DNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için CD Spektroskopisi
10 Şubat 2022
ATP'ye bağımlı kromatin remodeler'in DNA ligand ile etkileşimi CD spektroskopisi kullanılarak açıklanmaktadır. Üretilen zirveler tarafından analiz edilen bir gen promotöründeki indüklenen konformasyon değişiklikleri transkripsiyonal regülasyon mekanizmasını anlamak için kullanılabilir.
Protokol, ATP'ye bağımlı kromatin remodeling proteinlerinin neden olduğu DNA'nın ikinci yeniden yapılanmasındaki değişiklikleri görselleştirmemizi sağlar. DNA yapısındaki değişiklik transkripsiyon yönetmeliği ile ilişkilendirilebilir. Bu, oligonükleotiddeki yapısal değişiklikleri kaydetmek için çok az miktarda saf DNA kullanan kolay ve son derece hassas bir tekniktir.
Bu yöntem, ATP'ye bağımlı kromatin remodeling proteinlerinin aracılık ettiği transkripsiyon regülasyonu hakkında fikir verebilir. Başlamak için, tamponların ve diğer reaksiyon bileşenlerinin çalışma konsantrasyonlarını taze hazırlayın ve reaksiyonları ayarlamadan önce dört santigrat derecede tutun, ardından NADH bağlantılı oksidasyon testi kullanarak farklı DNA moleküllerinin varlığında proteinin ATPase aktivitesini ölçün. 0,1 milimolar ADAAD, iki milimolar ATP, 10 nanomolar DNA ve 1X REG tamponu 96 kuyulu bir plakada 250 mikrolitrelik son hacme karıştırın.
Ardından, reaksiyonu 37 santigrat derecelik bir inkübatörde 30 dakika kuluçkaya bırakın, ardından mikro plaka okuyucu ile birlikte sağlanan yazılımı kullanarak NAD + miktarını ölçün. Emiciliği 340 nanometre olarak ölçmek için NADH testine tıklayın ve 96 kuyu plakasını enstrümandaki plaka tutucusuna yerleştirin, ardından emiciliği kaydetmek için okuma plakası düğmesine tıklayın. CD spektrumunu yüksek saydamlıklı kuvars cuvettes'te toplayın.
Dikdörtgen veya silindirik cuvettes kullanın. Cuvettes temizlemek için, birkaç kez su ile yıkayın, sonra temiz olup olmadığını kontrol etmek için cuvette su veya tampon tarama alın. Reaksiyonlar için PAGE saflaştırılmış DNA oligonükleotidleri kullanın.
Hızlı soğutma için, DNA'yı ısıtma bloğunda üç dakika boyunca 94 santigrat derecede ısıtın ve hemen buzda soğutun. Yavaş bir soğutma için, DNA'yı üç dakika boyunca 94 santigrat derecede ısıtarak oda sıcaklığına dakika başına bir santigrat derece soğumasını bekleyin. Taban çizgisi spektrumunu kaydetmek için, 1,5 mililitre santrifüj tüpünde birer birer toplam beş kontrol reaksiyonunu ayarlayın.
Reaksiyon hacmini tüm reaksiyonlarda 300 mikrolitrede tutun. CD spektrumunu kaydetmek için, 1,5 mililitre santrifüj tüpünde birer birer toplam beş deneysel reaksiyon ayarlayın. Taramayı kaydetmek için gazı açın ve CD spektrometresini açın.
10 ila 15 dakika sonra lambayı kapatın, su banyoyu kapatın ve tutucu sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayın. Ardından, CD spektrum yazılımını açın ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye, dalga boyu aralığını 180 ila 300 nanometreye, nokta başına süreyi 0,5 saniyeye ve tarama numarasını beşe ayarlayın, ardından pro veri görüntüleyiciye tıklayın, yeni bir dosya yapın ve deneyin ayrıntıları ve tarihle yeniden adlandırın. Daha sonra, taban çizgisini ve deneysel reaksiyonları pipetleme ile karıştırın ve reaksiyon karışımlarını tek tek cuvette'e dikkatlice aktarın, böylece hava kabarcıkları olmamasını sağlayın.
