Name: DNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için CD Spektroskopisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Keşfedin, ATP bağımlı kromatin yeniden yapılandırma proteinleriyle DNA arasındaki etkileşimleri CD spektroskopisi kullanarak inceleyin. Bu hassas yöntem, transkripsiyonel düzenleme mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar CD spektrofotometresi için JNU İleri Enstrümantasyon Araştırma Tesisi'ne teşekkür eder. V.J. ve A.D. CSIR'den bir bursla desteklendi.

1. Reaksiyon bileşenlerinin çalışma konsantrasyonu
<ol><li>CD ve diğer reaksiyon bileşenleri için çalışan tampon konsantrasyonlarını yeni bir şekilde hazırlayın ( bkz. Tablo 1) ve reaksiyonları ayarlamadan önce 4 °C'de tutun. NOT: Bu makalede açıklanan CD reaksiyonları için bileşenlerin çalışma konsantrasyonları aşağıdaki gibidir: Sodyum fosfat tamponu (pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Protein 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.</li>
</ol>2. ATPase etkinliği
<ol><li>CD spektroskopisinden önce, CD spektroskopisinde kullanılan proteinin aktif olduğundan emin olmak ve ATP hidrolizini ortaya çıkarmakta en uygun şekilde etkili olan DNA moleküllerini tanımlamak için DNA moleküllerinin varlığında proteinin ATPase aktivitesini oluşturun.</li>
	<li>Aşağıdaki iki reaksiyondan oluşan NADH bağlantılı bir oksidasyon testi ile farklı DNA moleküllerinin varlığında proteinin ATPase aktivitesini ölçün.<ol>
<li>0,1 μM ADAAD, 2 mM ATP, 10 nM DNA ve 1x REG tamponu 96 kuyulu bir plakada 250 μL'lik son hacme karıştırın. NOT: Pyruvate kinaz enzimi, fosphoenolpyruvate'yi piruvata dönüştürmek için ADP ve Pi'yi kullanır, böylece ATP'yi yeniler. Bu, ATP'nin reaksiyonda her zaman doygun bir konsantrasyonda olmasını sağlar. İkinci reaksiyonda, piruvat kinazın etkisiyle oluşan piruvat, laktat dehidrogenaz tarafından laktata dönüştürülür. Bu reaksiyonda, bir NADH molekülü NAD+ ile oksitlendi. NADH tüketimi molekülün emiciliği 340 nm olarak ölçülerek ölçülür.</li>
		<li>Bir inkübatörde 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatır.</li>
		<li>Bir mikro plaka okuyucu kullanarak NAD+ miktarını 340 nm olarak ölçün.</li>
		<li>NAD+ miktarını ölçmek için mikro plaka okuyucu ile birlikte sağlanan yazılımı kullanın.<ol>
<li>Absorbansı 340 nm olarak ölçmek için NADH testine tıklayın.</li>
			<li>96 kuyu plakasını aletteki plaka tutucusuna yerleştirin. Emiciliği kaydetmek için Plakayı Oku düğmesine tıklayın. NOT: NAD+ konsantrasyonu, NADH'nin azı dişi yok olma katsayısı eq (1) kullanılarak 6,3 mM−1 olarak hesaplanır. A = φcl (1) Burada, A = Absorbans ε = Molar yok olma katsayısı c = Molar konsantrasyonu l = Cm olarak optik yol uzunluğu</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. CD cuvettes seçimi ve hazırlanması
<ol><li>Cd spektrumlarını yüksek saydamlıklı kuvars cuvettes'te toplayın. Dikdörtgen veya silindirik cuvettes kullanın. NOT: Bu makalede açıklanan tüm reaksiyonlar için bir CD kuvars cuvette (nominal hacim 0,4 mL, yol uzunluğu 1 mm) kullanılmıştır.</li>
	<li>Cuvette temizlemek için bir cuvette temizleme çözeltisi kullanın. Çözeltinin 400 μL'sini yapmak için suya% 1 cuvette temizleme çözeltisi ekleyin, cuvette dökün ve 1 saat boyunca 37 ° C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Cuvette'i temizlemek için birkaç kez suyla yıkayın. Temiz olup olmadığını kontrol etmek için cuvetteki suyu veya tamponu tarayın. NOT: Su veya tampon 0 ila 1 mdeg aralığında bir okuma vermelidir.</li>
</ol>4. Proteinlerin ve DNA oligonükleotidlerinin hazırlanması
<ol><li>Bazen belirsiz zirvelerin oluşumuna neden olan tampon bileşenlerinin miktarlarını en aza indirmek için reaksiyonda proteinin hacmini 50 μL'nin altında tutun. Herhangi bir bozulmayı önlemek için proteini deney boyunca buzun üzerinde tutun.</li>
