Name: Hücre Tipine Özgü RNAları, Hücre Sıralama Olmadan Dondurulmuş Heterojen Doku Örneklerinden İzole Edin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Öğrenin, NuTRAP fare modeli ve GLP pull-down kullanarak dondurulmuş heterojen dokulardan hücre tipine özgü ribozom bağlı RNA'ları hücre sıralama olmadan izole etme yöntemini. Leydig ve Sertoli hücrelerindeki gen ekspresyonunu incelemek için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen NIH R00HD082686 tarafından desteklenmiştir. Endokrin Derneği Yaz Araştırma Bursu'na H.S.Z.'ye teşekkür ederiz. Ayrıca fare kolonisini yetiştirdiği ve koruduğu için Dr. Yuan Kang'a teşekkür ederiz.

Yapılan tüm hayvan deneyleri, Auburn Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri (IACUC) tarafından onaylanan protokolleri takip etti.
NOT: Aşağıdaki protokol, Gli1-CreERT2'den P28'de bir testis (yaklaşık 100 mg) kullanır; NuTRAP fareleri (Mus musculus). Reaktiflerin hacimlerinin, numune tiplerine ve doku sayısına göre ayarlanması gerekebilir.
1. Doku toplama
<ol><li>Bir CO2 odası kullanarak fareleri ötenazileştirin,% 70 etanol ile karın yüzeyini sterilize edin.</li>
	<li>Alt karın bölgesini makasla açın ve testisleri çıkarın. Testisleri hemen çıtçıtlamak için sıvı azot (LN2) kullanın.</li>
	<li>Numuneleri kullanıma kadar LN2'nin buhar fazında saklayın.</li>
</ol>2. Reaktifler ve boncuk hazırlama
<ol><li>Homojenizasyon stok çözeltisini hazırlayın: 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, %1 NP-40 ve 1 mg/mL heparin ekleyin. Çözeltiyi kullanıma kadar 4 ° C'de saklayın (1 aya kadar).</li>
	<li>Homojenizasyon çalışma tamponunu kullanımdan önce stok çözeltisinden (adım 2.1) taze olarak hazırlayın: Homojenizasyon çalışma tamponunun gerekli miktarını yapmak için homojenizasyon stok çözeltisine DTT (son konsantrasyon: 1 mM), sikloheksimid (son konsantrasyon: 100 μg / mL), rekombinant ribonükleaz (son konsantrasyon: 200 ünite / mL) ve proteaz inhibitörü kokteyli (son konsantrasyon: 1x) ekleyin. Taze hazırlanmış çalışma tamponunu kullanana kadar buz üzerinde saklayın.</li>
	<li>Düşük tuzlu ve yüksek tuzlu yıkama tamponlarını hazırlayın:<ol><li>Düşük tuzlu yıkama tamponu hazırlamak için 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl ve% 1 NP-40 karışımı. Kullanmadan önce DTT (son konsantrasyon: 1 mM) ve sikloheksimid (son konsantrasyon: 100 μg / mL) ekleyin.</li>
		<li>Yüksek tuzlu yıkama tamponu karışımı hazırlamak için 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 300 mM KCl,% 1 NP-40. Kullanmadan önce DTT (son konsantrasyon: 2 mM) ve Sikloheksimid (son konsantrasyon: 100 μg / mL) ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Protein G boncukları hazırlayın (Malzeme Tablosu):<ol><li>Her numunenin 50 μL protein G boncuğuna ihtiyacı olacaktır. Gerekli miktarda boncuğu 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpe yerleştirin ve tüpü rafta 30-60 s bırakarak manyetik bir raf kullanarak boncukları çözeltiden ayırın.</li>
		<li>Süpernatantı pipetle ile çıkarın. Boncukları her seferinde 1 mL buz gibi soğuk düşük tuzlu yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Doku lizisi ve homojenizasyon
<ol><li>Bir cam doku öğütücü setine 2 mL buz gibi soğuk homojenizasyon çalışma tamponu (adım 2.2'den itibaren taze hazırlanmış) ekleyin. Dondurulmuş numuneyi hızlı bir şekilde öğütücüye yerleştirin ve gevşek bir havane kullanarak dokuyu buz üzerinde 30 vuruşla homojenleştirin.</li>
	<li>Homojenatı 2 mL'lik yuvarlak tabanlı bir boruya aktarın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın.</li>
	<li>Süpernatantı yeni bir 2 mL tüpe aktarın. "Giriş" olarak 1,5 mL'lik bir tüpe 100 μL kaydedin.</li>
	<li>2 mL tüpteki süpernatantı 4 °C'de anti-GFP antikoru (5 μg / mL; 1:400) ile gece boyunca uçtan uca bir rotatörde (24 rpm) inkübe edin.</li>
</ol>4. İmmünsüpresipitasyon
<ol><li>Homojenat/antikor karışımını, adım 2.4'ten itibaren yıkanmış protein G boncuklarını içeren yeni bir 2 mL yuvarlak tabanlı tüpe aktarın. 4 °C'de uçtan uca bir rotatörde (24 rpm) 2 saat boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Manyetik boncukları bir mıknatıs rafı kullanarak süpernatanttan ayırın. Süpernatantı "negatif fraksiyon" olarak kaydedin. Negatif fraksiyon (1) EGFP-negatif hücrelerdeki RNA'ları ve (2) ribozomlara bağlı olmayan EGFP-pozitif hücrelerdeki RNA'ları içerir.</li>
