Hücre Tipine Özgü RNA'ları, Hücre Sıralama Olmadan Dondurulmuş Heterojen Doku Örneklerinden İzole Edin
8 Aralık 2021
Bu protokol, NuTRAP fare modelini kullanarak hücre tipine özgü çeviri ribozomal mRNA'ları izole etmeyi amaçlamaktadır.
Bu protokol, hücre sıralaması olmadan karmaşık bir dokudaki az sayıda hücreden yüksek kaliteli hücre tiplerine özgü RNA'lar elde etmeyi amaçlamaktadır. Araştırmacıların GLP pull down kullanarak ribozom bağlı RNA'ları izole etmelerini sağlayan yakın zamanda mevcut bir fare modeli kullanıyor. Yöntem ayrıca, ribozom bağlı RNA'ları herhangi bir EGFP eksprese eden hücreden izole etmek için de uygundur.
Başlamak için, bir cam doku öğütücü setine iki mililitre buz gibi soğuk homojenizasyon çalışma tamponu ekleyin. Dondurulmuş numuneyi hızlı bir şekilde öğütücüye yerleştirin ve gevşek bir havane kullanarak dokuyu buz üzerinde 30 vuruşla homojenleştirin. homojenatı iki mililitrelik yuvarlak bir alt boruya aktarın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 12.000 g'da santrifüj yapın.
Daha sonra süpernatantı peleti rahatsız etmeden iki mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve giriş olarak 100 mikrolitre ayırın. Süpernatantı anti-GFP antikoru ile bir uçtan uca rotatörde dört santigrat derecede bir gecede inkübe edin. Homojenat ve antikor karışımını, yıkanmış protein g boncukları içeren yeni bir iki mililitrelik yuvarlak alt tüpe aktarın ve iki saat boyunca 24 RPM'de rotatörde dört santigrat derece inkübe edin.
Manyetik bir raf kullanarak manyetik boncukları süpernatanttan ayırın. Süpernatantı EGFP negatif hücrelerindeki RNA'ları ve ribozomlara bağlı olmayan EGFP pozitif hücrelerdeki RNA'ları içeren negatif fraksiyon olarak kaydedin. Boncuklara bir mililitre yüksek tuzlu yıkama tamponu ekleyin ve boncukları yıkamak için tüpü kısaca vorteksleyin.
Ardından tüpü manyetik bir rafa yerleştirin. Yıkama tamponunu çıkarın ve boncuk ribozom RNA kompleksini EGFP pozitif hücrelerden elde etmek için yıkama adımlarını iki kez daha tekrarlayın. RNA'ları boncuklardan serbest bırakmak için boncukları bir ThermoMixer'daki RNA izolasyon kitinden 50 mikrolitre ekstraksiyon tamponu ile 30 dakika boyunca inkübe edin.
Boncukları manyetik bir rafla ayırın ve süpernatantı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü iki dakika boyunca 3000 g'da santrifüj yapın. Ardından süpernatantı yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe pipetleyin.
RNA saflaştırma kolonunu ön koşullandırmak için, saflaştırma kolonuna 250 mikrolitre şartlandırma tamponu pipetleyin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra sütunu bir dakika boyunca 16.000 g'da santrifüj edin. Hücre ekstraktına eşit hacimde% 70 etanol pipetleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın.
Önceden koşullandırılmış RNA saflaştırma kolonuna 200 mikrolitreye kadar pipet. Numune kaybını azaltmak için kolonu, kapasitesinin% 80'inden fazlasını doldurmayın. Tüm RNA'lar her fraksiyonun aynı sütununda toplanana kadar bu adımı birkaç kez tekrarlayın.
RNA'yı kolondaki zara bağlamak için sütunu iki dakika boyunca santrifüj edin. Ardından 30 saniye boyunca santrifüjlemeye devam edin. Akış akışını atın ve pipetteki 100 mikrolitre yıkama tamponunu bir tanesi kolona atın.
Bir dakika boyunca santrifüj yapın, ardından akışı atın. Pipet 75 mikrolitre DNA çözeltisi doğrudan arıtma kolon membranına karışır. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
Daha sonra, pipet 40 mikrolitre yıkama tamponunu bir kolona yerleştirir ve 30 saniye daha santrifüj yapar. Akışı atın. Pipet 100 mikrolitre yıkama tamponunu iki kolona yerleştirin ve bir dakika boyunca 8.000 g'da santrifüj yapın.
Akışı atın. PET 100 mikrolitre yıkama tamponunu kolona iki kez satın alın ve iki dakika boyunca 16.000 g'da santrifüj yapın. Akışı atın ve tüm yıkama tamponu izlerini gidermek için aynı sütunu bir dakika boyunca 16.000 g'da yeniden santrifüj yapın.