	<li>Reaksiyonlarda PAGE saflaştırılmış DNA oligonükleotidleri kullanın. NOT: Burada açıklanan reaksiyonlarda DNA hem doğal hem de ısı soğutmalı formlarda (hızlı soğutulmuş (FC) ve yavaş soğutulmuş (SC) olarak kullanılmıştır. Hızlı soğutma, DNA'da intramoleküler bağlanmayı teşvik ederek daha fazla ikincil yapı elde eder. Buna karşılık, yavaş soğutma DNA'da intermoleküler bağlanmayı teşvik eder ve daha az ikincil yapıya neden olarak ortaya çıkardı.</li>
	<li>Hızlı soğutma için, ıSıTMA bloğunda 3 dakika boyunca 94 °C'de DNA ısıtın ve hemen buz üzerinde soğutun. Yavaş soğutma için DNA'yı 94 °C'de 3 dakika ısıtın ve dakikada 1 °C hızında oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.</li>
</ol>5. Temel spektrumları kaydetmek için kontrol deneyleri ayarlama
<ol><li>Tüm reaksiyonlarda reaksiyon hacmini 300 μL'de tutun. 1,5 mL santrifüj tüplerinde tek tek toplam 5 temel reaksiyonun ayarını aşağıdaki gibi ayarlayın: i) Tampon + Su; ii) Tampon + MgCl2 + ATP + Su; iii) Tampon + MgCl2 + ATP + Protein + Su; iv) iii + EDTA veya ADAADiN; v) Tampon + Protein +Su.</li>
</ol>6. Deneyleri CD spektrumunu kaydedecek şekilde ayarlama
<ol><li>1,5 mL santrifüj tüplerinde tek tek toplam 5 reaksiyonun aşağıdaki gibi kurulması: i) Tampon + DNA + Su; ii) Tampon + DNA + MgCl2 + ATP + Su; iii) Tampon + DNA + MgCl2 + ATP + Protein + Su; iv) iii + EDTA veya ADAADiN; v) Tampon + DNA + Protein +Su.</li>
</ol>7. Kayıt taraması
<ol><li>Gazı açın ve CD spektrometresini açın.</li>
	<li>10-15 dk sonra lambayı aç. Su banyoyu aç ve tutucu sıcaklığını 37 °C'ye ayarla.</li>
	<li>CD spektrum yazılımını açın.<ol>
<li>Sıcaklığı 37 °C olarak ayarlayın.</li>
		<li>Dalga boyu aralığını 180 - 300 nm olarak ayarlayın.</li>
		<li>Nokta başına süreyi 0,5 sn olarak ayarlayın.</li>
		<li>Tarama numarasını 5 olarak ayarlayın.</li>
		<li>Pro-Data Viewer'a tıklayın, yeni bir dosya yapın ve deneme ve tarihle ilgili ayrıntılarla yeniden adlandırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herhangi bir bozulmayı önlemek için tüm reaksiyon bileşenlerini buzda tutun. Taban çizgilerini ve reaksiyonları tek tek santrifüj tüplerinde yapın ve pipetleme ile karıştırın. Reaksiyon karışımını cuvette'e dikkatlice aktarın, hava kabarcıkları olmadığından emin olun.</li>
	<li>Bir zaman kursu deneyi yapıyorsanız, reaksiyonları gerekli süre boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın ve taramayı yapın. ATP hidrolizi durdurmak için DNA, ATP, Mg+2 ve protein içeren tampona EDTA ekleyin.</li>
	<li>ATPase aktivitesini tamamen inhibe etmek için EDTA konsantrasyonunu ve kuluçka süresini artırın.</li>
	<li>Yazılımdaki karşılık gelen reaksiyonlardan taban çizgilerini çıkarın (örneğin, reaksiyon 1'i temel 1'den çıkarın). CD spektrum yazılımındaki veya veri çizim yazılımındaki verileri yumuşatın. Veri çizim yazılımındaki verileri çizin. NOT: Karşılık gelen reaksiyonlardan taban çizgilerinin çıkarılması, net CD'ye yalnızca DNA'nın spektrumunu verecektir.</li>
</ol>8. Veri analizi ve yorumlanması
<ol><li>Milidegrelerde elde edilen değerleri kalıntı eliptikliği anlamına getirmek için eq (2) tarafından verilen formülü kullanın. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63147/63147eq01.jpg">(2) Burada, S milidegrelerde CD sinyali, c mg/mL'deki DNA konsantrasyonu, mRw ortalama kalıntı kütlesi ve l cm cinsinden yol uzunluğudur.</li>
	<li>Veri çizim yazılımını kullanarak dalga boyu ve ortalama kalıntı eliptikliğine karşı bir grafik çizin ve zirveleri analiz edin.</li>
	<li>Grafiği çizmek için, Y eksenindeki ortalama kalıntı eliptikliğini ve X eksenindeki dalga boylarını seçin ve düz bir çizgi grafik çizin. NOT: Bu grafik, farklı DNA formlarının karakteristik zirvelerini sağlayacaktır. Zirvelere karşılık gelen DNA formları mevcut literatür kullanılarak tanımlanabilir6.</li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.