	<li>Boncuklara 1 mL yüksek tuzlu yıkama tamponu ekleyin ve boncukları yıkamak için tüpü kısaca vorteksleyin. Tüpü bir mıknatıs rafına yerleştirin.</li>
	<li>Yıkama tamponunu çıkarın. Yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın. Boncuklar şimdi EGFP-pozitif hücrelerden boncuk-ribozom-RNA kompleksini içeriyor.</li>
</ol>5. RNA ekstraksiyonu
NOT: Aşağıdaki adımlar RNA izolasyon kitinden uyarlanmıştır (Malzeme Tablosu). Her fraksiyonu (yani girdi, pozitif ve negatif) bağımsız bir örnek olarak ele alın ve RNA'ları bağımsız olarak izole edin.
<ol><li>RNA'ları boncuklardan serbest bırakmak için 4.4. adımdaki boncukları bir termomikserde (42 ° C, 500 rpm) 50 μL Ekstraksiyon Tamponu (RNA izolasyon kitinden) ile 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Boncukları bir mıknatıs rafı ile ayırın, boncuk-ribozom-RNA kompleksini içeren süpernatantı 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Tüpü 2 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj edin, ardından süpernatantı yeni bir 1,5 mL tüpe pipetleyin. Bu tüp TRAP adımının "pozitif fraksiyonunu" içerir. NOT: Giriş ve negatif fraksiyonlar için, 1 mL Ekstraksiyon Tamponu kullanarak 25 μL numuneden RNA ekstrakte edin. Bir termomikserde (42 °C, 500 rpm) 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>RNA saflaştırma kolonunun ön koşulu: Saflaştırma kolonuna 250 μL Koşullandırma Tamponu pipeti. Oda sıcaklığında (RT) 5 dakika kuluçkaya yatırın. Kolonu 1 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüj yapın.</li>
	<li>Pipet, adım 5.3'ten itibaren süpernatanta eşit hacimde% 70 EtOH (pozitif fraksiyon için% 70 EtOH'nin yaklaşık 50 μL'si ve giriş ve negatif fraksiyonlar için% 70 EtOH'nin 1 mL'si). Yukarı ve aşağı pipetle çekerek iyice karıştırın.</li>
	<li>Karışımı adım 5.4'ten itibaren sütuna pipetleyin.</li>
	<li>RNA'nın kolondaki zara bağlanmasına izin vermek için kolonu 2 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj yapın, ardından hemen 30 s boyunca 16.000 x g'de santrifüje devam edin. Akış akışını atın. NOT: Giriş ve negatif fraksiyonlar için, her seferinde kolona 250 μL karışım ekleyin. Tüm karışımlar kullanılıncaya kadar 5.6 ve 5.7 numaralı adımları tekrarlayın.</li>
	<li>Pipet 100 μL Yıkama Tamponu 1 (W1) kolona ve 1 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj yapın. Akış akışını atın.</li>
	<li>75 μL DNaz çözeltisi pipeti doğrudan arıtma kolon membranına karışır. RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Pipet, kolona 40 μL W1 ve 30 s için 8.000 x g'de santrifüj yapın. Akış akışını atın.</li>
	<li>Pipet kolona 100 μL Yıkama Tamponu 2 (W2) ve 1 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj yapın. Akış akışını atın.</li>
	<li>Pipet kolona 100 μL W2 ve 2 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüj yapın. Akış akışını atın. Elüsyon adımından önce tüm yıkama tamponu izlerini gidermek için aynı sütunu 16.000 x g'da 1 dakika boyunca yeniden santrifüj edin.</li>
	<li>Kolonu yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Pipet, 12 μL RNaz içermeyen suyu doğrudan arıtma kolonunun membranına yerleştirin. Pipet ucu membrana temas etmemelidir. RT'de 1 dakika boyunca inkübe edin ve 1 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj yapın. Daha sonra RNA'yı etkisiz hale getirmek için 1 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüjlemeye devam edin.</li>
</ol>6. RNA konsantrasyonu ve kalitesi
<ol><li>Ekstrakte edilen RNA10'un kalitesini ve miktarını değerlendirmek için bir biyoanalizör kullanın.</li>
</ol>7. Depolama ve daha fazla analiz
<ol><li>RNA'yı daha fazla analize kadar -80 ° C'de (1 yıla kadar) saklayın (örneğin, mikrodizi, kantitatif PCR (qPCR) ve RNA-sek, vb.). NOT: cDNA sentezi de dahil olmak üzere qPCR analizinin ayrıntıları için Lyu ve ark.11'e bakınız. qPCR için astarlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.</li>
</ol>