Kolonu yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. pipet 12 mikrolitre RNaz içermeyen su doğrudan arıtma kolonunun membranına pirinç ucunun membrana temas etmemesini sağlar. Bir dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin ve bir dakika boyunca 1000 g'da santrifüj yapın.
Daha sonra RNA'yı etkisiz hale getirmek için bir dakika boyunca 16.000 G'de. Ekstrakte edilen RNA'nın kalitesini ve miktarını değerlendirmek için bir biyoanalizör kullanın. RNA'ları 80 derecelik bir dondurucuda saklayın veya daha fazla analiz için gönderin.
Hem genetiği değiştirilmiş gen alelleri, Gli1-CreERT2 hem de NuTRAP taşıyan farelere, günde bir kez, her gün üç enjeksiyon için tamoksifen enjekte edilir. Toplanan dokuların immünofloresan analizi, EGFP'nin testislerdeki interstisyel hücrelerde eksprese edildiğini göstermektedir. EGFP ayrıca Gli1-CreERT2, NuTRAP farelerde adrenal kapsüler hücrelerde bulundu.
Sonic Hedgehog-CreERT2'de, NuTRAP fareleri EGFP pozitif hücre popülasyonu, kapsülün altındaki adrenal bezin dış korteksinde bulunur ve EGFP ön eksprese eden hücrelerin ekspresyonunu doğrular. Hücre tipine özgü RNA'ların ekstraksiyonundan sonra, ekstrakte edilen RNA mikroarray analizi için gönderildi. Sonuçlar, negatif fraksiyondaki genlere kıyasla, pozitif fraksiyonda yaklaşık 3000 genin zenginleştirildiğini, oysa negatif fraksiyonda yaklaşık 4.000 genin zenginleştirildiğini göstermiştir.
Diferansiyel eksprese genler arasında, Leydig hücresi ile ilişkili genler Hsd11b1 ve Hsd3b6 pozitif fraksiyonda zenginleştirildi. Negatif fraksiyonda, Sertoli hücresi ile ilişkili genler Desert Hedgehog ve Gstm6 zenginleştirildi. Negatif fraksiyonun girdi ile karşılaştırılmasında sadece birkaç farklı şekilde eksprese edilen gen tanımlanmıştır.
Pozitif ve negatif fraksiyonlardaki anahtar genlerin ekspresyonunu doğrulamak için gerçek zamanlı kantitatif RT-PCR kullanıldı. Mikroarray testinde bulunanlara benzer şekilde, steroidojenik enzimler 3-beta hidroksi steroid dehidrogenaz ve kolesterol yan zincir bölünme enzimi pozitif fraksiyonda zenginleştirildi. Bu arada, Sertoli hücre belirteci SRY kutusu transkripsiyon faktörü dokuz ve germ hücre belirteci sinaptonemal kompleks protein üçü negatif fraksiyonda zenginleştirildi.
Bu protokolü denerken, taze homojenizasyon çalışma tamponu hazırlamak önemlidir DTT, sikloheksimid rekombinant ribonükleaz ve proteinaz inhibitörü kokteylini homojenizasyon stok çözeltisine sadece kullanımdan önce ekleyin. Kullanmadan önce taze düşük tuz ve yüksek tuzlu yıkama tamponlarının hazırlanması da önemlidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, hücre ayırma işlemine gerek kalmadan küçük hücre popülasyonlarından yüksek kaliteli RNA'ların elde edilmesine olanak tanıyan NuTRAP fare modeli kullanılarak hücre tipine özgü translasyon yapan ribozomal mRNA'ların izole edilmesi yöntemini özetlemektedir. Bu yöntem, özellikle EGFP eksprese eden hücrelerin incelenmesi ve belirli hücre tipleriyle ilişkili diferansiyel eksprese olan genlerin belirlenmesi için faydalıdır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Hücre biyolojisi
- Moleküler biyoloji
Arka Plan
- NuTRAP fare modeli, ribozoma bağlı RNA'nın izole edilmesini sağlar.
- Bu yaklaşım, heterojen dokularda hücre ayıklamanın getirdiği komplikasyonları önler.
Kullanılan Yöntemler
- Ribozoma bağlı RNA izolasyonu için GLP pull down
- NuTRAP fare modeli
- Gen ekspresyonu doğrulaması için mikroarray analizi ve RT-PCR
Temel Sonuçlar
- Pozitif RNA fraksiyonunda yaklaşık 3000 gen zenginleşirken, negatif fraksiyonda 4000 gen zenginleşmiştir.
- Leydig hücreleri ve Sertoli hücreleri ile ilgili spesifik genler, ilgili RNA fraksiyonlarında belirlenmiştir.