Bu makalenin amacı, ATP'ye bağımlı kromatin remodeling proteinlerinin varlığında DNA'da meydana gelen konformasyonsal değişiklikleri incelemek ve bu konformasyonsal değişiklikleri gen ekspresyona bağlamak için bir yaklaşım olarak CD spektroskopi tekniğini tanıtmaktır. CD spektroskopisi, DNA'daki konformasyon değişikliklerini incelemek için hızlı ve kolay erişilebilir bir yöntem sağlar.

Bu teknik için dikkat edilmesi gereken önemli bir nokta DNA ve proteinin saflığıdır. Hem DNA hem de p...

Dairesel dikroizm (CD), sağ elini kullanan ve solak dairesel polarize ışığın diferansiyel emilimine yol açan biyolojik makromoleküllerin doğal chiralitesine dayanan spektroskopik bir tekniktir. Bu diferansiyel emilim dairesel dikroizm olarak bilinir. Bu nedenle teknik, her ikisi de chiral merkezleri içeren proteinler ve DNA gibi biyolojik makromoleküllerin konformasyonunu tanımlamak için kullanılabilir1,2.
Elektromanyetik dalgalar hem elektrik hem de manyetik bileşenler içerir. Hem elektriksel hem de manyetik alanlar dalga yayılma yönüne dik olarak salınır. Kutuplaşmamış ışık durumunda, bu alanlar birçok yönde salınır. Işık dairesel olarak polarize edildiğinde, birbirine 90° faz farkıyla iki elektromanyetik alan elde edilir. Chiral molekülleri dairesel optik dönüş (birefringence) gösterir, böylece sağ elle dairesel polarize ışığı ve solak dairesel polarize ışığı farklı derecelerde emerler3. Elde edilen elektrik alanı, dalga boyunun bir işlevi olan elips olarak izlenecektir. CD spektrumu böylece eliptiklik (q) olarak kaydedilir ve veriler dalga boyunun bir işlevi olarak Ortalama Kalıntı Eliptikliği olarak sunulur.
Proteinler söz konusu olduğunda, amino asitlerin Cα'ları (glisine hariç) chiral'dır ve bu makromolekül4'ün ikincil yapısını belirlemek için CD spektroskopisi ile yararlanılmıştır. Protein moleküllerinin CD spektrumları tipik olarak Uzak UV aralığında kaydedilir. α-sarmal proteinler 222 nm ve 208 nm'de iki negatif bant ve 193 nm4'te bir pozitif zirveye sahiptir. Anti-paralel β yaprak ikincil yapıya sahip proteinler 218 nm'de negatif bir zirve ve 195 nm4'te pozitif bir zirve gösterir. Düzensiz yapılara sahip proteinler 210 nm'ye yakın düşük eliptiklik ve 195 nm4'te negatif bir zirve gösterir. Bu nedenle, farklı ikincil yapılar için iyi tanımlanmış tepe / bantlar, CD'yi denatürasyon ve ligand bağlama sırasında proteinlerin ikincil yapısında meydana gelen konformasyonel değişiklikleri aydınlatmak için uygun bir araç haline getirir.