<ol><li>Yang, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+RNA+sequencing+reveals+dynamic+regulation+of+myocardial+noncoding+RNAs+in+failing+human+heart+and+remodeling+with+mechanical+circulatory+support%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support.</a> Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).</li>
<li>Soumillon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+source+and+mechanisms+of+high+transcriptome+complexity+in+the+mammalian+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis.</a> Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li>
<li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li>
<li>Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRAP-rc%2C+translating+ribosome+affinity+purification+from+rare+cell+populations+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985(2015).</li>
<li>Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+ribosome+affinity+purification+%28trap%29+to+investigate+Arabidopsis+thaliana+root+development+at+a+cell+type-specific+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919(2020).</li>
<li>Moran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29+for+RNA+isolation+from+endothelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624(2019).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+transcriptional+and+epigenomic+profiling+from+specific+cell+types+within+heterogeneous+tissues+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li>
<li>Varjosalo, M., Taipale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog%3A+functions+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog: functions and mechanisms.</a> Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).</li>
<li>Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+integrity+number+%28RIN%29-standardization+of+RNA+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Agilent+Technologies%22%5BJournal%5D)">RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control.</a> Agilent Technologies. , Application Note 1 1-8 (2004).</li>
<li>Lyu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+reveals+sub-zones+in+mouse+adrenal+zona+fasciculata+and+the+sexually+dimorphic+responses+to+thyroid+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone.</a> Endocrinology. 161 (9), (2020).</li>
<li>King, P., Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shh+signaling+regulates+adrenocortical+development+and+identifies+progenitors+of+steroidogenic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).</li>
<li>Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell+expansion+and+organ+size+of+mouse+adrenal+is+regulated+by+sonic+hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog.</a> Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).</li>
<li>Benton, L., Shan, L. -X., Hardy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+adult+Leydig+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of adult Leydig cells.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).</li>
<li>Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+11%CE%B2-hydroxysteroid+dehydrogenase.+Testicular+11%CE%B2-hydroxysteroid+dehydrogenase%3A+development+of+a+model+for+the+mediation+of+Leydig+cell+function+by+corticosteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids.</a> Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).</li>
<li>Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sertoli+cell+signaling+by+Desert+hedgehog+regulates+the+male+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline.</a> Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).</li>
<li>Beverdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9-dependent+expression+of+Gstm6+in+Sertoli+cells+during+testis+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice.</a> Reproduction. 137 (3), 481(2009).</li>
<li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+for+single-cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Technologies for single-cell isolation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
<li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+considerations+for+single-cell+rna+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108(2018).</li>
<li>Chucair-Elliott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+cell-specific+mouse+models+for+paired+epigenetic+and+transcriptomic+studies+of+microglia+and+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia.</a> Communications Biology. 3 (1), 693(2020).</li>
<li>Barsoum, I., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+and+differential+roles+of+transcription+factors+Gli1+and+Gli2+in+the+development+of+mouse+fetal+Leydig+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells.</a> Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).</li>
<li>Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+analysis+of+testicular+Leydig+cells+in+normal+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice.</a> The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Tüm doku transkriptom analizinin yararlılığı, özellikle karmaşık heterojen dokuları incelerken azaltılabilir. Hücre tipine özgü RNA'ların nasıl elde edileceği, güçlü RNA-seq tekniğini ortaya çıkarmak için acil bir ihtiyaç haline gelir. Hücre tipine özgü RNA'ların izolasyonu genellikle mikromanipülasyon, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) veya lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LCM) kullanılarak belirli bir hücre tipinin toplanmasına dayanır18. Diğer modern yüksek verimli tek hücreli t...