Bir zaman kursu deneyi yapıyorsanız, reaksiyonları gerekli süre boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, ardından taramayı yapın. ATP hidrolizi durdurmak için DNA, ATP, magnezyum ve protein içeren tampona EDTA ekleyin. ATPase aktivitesini tamamen engellemek için EDTA konsantrasyonunu ve kuluçka süresini artırın.
Yazılımdaki karşılık gelen reaksiyonlardan taban çizgilerini çıkarın ve CD spektrum yazılımındaki veya veri çizim yazılımındaki verileri yumuşatın, ardından ortalama kalıntı eliptikliğine karşı bir dalga boyu grafiği çizin ve zirveleri analiz edin. M-kıvrımları, MYC DNA'sının her iki ipliğinin de kök halka benzeri bir yapı oluşturabileceğini gösterdi. İlerinin M-kat yapıları ve G dörtgen GECE'yi içeren ters DNA dizisi burada gösterilmiştir.
ATP ve ADAAD'ın yokluğunda ve varlığında hızlı soğutulmuş GECE'nin CD spektrumu, ADAAD'ın biri 258 nanometrede, diğeri 210 nanometrede olmak üzere iki pozitif zirveye neden olduğunu gösterdi. EDTA'nın eklenmesi bu konformasyonsal değişimi bozmaktadır. CD spektrumları artık negatif 210 nanometre zirvesine ve 230 ve 250 nanometrede zirveleri olan geniş bir pozitif banda sahiptir.
QGRS haritalayıcı ve M-fold analizi, DROSHA, DGCR8 ve DICER'in promotör bölgelerinin G dörtgeni ve kök benzeri yapılar oluşturma potansiyeline sahip olduğunu gösterdi. DROSHA çift beş'in CD spektrumu, ADAAD'ın 210 nanometrede negatif bir zirveye ve 260 nanometrede pozitif bir zirveye neden olduğunu gösterdi. Bu spektrum ADNA'nın bir özelliğidir.
DGCR8 pair one'ın CD spektrumu 210 nanometrede pozitif bir zirve ve 260 nanometrede geniş bir negatif zirve gösterdi. Bu spektrum B'den X'e geçişin karakteristiğidir. DGCR8 çifti yedi için 210 ve 270 nanometrede güçlü pozitif zirveler ve 250 nanometrede negatif zirve görüldü.
Bu spektrum paralel G dörtgen DNA yapılarının karakteristiğidir. Son olarak, Dicer çifti için biri 210 nanometrede pozitif zirve ve biri 230 nanometrede diğeri 260 nanometrede olmak üzere iki negatif zirve gözlendi. Bu tepeler A'dan X'e DNA geçişinin karakteristiğidir.
DNA ve protein saflığının% 99 veya daha fazla olduğundan emin olun. Cuvette temiz olmalı ve taban çizgisi bir milidegreden az olmalıdır. Tüm reaktifler saf olmalıdır, böylece arka plan bir milidegreden azdır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, CD spektroskopisini kullanarak bir DNA ligandı ile bir ATP bağımlı kromatin yeniden modelleyicisinin etkileşimini tanımlar. Bir gen promotörü üzerinde gözlenen yapısal değişiklikler, transkripsiyon düzenleme mekanizmaları hakkında bilgiler sağlayabilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kromatin yeniden modellenmesi
- Transkripsiyon düzenleme
- Yapısal biyoloji
Arka Plan
- ATP bağımlı kromatin yeniden modelleyiciler, gen ekspresyonunda önemli bir rol oynar.
- DNA yapısal değişimlerini anlamak, transkripsiyon mekanizmalarının açıklanması için hayati öneme sahiptir.
- CD spektroskopisi, DNA yapılarını analiz etmek için hassas bir tekniktir.
- Küçük miktarda DNA, detaylı yapısal çalışmalar için kullanılabilir.
Çalışmanın Amacı
- Kromatin yeniden modelleme proteinleri tarafından indüklenen DNA yapısı değişikliklerini görselleştirmek.