Nükleik asitlerin üç tane chirality kaynağı vardır: şeker molekülü, ikincil yapının helitesi ve ortamdaKI DNA'nın uzun menzilli üçüncül sırası5,6. Nükleik asitlerin CD spektrumları tipik olarak 190 ila 300 nm aralığında kaydedilir5,6. DNA'nın her uyumu, tıpkı proteinler gibi karakteristik bir spektrum sağlar, ancak tepeler / bantlar çözücü koşullar ve DNA dizilerindeki farklılıklar nedeniyle bir dereceye kadar değişebilir7. En yaygın form olan B-DNA, 260-280 nm civarında pozitif bir zirve ve 245 nm6 civarında negatif bir tepe ile karakterizedir. B formu DNA'sının zirveleri/bantları genellikle küçüktür, çünkü baz çiftleri çift sarmala diktir ve moleküle zayıf bir chirality tanır. A-DNA 260 nm'de baskın pozitif zirve ve 210 nm6 civarında negatif bir zirve verir. Solak sarmal olan Z-DNA, 290 nm'de negatif bir bant ve 260 nm6 civarında pozitif bir zirve sağlar. Bu DNA aynı zamanda 205 nm6'da son derece negatif bir zirve verir.
Bu konformasyonlara ek olarak, DNA tripleksler, dört yönlüler ve saç tokaları da oluşturabilir ve bunların hepsi CD spektroskopisi ile ayırt edilebilir. Paralel G-quadruplex 260 nm'de baskın pozitif bant verirken, paralel karşıtı G-quadruplex 260 nm'de negatif bir bant ve 290 nm'de pozitif bir zirve vererek iki dört yönlü yapı biçimini ayırt etmeyi kolaylaştırır6. Tripleks karakteristik bir spektrum vermez8. Örneğin, Na+ varlığında G.G.C ve T.A.T baz çiftlerini içeren intramoleküler üçlü sarmal oluşturma potansiyeline sahip 36 nükleotid uzunluğundaki DNA'nın spektrumu 240 nm'de güçlü bir negatif bant ve geniş bir pozitif zirve göstermektedir. Geniş pozitif zirve 266, 273 ve 286 nm'de katkıları göstermektedir. Na+ ve Zn+'nın varlığında aynı oligonükleotid dört negatif bant (213, 238, 266 ve 282 nm) ve 258 nm'de pozitif bir zirve gösterir. Bu nedenle, tripleks DNA tayfı tuz koşullarına bağlı olarak değişebilir8.
Bu konformasyonlara ek olarak, CD spektrası X-DNA adı verilen başka bir DNA formunun tanımlanmasını sağlamış. DNA dizisi alternatif adenin ve timin kalıntıları içerdiğinde X-DNA oluşur. X-DNA'nın CD spektrumları 250 ve 280 nm'de iki negatif tepe içerir. X-DNA hakkında çok az bilgi mevcuttur, ancak pozitif supercoiling için bir lavabo işlevi görebilmiştir6,9. CD spektrumlarındaki değişiklikler ligand-protein etkileşimleri hakkında da ayrıntıları ortaya getirebilir ve bu nedenle, ilaç-protein etkileşimlerini tespit etmek için moleküler yöntemlerin cephaneliğine eklenmiştir10,11,12,13,14. CD spektrumları, katlama işlemi sırasında proteinlerin ikincil yapısındaki değişiklikleri izlemek için de kullanılmıştır15. Benzer şekilde, CD spektrumları ligand-DNA etkileşimlerini yoklamada da kullanılabilir16,17.
Cd spektroskopisi, bu nedenle, çok ucuz olmayan ekipman ve yazılımlara erişim olması koşuluyla, farklı DNA uyum biçimlerini ayırt etmek için kolay ve ucuz bir yöntemdir. Yöntem son derece hassas ve hızlıdır. Sadece az miktarda DNA gerektirir, bu da ona alternatif nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopi tekniği üzerinde bir avantaj sağlar. Ligandlar ve substratlar ile titrasyonların yapılması da kolaydır. En büyük kısıtlama DNA'nın son derece saf olması gerektiğidir. Poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) saflaştırılmış DNA kullanılması tavsiye edilir.
CD spektrası tarafından elde edilen bilgiler esas olarak protein yapısal özelliklerini çıkarmak ve farklı DNA uyumlularını tanımlamak için kullanılmıştır. Bu çalışmada CD spektrası, in vivo Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) deneyinden elde edilen sonuçları entegre etmek için, ilgi proteininin /tahmin edilen transkripsiyon faktörünün efektör genlerinin promotör bölgesinde konformasyonsal bir değişiklik getirip getirmeyeceğini ortaya çıkarmak için kullanılmıştır. Bu işbirliği, bir organizatörün transkripsiyon başlangıç sitesi (TSS) üzerinde ve çevresinde öngörülen transkripsiyon faktörü tarafından transkripsiyon düzenleme mekanizmasını tahmin ederek geleneksel CD spektroskopik tekniklerinin ilerlemesine yardımcı olur.