RNA dizilimi (RNA-seq) ve mikroarray dahil olmak üzere yüksek verimli yaklaşımlar, gen ekspresyon profillerinin genom çapında sorgulanmasını mümkün kılmıştır. Kalp, beyin ve testis gibi karmaşık dokular için, hücre tipine özgü veriler, RNA'ların tüm dokudaki kullanımını karşılaştıran daha fazla ayrıntı sağlayacaktır 1,2,3. Hücresel heterojenliğin etkisinin üstesinden gelmek için, Translating Ribozom Afinite Saflaştırma (TRAP) yöntemi 2010'ların başından berigeliştirilmiştir4. TRAP, ribozoma bağlı RNA'ları doku ayrışması olmadan spesifik hücre tiplerinden izole edebilir. Bu yöntem, Drosophila embriyoları5'te son derece nadir görülen bir kas hücresi popülasyonunu hedeflemek, Arabidopsis thaliana6 model bitkisindeki farklı kök hücreleri incelemek ve memelilerde endotel hücrelerinin transkriptom analizini yapmak da dahil olmak üzere farklı organizmalarda translatom (çeviri için ribozoma alınan mRNA'lar) analizi için kullanılmıştır7.
TRAP, bir model organizmanın ribozomunu etiketlemek için genetik bir modifikasyon gerektirir. Evan Rosen ve meslektaşları yakın zamanda Jackson Laboratuvarı'nda 2017'den beri mevcut olan Nükleer etiketleme ve Çeviri Ribozom Afinite Saflaştırma (NuTRAP) fare8 adlı bir fare modeli geliştirdiler. Bir Cre fare çizgisiyle geçerek, araştırmacılar bu NuTRAP fare modelini, ribozom bağlı RNA'ları ve hücre çekirdeklerini, hücre sıralama olmadan Cre-eksprese eden hücrelerden izole etmek için kullanabilirler. NuTRAP alelini de taşıyan Cre-eksprese eden hücrelerde, EGFP / L10a etiketli ribozom, afinite pulldown tahlilleri kullanarak mRNA'ların çevrilmesinin izolasyonuna izin verir. Aynı hücrede, aynı zamanda mCherry pozitif olan biyotin ligaz tanıma peptidi (BLRP) etiketli nükleer membran, afinite veya floresan bazlı saflaştırma kullanarak nükleer izolasyona izin verir. Aynı araştırma ekibi, nükleer membranın sadece biyotin8 içermeyen mCherry ile etiketlendiği benzer bir fare hattı da üretti. Genetiği değiştirilmiş bu iki fare çizgisi, ilgilenilen belirli hücre tiplerinin eşleştirilmiş epigenomik ve transkriptomik profillerini karakterize etmek için erişim sağlar.
Kirpi (Hh) sinyal yolu doku gelişiminde kritik bir rol oynar9. GLI ailesinin bir üyesi olan GLI1, transkripsiyonel bir aktivatör görevi görür ve Hh sinyaline aracılık eder. Gli1 + hücreleri, adrenal bez ve testis de dahil olmak üzere birçok hormon salgılayan organda bulunabilir. NuTRAP fare modelini kullanarak hücre tipine özgü DNA'ları ve RNA'ları Gli1 + hücrelerinden izole etmek için, Gli1-CreERT2 fareleri NuTRAP fareleri ile çaprazlandı. Shh-CreERT2 fareleri, sonik kirpi (Shh) eksprese eden hücreleri izole etmeyi amaçlayan NuTRAP fareleri ile de geçti. Aşağıdaki protokol Gli1-CreERT2'nin nasıl kullanılacağını gösterir; NuTRAP fareleri, yetişkin fare testislerinde ribozoma bağlı RNA'ları Gli1 + hücrelerinden izole etmek için kullanılır.

