seviyesi gösterdi. Öte yandan, tedavi iki nispeten daha düşük bir temel aktiviteye sahipti ve hücreler daha aerobik hale geldi.

Şekil, hem kontrol hem de deneysel hücrelerin ATP üretimi için glikoliz ve mitokondriyal oksidatif fosforilasyon kullandığını göstermektedir. Deney grubu, glikoliz yoluyla ATP üretiminde bir azalma ve mitokondriyal solunumda bir artış göstermektedir. Tedavi grubundaki bazal solunum hızı kontrol grubuna göre nispeten daha azdır.

Her iki grupta da solunum ve ATP üretim hızları, proton sızıntısı ve ardından oligomisin A enjeksiyonu ile birlikte azalır. Hücrelerin solunum hızları, FCCP enjeksiyonundan sonra tekrar maksimum solunumlarına geri döner. Son rotenon ve antimisin A enjeksiyonu OCR'yi tekrar azaltır.

Üçüncü enjeksiyondan sonra, mitokondriyal solunum rotenon ve antimisin kombinasyonu ile kapatılır A.Kontrol grubuna kıyasla, tedavi gruplarının bazal ve maksimal solunumunda nispeten bir değişiklik yoktur. Şekil, kontrol grubunun glikoz yoluna büyük ölçüde bağımlı olduğunu, glutamin oksidasyonunun ise kontrol grubunda etkili olduğunu göstermektedir. Yağ asidi yolu, tedavinin hücrelerin genel kapasitesini arttırdığını göstermektedir.

Asit plakası üzerinde çoklu enjeksiyon portlarının mevcudiyeti, birden fazla ilacın hücresel enerjiler üzerindeki etkisini tek bir zaman noktasında belirlememize yardımcı olur.