Kromatin remodeling, sıkıca paketlenmiş kromatin transkripsiyon faktörleri, DNA replikasyonu bileşenleri veya hasar onarım proteinleri gibi çeşitli düzenleyici faktörler için erişilebilir hale getirerek DNA metabolik süreçlerini düzenlediği bilinen iyi tanımlanmış bir mekanizmadır. SWI/SNF protein ailesi olarak da bilinen ATP'ye bağımlı kromatin remodelerleri, ökaryotik hücrelerde bulunan anahtar remodeler proteinlerdir18,19. Filogenetik kümeleme, SWI/SNF protein ailesini 6 alt gruba ayırmıştır20: Snf2 benzeri, Swr1 benzeri, SSO1653 benzeri, Rad54 benzeri, Rad5/16 benzeri ve uzak. Bu çalışmada ilgi çekici protein olan SMARCAL1, uzak alt gruba aittir20. Bu protein, CD spektroskopisi kullanılarak transkripsiyonal regülasyon şeklini araştırmak için kullanılmıştır.
ATP'ye bağımlı kromatin remodeling proteinlerinin üyelerinin çoğunun nükleozomları yeniden konumlandırdığı veya tahliye ettiği veya histone varyant değişimine ATP'ye bağımlı bir şekilde aracılık ettiği gösterilmiştir21,22. Ancak, bu ailenin bazı üyelerinin nükleozomları yeniden şekillendirdiği gösterilmemiştir, örneğin SMARCAL1. Çalışmalar SMARCAL1'in politen kromozomlarla ilişkili olduğunu göstermiş olsa da, nükleozomları yeniden şekillendirme yeteneğine ilişkin deneysel kanıtlar eksiktir23. Bu nedenle, SMARCAL1'in DNA24 konformasyonunu değiştirerek transkripsiyon düzenleyebileceği ileri sürüldü. CD spektroskopisi, bu hipotezi doğrulamak için kolay ve erişilebilir bir yöntem sağladı.
SMARCAL1, öncelikle tavlama helicase25,26,27 olarak işlev gören atp bağımlı kromatin remodeling proteinidir. DNA konformasyonunu yeniden şekillendirerek transkripsiyonu modüle etmek için postülasyon edilmiştir24. Bu hipotezi test etmek için, doksrubisin kaynaklı DNA hasarı sırasında gen transkripsiyonunun düzenlenmesinde SMARCAL1'in rolü incelenmiştir. Bu çalışmalarda in vivo analiz için SMARCAL1, in vitro tahliller için ADAAD kullanılmıştır28,29. Önceki çalışmalar ADAAD'ın DNA'yı yapıya bağımlı ancak diziden bağımsız bir şekilde tanıyabileceğini göstermiştir30,31. Protein, kök döngü DNA'sına benzer şekilde tek iplikli geçiş bölgelerine çift iplikli dna moleküllerine en uygun şekilde bağlanır ve ATP 30,31'i hidroller.
In vivo deneyler, SMARCAL1'in organizatör bölgelerine bağlanarak MYC, DROSHA, DGCR8 ve DICER'ın ifadesini düzenlediğini gösterdi28,29. Etkileşim bölgesi ChIP deneyleri ile belirlendi28,29. ChIP tekniği, bir proteinin hücre içindeki konyak DNA'sı ile etkileşimini analiz etmek için kullanılır. Amacı, organizatörler veya diğer DNA bağlama bölgelerindeki transkripsiyon faktörleri gibi belirli proteinlerin belirli genomik alanlara bağlı olup olmadığını belirlemektir. DNA'ya bağlı protein ilk olarak formaldehit kullanılarak çapraz bağlanır. Bunu kromatin izolasyonu takip ediyor. İzole kromatin, sonikasyon veya nükleaz sindirimi ile 500 bp parçaya yamaçlanır ve DNA'ya bağlı protein, proteine özgü antikorlar kullanılarak bağışıklık sistemine bağlıdır. Çapraz bağlama tersine çevrilir ve DNA polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) veya nicel gerçek zamanlı PCR kullanılarak analiz edilir.