<table><tbody><tr><td>Actb</td><td>eurofins</td><td>qPCR primerleri</td><td>ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (ileri astar/ters astar)</td></tr><tr><td>Biyoanalizör</td><td>Agilent</td><td>2100 Biyoanalizör Cihazı</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA İçermeyen Proteaz İnhibitörü Kokteyl</td><td>Milipore</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>sikloheksimid</td><td>Millipore</td><td>239764-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Cyp11a1</td><td>eurofins</td><td>qPCR primerleri</td><td>CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (ileri astar/ters astar)</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>DTT, Dithiothreitol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P2325</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 mıknatıs</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tüpleri 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>GFP antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Cam öğütücü seti</td><td>DWK Yaşam Bilimleri</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>heparin</td><td>BEANTOWN KİMYASAL</td><td>139975-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Hsd3b</td><td>eurofins</td><td>qPCR primerleri</td><td>GACAGGAGCAGGAGGGTGTGTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (ileri astar/ters astar)</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Biyolojik Bilimler</td><td>R005</td><td></td></tr><tr><td>MgCl < alt > 2 < / alt ></td> <td>Biyobilimler</td><td>R004</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri 2 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-707-354</td><td></td></tr><tr><td>Fare Clariom S Testi mikrodizileri</td><td>Thermo Fisher Scientific Mikroarray</td><td></td><td>hizmeti</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Kırlangıç</td><td>492018-50 Ml</td><td></td></tr><tr><td>oligo (dT)20</td><td>Invitrogen</td><td>18418020</td><td></td></tr><tr><td>PicoPure RNA İzolasyon Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Dynabead</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>RNaz içermeyen su</td><td>yetiştirme hücreleri</td><td>NUPW-0500</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT Rekombinant Ribonükleaz İnhibitörü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>Sox9</td><td>eurofins</td><td>qPCR primerleri</td><td>TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (ileri astar/ters astar</td></tr><tr><td>Üst simge IV ters transkriptaz</td><td>Invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>Sycp3</td><td>eurofins</td><td>qPCR primerleri</td><td>GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (ileri astar/ters astar)</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62848</td><td></td></tr></tbody></table>

hücre tipine Özgü rna'ları, hücre sıralama olmadan dondurulmuş heterojen doku Örneklerinden İzole edin

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Hücresel heterojenlik, transkriptom düzeyinde karmaşık dokuların işlevini anlamada zorluklar yaratır. Hücre tipine özgü RNA'ların kullanılması, dokuların heterojenliğinin neden olduğu potansiyel tuzakları önler ve güçlü transkriptom analizini serbest bırakır. Burada açıklanan protokol, ribozoma bağlı RNA'ları, hücre sıralaması olmadan karmaşık bir dokudaki az miktarda EGFP eksprese eden hücrelerden izole etmek için Translating Ribozom Afinite Saflaştırma (TRAP) yönteminin nasıl kullanılacağını göstermektedir. Bu protokol, yakın zamanda mevcut olan NuTRAP fare modelini kullanarak hücre tipine özgü RNA'ları izole etmek için uygundur ve RNA'ları herhangi bir EGFP eksprese eden hücreden izole etmek için de kullanılabilir.

Gli1-CreERT2 fare (Jackson Lab Stok Numarası: 007913) ilk olarak çift mutant fareler üretmek için NuTRAP muhabir faresi (Jackson Lab Stok Numarası: 029899) ile çaprazlandı. Her iki genetiği değiştirilmiş gen alellerini (yani, Gli1-CreERT2 ve NuTRAP) taşıyan farelere, üç enjeksiyon için günde bir kez, her gün tamoksifen enjekte edildi. Doku örnekleri, enjeksiyonun 1. gününden sonraki 7. günde toplandı. İmmünofloresan analizi, EGFP'nin testislerdeki int...

Bu protokol, NuTRAP fare modelini kullanarak hücre tipine özgü çeviri ribozomal mRNA'ları izole etmeyi amaçlamaktadır.

Hücre Tipine Özgü RNA'ları, Hücre Sıralama Olmadan Dondurulmuş Heterojen Doku Örneklerinden İzole Edin

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...