- Yapısal değişiklikleri transkripsiyon düzenlemesi ile ilişkilendirmek.
- Bu etkileşimleri CD spektroskopisi kullanarak incelemek için bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Çalışma konsantrasyonlarında tamponlar ve reaksiyon bileşenlerinin hazırlanması.
- Çeşitli DNA moleküllerinin varlığında ATPase aktivitesinin ölçülmesi.
- NADH bağlı oksidasyon testi kullanımı.
- ADAAD, ATP, DNA ve REG tamponunun belirli konsantrasyonlarının 96 kuyu plaka üzerinde karıştırılması.
Ana Sonuçlar
- DNA'daki yapısal değişiklikler CD spektroskopisi kullanılarak başarıyla görselleştirildi.
- DNA yapısı ve transkripsiyon düzenlemesi arasında korelasyonlar kuruldu.
- Yöntem, kolay ve oldukça hassas olduğu kanıtlandı.
- ATP bağımlı kromatin yeniden modelleyici proteinlerin rolüne dair bilgiler elde edildi.
Sonuçlar
- Çalışma, transkripsiyon düzenleme mekanizmalarını anlamayı geliştirir.
- CD spektroskopisi, DNA yapısal değişikliklerini analiz etmek için etkili bir araçtır.
- Gelecekteki araştırmalar bu bulgulara dayanarak kromatin dinamiğini daha fazla araştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Circular dichroism (CD) spectroscopy enables high-sensitivity detection of DNA conformational changes induced by chromatin remodeling proteins, directly informing target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This approach supports predictive confidence in transcriptional regulation studies, facilitating risk-adjusted decisions at key inflection points in the biopharma pipeline. Its minimal sample requirements and quantitative outputs make it a scalable asset for portfolio-wide interrogation of DNA-protein interactions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of DNA structural changes upon protein binding, clarifying regulatory mechanisms.
- Supports functional validation of chromatin remodelers as drug targets by linking conformational shifts to transcriptional outcomes.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing sequence-specific and affinity-driven interactions.
- Provides quantitative data for hypothesis-driven triage of candidate targets.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, quantitative readouts of DNA-protein interaction dynamics for assay standardization.
- Supports development of robust screening platforms by validating biological system readiness and minimizing background noise.
- Enables rapid assessment of mutant DNA sequences to probe specificity and optimize assay conditions.
- Facilitates platform reuse across multiple target classes due to minimal sample and instrumentation requirements.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling chromatin dynamics at gene promoters implicated in transcriptional regulation.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by enabling structural biomarker identification.
- Supports risk-adjusted advancement by correlating in vitro conformational changes with potential in vivo regulatory effects.
Pipeline & Workflow Integration
CD spectroscopy integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling early mechanistic interrogation, assay development, and translational biomarker exploration for DNA-protein interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on chromatin remodeling and transcriptional regulation by visualizing DNA conformational shifts.
- Screening: Provides quantitative, reproducible spectra for comparing protein-DNA binding across conditions and mutants.
- Analytics: Outputs wavelength-resolved ellipticity data, enabling statistical comparison of structural states.
- Translational Research: Connects in vitro conformational signatures to disease-relevant promoter dynamics.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, low-input workflow adaptable across multiple gene targets and protein classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in chromatin biology.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible measurements with minimal sample requirements.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient triage of early-stage targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of transcriptional regulation programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biophysical analysis and chromatin biology for data interpretation.
- Needs access to high-sensitivity CD spectrometers and clean, high-purity reagents.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample preparation and baseline controls.
- Adaptable to various DNA sequences and chromatin remodelers with protocol optimization.
- Limited by the need for highly pure DNA and protein samples to minimize background signal.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:36
ATPase Activity
1:35
Preparation of Circular Dichroism (CD) Cuvettes and DNA Oligonucleotides
2:19
Setting up the Experiments and Recording the Scan
4:10
Results: CD Spectra of MYC, DROSHA, DGCR8, and DICER Oligonucleotides in the Presence of ATP and ADAAD
6:18
Conclusion