- Kilit enzim genleri, mikroarray bulgularıyla tutarlı bir zenginleşme göstermiştir.
Sonuçlar
- Çalışma, hücre tipiye özgü RNA'ların izole edilmesi için güvenilir bir yöntem sunmaktadır.
- Bulgular, farklı testis hücre tiplerindeki gen ekspresyonunun anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektördeki Uygulama Alanları
Heterojen dokulardan hücre ayıklama işlemi yapmadan hücre tipine özgü RNA'ların izole edilmesi, hedef doğrulama ve mekanistik risk azaltma süreçlerindeki temel bir zorluğu gidermektedir. TRAP tabanlı NuTRAP yöntemi, tanımlanmış hücre popülasyonlarının tekrarlanabilir ve kantitatif transkriptomik profillemesini sağlayarak erken keşif aşamasındaki öngörü güvenini destekler. Bu yaklaşım, biyolojik gürültüyü azaltır ve keşiften preklinik doğrulamaya kadar olan translasyonel sürekliliği artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Kompleks dokular içindeki spesifik hücre tiplerinde terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Hücre ayıklamadan kaynaklanan artefaktları önleyerek, güvenilir hedef doğrulaması için yerel RNA durumlarını korur.
- Öngörücü Değer: Hastalıkla ilgili sistemlerde biyobelirteç keşfini ve yolakların aydınlatılmasını destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Alt akış analiz geliştirme çalışmaları için standartlaştırılmış, ribozoma bağlı RNA girdileri üretir.
- Operasyonel Değer: Yüksek kapasiteli tarama hazırlığına uygun, tekrarlanabilir ve kantitatif çıktılar sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: Sınırlı başlangıç materyali ile uyumludur ve birden fazla EGFP eksprese eden modelde yeniden kullanıma olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Yerli doku ortamlarından hücre tipine özgü transkriptomları yakalayarak hastalıkla olan ilgiyi korur.
- Operasyonel Değer: Tutarlı RNA izolasyon mantığını kullanarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
- Risk Azaltma: Hedef etkileşimi ve fenotipik tarama sonuçlarındaki mekanistik belirsizliği azaltır.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, özellikle hücre tipi çözünürlüğünün mekanistik içgörü için kritik olduğu durumlarda, hedef belirlemeden öncü bileşik optimizasyonuna kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlar. Bileşik tarama kampanyalarından önce hipotez testini ve biyolojik risk azaltmayı destekler.
- Keşif Biyolojisi: Belirli hücre popülasyonlarından translasyon yapan RNA'ları izole ederek heterojen dokularda hassas hipotez testleri yapılmasına olanak tanır.
- Tarama: Analiz doğrulaması ve tekrarlanabilirlik testleri için uygun, standartlaştırılmış, ribozomla ilişkili RNA havuzları üretir.
- Analitik: Koşullar arası karşılaştırma ve hedef önceliklendirmesine imkan veren kantitatif gen ekspresyon verileri (örneğin; microarray, RT-PCR) sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Testis ve adrenal bez gibi karmaşık organlarda hücre tipine özgü sinyalleri koruyarak, erken keşifleri preklinik çalışmalara bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla Cre-sürücü ve NuTRAP hattına uyarlanabilir olduğundan, hücre tipine özgü omik çalışmaları için ölçeklenebilir bir platform niteliğindedir.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Heterojen dokulardan kaynaklanan karıştırıcı sinyalleri azaltarak hedef doğrulama güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış lizis, IP ve RNA geri kazanım adımları kullanarak laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu geliştirir.
- Stratejik Değer: Portföy seçimi için daha temiz ve daha yorumlanabilir transkriptomik veriler sağlayarak karar verme süreçlerini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Gerçek hücre tipine özgü sinyalleri izole ederek, sonraki doğrulama aşamalarındaki hatalı yönlendirmeleri azaltır ve risk ayarlı ilerlemeyi mümkün kılar.
Uygulama Hususları
- Doku işleme, immünopresipitasyon ve RNA koruma tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Manyetik raflara, ThermoMixer'lara, santrifüjlere ve RNA saflaştırma kolonlarına erişime bağlıdır.
- RNaz aktivitesini önlemek için kullanım öncesinde taze olarak standartlaştırılmış tampon hazırlığı (homojenizasyon, yıkama, elüsyon) gereklidir.
- Adaptasyon değerlendirmeleri, yeni Cre-sürücü modellerinde EGFP ekspresyon seviyelerinin ve ribozom bağlanma verimliliğinin doğrulanmasını içerir.
- Pratik sınırlamalar arasında başlangıç doku miktarı kısıtlamaları ile optimize edilmiş antikor ve boncuk konsantrasyonlarına duyulan ihtiyaç yer alır.