Bu protokol, hücre sıralaması olmadan karmaşık bir dokudaki az sayıda hücreden yüksek kaliteli hücre tiplerine özgü RNA'lar elde etmeyi amaçlamaktadır. Araştırmacıların GLP pull down kullanarak ribozom bağlı RNA'ları izole etmelerini sağlayan yakın zamanda mevcut bir fare modeli kullanıyor. Yöntem ayrıca, ribozom bağlı RNA'ları herhangi bir EGFP eksprese eden hücreden izole etmek için de uygundur.Başlamak için, bir cam doku öğütücü setine iki mililitre buz gibi soğuk homojenizasyon çalışma tamponu ekleyin. Dondurulmuş numuneyi hızlı bir şekilde öğütücüye yerleştirin ve gevşek bir havane kullanarak dokuyu buz üzerinde 30 vuruşla homojenleştirin. homojenatı iki mililitrelik yuvarlak bir alt boruya aktarın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 12.000 g'da santrifüj yapın.Daha sonra süpernatantı peleti rahatsız etmeden iki mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve giriş olarak 100 mikrolitre ayırın. Süpernatantı anti-GFP antikoru ile bir uçtan uca rotatörde dört santigrat derecede bir gecede inkübe edin. Homojenat ve antikor karışımını, yıkanmış protein g boncukları içeren yeni bir iki mililitrelik yuvarlak alt tüpe aktarın ve iki saat boyunca 24 RPM'de rotatörde dört santigrat derece inkübe edin.Manyetik bir raf kullanarak manyetik boncukları süpernatanttan ayırın. Süpernatantı EGFP negatif hücrelerindeki RNA'ları ve ribozomlara bağlı olmayan EGFP pozitif hücrelerdeki RNA'ları içeren negatif fraksiyon olarak kaydedin. Boncuklara bir mililitre yüksek tuzlu yıkama tamponu ekleyin ve boncukları yıkamak için tüpü kısaca vorteksleyin.Ardından tüpü manyetik bir rafa yerleştirin. Yıkama tamponunu çıkarın ve boncuk ribozom RNA kompleksini EGFP pozitif hücrelerden elde etmek için yıkama adımlarını iki kez daha tekrarlayın. RNA'ları boncuklardan serbest bırakmak için boncukları bir ThermoMixer'daki RNA izolasyon kitinden 50 mikrolitre ekstraksiyon tamponu ile 30 dakika boyunca inkübe edin.Boncukları manyetik bir rafla ayırın ve süpernatantı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü iki dakika boyunca 3000 g'da santrifüj yapın. Ardından süpernatantı yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe pipetleyin.RNA saflaştırma kolonunu ön koşullandırmak için, saflaştırma kolonuna 250 mikrolitre şartlandırma tamponu pipetleyin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra sütunu bir dakika boyunca 16.000 g'da santrifüj edin. Hücre ekstraktına eşit hacimde% 70 etanol pipetleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın.Önceden koşullandırılmış RNA saflaştırma kolonuna 200 mikrolitreye kadar pipet. Numune kaybını azaltmak için kolonu, kapasitesinin% 80'inden fazlasını doldurmayın. Tüm RNA'lar her fraksiyonun aynı sütununda toplanana kadar bu adımı birkaç kez tekrarlayın.RNA'yı kolondaki zara bağlamak için sütunu iki dakika boyunca santrifüj edin. Ardından 30 saniye boyunca santrifüjlemeye devam edin. Akış akışını atın ve pipetteki 100 mikrolitre yıkama tamponunu bir tanesi kolona atın.Bir dakika boyunca santrifüj yapın, ardından akışı atın. Pipet 75 mikrolitre DNA çözeltisi doğrudan arıtma kolon membranına karışır. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.Daha sonra, pipet 40 mikrolitre yıkama tamponunu bir kolona yerleştirir ve 30 saniye daha santrifüj yapar. Akışı atın. Pipet 100 mikrolitre yıkama tamponunu iki kolona yerleştirin ve bir dakika boyunca 8.000 g'da santrifüj yapın.Akışı atın. PET 100 mikrolitre yıkama tamponunu kolona iki kez satın alın ve iki dakika boyunca 16.000 g'da santrifüj yapın. Akışı atın ve tüm yıkama tamponu izlerini gidermek için aynı sütunu bir dakika boyunca 16.000 g'da yeniden santrifüj yapın.Kolonu yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. pipet 12 mikrolitre RNaz içermeyen su doğrudan arıtma kolonunun membranına pirinç ucunun membrana temas etmemesini sağlar. Bir dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin ve bir dakika boyunca 1000 g'da santrifüj yapın.Daha sonra RNA'yı etkisiz hale getirmek için bir dakika boyunca 16.000 G'de. Ekstrakte edilen RNA'nın kalitesini ve miktarını değerlendirmek için bir biyoanalizör kullanın. RNA'ları 80 derecelik bir dondurucuda saklayın veya daha fazla analiz için gönderin.Hem genetiği değiştirilmiş gen alelleri, Gli1-CreERT2 hem de NuTRAP taşıyan farelere, günde bir kez, her gün üç enjeksiyon için tamoksifen enjekte edilir. Toplanan dokuların immünofloresan analizi, EGFP'nin testislerdeki interstisyel hücrelerde eksprese edildiğini göstermektedir. EGFP ayrıca Gli1-CreERT2, NuTRAP farelerde adrenal kapsüler hücrelerde bulundu.Sonic Hedgehog-CreERT2'de, NuTRAP fareleri EGFP pozitif hücre popülasyonu, kapsülün altındaki adrenal bezin dış korteksinde bulunur ve EGFP ön eksprese eden hücrelerin ekspresyonunu doğrular. Hücre tipine özgü RNA'ların ekstraksiyonundan sonra, ekstrakte edilen RNA mikroarray analizi için gönderildi. Sonuçlar, negatif fraksiyondaki genlere kıyasla, pozitif fraksiyonda yaklaşık 3000 genin zenginleştirildiğini, oysa negatif fraksiyonda yaklaşık 4.000 genin zenginleştirildiğini göstermiştir.Diferansiyel eksprese genler arasında, Leydig hücresi ile ilişkili genler Hsd11b1 ve Hsd3b6 pozitif fraksiyonda zenginleştirildi. Negatif fraksiyonda, Sertoli hücresi ile ilişkili genler Desert Hedgehog ve Gstm6 zenginleştirildi. Negatif fraksiyonun girdi ile karşılaştırılmasında sadece birkaç farklı şekilde eksprese edilen gen tanımlanmıştır.Pozitif ve negatif fraksiyonlardaki anahtar genlerin ekspresyonunu doğrulamak için gerçek zamanlı kantitatif RT-PCR kullanıldı. Mikroarray testinde bulunanlara benzer şekilde, steroidojenik enzimler 3-beta hidroksi steroid dehidrogenaz ve kolesterol yan zincir bölünme enzimi pozitif fraksiyonda zenginleştirildi. Bu arada, Sertoli hücre belirteci SRY kutusu transkripsiyon faktörü dokuz ve germ hücre belirteci sinaptonemal kompleks protein üçü negatif fraksiyonda zenginleştirildi.Bu protokolü denerken, taze homojenizasyon çalışma tamponu hazırlamak önemlidir DTT, sikloheksimid rekombinant ribonükleaz ve proteinaz inhibitörü kokteylini homojenizasyon stok çözeltisine sadece kullanımdan önce ekleyin. Kullanmadan önce taze düşük tuz ve yüksek tuzlu yıkama tamponlarının hazırlanması da önemlidir.

isolate-cell-type-specific-rnas-from-snap-frozen-heterogeneous-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu yazıda, sıçan primer nöronal kültürlerin ve sonraki transcriptome analizi Arna amplifikasyon kullanarak tek hücre hasat için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, herhangi bir hücre tipi için genellenememektedir.

Tek Hücre Transcriptome Analizi

Belirli bir doku hücrelerinin bir alt kümesi gen ifade analizi büyük bir sorun teşkil etmektedir. Bu makalede, lazer yakalama mikrodiseksiyon ile hızlı bir immün yöntemi birleştirerek belirli bir hücre popülasyonu yüksek kaliteli toplam RNA izole açıklamaktadır.

Hücre belirli alt gruplar RNA izolasyonu Hızlı immünoyaftalama ile birlikte Lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanma

Burada, transkripsiyonel profilleme için belirli bitki hücre tiplerinin lazer destekli mikrodiseksiyonu için bir protokol sunuyoruz. Protokol farklı türler ve hücre tipleri için uygun olsa da, odak noktası, turpgil cinsi Boechera'da eşeyli ve apomiktik üreme için önemli olan dişi germ hattının son derece erişilemez hücreleridir.

Bireysel Hücre Tiplerinin transkripsiyonel Profiling için bir alet olarak lazer destekli mikrodiseksiyon (LAM)

Burada, hızlı bir şekilde yüksek kaliteli çekirdekleri aşağı akım kitlesel paralel RNA sıralama için taze veya dondurulmuş dokusundan izole etmek için bir iletişim kuralı mevcut. İkisi de çekirdek yalıtımı için kullanılan deterjan-mekanik ve mekanik hipotonik doku bozulma ve hücre lizis seçenekleri, içerir.

Yetişkin omurilik çekirdeği yalıtım kitlesel paralel tek-çekirdek RNA sıralama için

Bu iletişim kuralı vitro transkripsiyon tabanlı mRNA amplifikasyon yüksek-derinlik tek hücreli RNA sıralama için ardından tek fluorescently etiketli nöronların izole etmek için yordam sıralama kılavuzu açıklanır.

Tek hücreli RNA sıralama Fluorescently etiketli fare nöronların el ile sıralama ve çift Vitro transkripsiyon mutlak sayar (DIVA-Seq) sıralama kullanarak

Kemik hücrelerinde gen ekspresyonu analizi için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA elde etmek için lazer yakalama mikrodisseksi (LCM) protokolü geliştirilmiştir. Mevcut çalışma fare uyluk bölümleri üzerinde duruluyor. Ancak, burada bildirilen LCM protokolü herhangi bir sert doku hücrelerinde gen ekspresyonu çalışmak için kullanılabilir.

Taze Dondurulmuş Fare Kemiklerinden Yüksek Kaliteli RNA Veren Lazer Yakalama Mikrodisksiyon Protokolü

Bu yayın, çekirdeklerin olgun adipositlerden izole edilmesi, floresan-aktive sıralama ile arınma ve tek hücre düzeyinde transkripsiyon için bir protokol açıklar.

Tek Hücreli Genomik Uygulamalar için Yağ Dokusu Çekirdeklerinin İzolasyon

Tek çekirdek izolasyonu ayrışma ve hücre zarının deterjan bazlı permeabilizasyonuna, optimizasyona ihtiyaç duyan ve teknik eserlere yatkın adımlara dayanır. Tek çekirdekli RNA-seq (snRNA-Seq) veya ATAC-seq için uygun olan çekirdekleri doğrudan tüm dokudan hızlı bir şekilde izole etmek için deterjan ve enzimsiz bir protokol gösteriyoruz.

Deterjan ve Enzimsiz YöntemLe Tüm Dokudan Çekirdek İzolasyon

Burada, tek çekirdekli RNA-seq, ATAC-seq ve eklem multiomikleri (RNA-seq ve ATAC-seq) için flaş dondurulmuş, arşivlenmiş karaciğer dokularından çekirdekleri izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Tek Hücreli Multiomikler için Flaş Dondurulmuş Karaciğer Dokusundan Çekirdeklerin İzolasyonu

Burada, hücre çekirdeği hazırlığını tanımlayan bir protokol sunuyoruz. Kardiyak dokunun mikrodiseksiyonu ve enzimatik ayrışmasından sonra, progenitör hücreler donduruldu, ardından tek çekirdekli RNA dizilimi için kullanılan saf canlı hücrelerin izolasyonu ve yüksek verimli dizileme analizleri ile transpozaz erişilebilir kromatin için tek çekirdekli tahlil yapıldı.

Epigenom ve Tek Hücre Çözünürlüğünde Gen Ekspresyon Profillemesi için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu

Çalışma, aşağı akış tek çekirdekli RNA dizilimi için donmuş memeli dokularından yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için basit, hızlı ve kısmen otomatikleştirilmiş bir protokolü açıklamaktadır.

Tek Çekirdek Dizilimi için Donmuş Memeli Dokularından Tek Çekirdeklerin İzolasyonu için Basit, Hızlı ve Kısmen Otomatik Bir Protokol

Öğrenin, NuTRAP fare modeli ve GLP pull-down kullanarak dondurulmuş heterojen dokulardan hücre tipine özgü ribozom bağlı RNA'ları hücre sıralama olmadan izole etme yöntemini. Leydig ve Sertoli hücrelerindeki gen ekspresyonunu incelemek için uygundur.

Hücre Tipine Özgü RNA'ları, Hücre Sıralama Olmadan Dondurulmuş Heterojen Doku Örneklerinden İzole Edin

Daha fazla video keşfet