ChIP sonuçları, SMARCAL1'in bu genlerin promotör bölgelerinde konformasyonel bir değişiklik yaratarak transkripsiyonel düzenlemeye aracılık ettiği hipotezine yol açtı. QGRS haritalayıcı ve Mfold yazılımı, bu organizatör bölgelerinin ikincil yapılar oluşturma potansiyelini belirlemek için kullanıldı28,29. QGRS eşleyici G-quadruplexes32'yi tahmin etmek için kullanılırken, Mfold33 bir sıranın kök döngüler gibi ikincil yapılar oluşturma yeteneğini analiz eder.
İkincil yapı analizinden sonra, Escherichia coli34'ten arındırılmış SMARCAL1'in sığır homologu olan rekombinant 6X His etiketli Aktif DNA'ya bağımlı ATPase A Domain (ADAAD) ile daha fazla in vitro deney yapıldı. ATPase tahlilleri ADAAD kullanılarak gerçekleştirildi ve tanımlanan DNA dizilerinin efektör olarak işlev görebileceğini belirledi28,29. Son olarak ADAAD28,29 tarafından DNA molekülünde indüklenen konformasyon değişikliklerinin izlenmesi için CD spektroskopisi yapıldı.
Proteinin ATPase aktivitesinin DNA molekülünde konformasyonel bir değişime neden olmak için gerekli olduğunu kanıtlamak için, şelat Mg +2'ye etilenediamin tetraasetik asit (EDTA) veya SWI/SNF proteininin spesifik bir inhibitörü olan Aktif DNA'ya bağımlı ATPase A Domain Inhibitörü Neomycin (ADAADiN) eklendi35.36 . Bu CD spektroskopik tekniği, chIP veya diğer ilgili testlerle bir organizatörün tahmin edilen genomik bölgesine bağlanmak için gösterilen herhangi bir saflaştırılmış proteinle kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Fisher scientific</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5&prime;-trifosfat disodyum tuzu hidrat</td><td>Sigmaaldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>CD Kuvars Küvet</td><td>STARNA</td><td>21-Q-1</td><td></td></tr><tr><td>Chirascan V100 CD spektrometresi</td><td>Uygulamalı Fotofizik</td><td>Mevcut</td><td></td>değil</tr><tr><td>EDTA Disodyum Tuzu Dihidrat</td><td>SRL</td><td>43272</td><td></td></tr><tr><td>Glutatyon Sefaroz 4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-01</td><td>Glutatyon afinite kromatografisi</td></tr><tr><td>Hellmanex III temizleme solüsyonu</td><td>Hellma</td><td>9-307-011-4-507</td><td></td></tr><tr><td>L-Laktik Dehidrojenaz</td><td>Sigmaaldrich</td><td>&nbsp; L2625</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Asetat Tetrahidrat</td><td>Fisher scientific</td><td>BP215-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür Heksahidrat</td><td>Fisher scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NADH disodyum tuzu</td><td>Sigmaaldrich</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoenolpiruvat Monosikloheksilamonyum Tuzu</td><td>SRL</td><td>40083</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Asetat</td><td>Fisher bilimsel</td><td>P178-3</td><td></td></tr><tr><td>Piruvat Kinaz</td><td>Sigmaaldrich</td><td>P1506</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat Dibazik Susuz</td><td>Fisher scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat Monobazik Monohidrat</td><td>Fisher scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>Sinerji HT mikroplaka okuyucu</td><td>BioTek</td><td>Mevcut değil</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

dna-protein etkileşimlerini İncelemek için cd spektroskopisi

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Dairesel dikroizm (CD) spektroskopisi, biyomoleküllerin ikincil yapısını ve etkileşimlerini araştırmak için basit ve kullanışlı bir yöntemdir. CD spektroskopislerindeki son gelişmeler, transkripsiyonel regülasyonun daha iyi anlaşılması için DNA-protein etkileşimlerinin ve DNA'nın konformasyonel dinamiklerinin farklı mikroçevrimlerde ayrıntılı olarak incelenmesini sağlamaktadır. Transkripsiyonun gerçekleşmesi için potansiyel bir transkripsiyon bölgesinin etrafındaki alanın çözilmesi gerekir. Bu, histon modifikasyonlarının koordinasyonunu, transkripsiyon faktörünün DNA'ya bağlanmasını ve diğer kromatin yeniden şekillendirme faaliyetlerini gerektiren karmaşık bir süreçtir. CD spektroskopisi kullanılarak, transkripsiyonu teşvik etmek için ATP'ye bağımlı kromatin remodelerleri gibi düzenleyici proteinlerin neden olduğu promotör bölgesindeki konformasyonsal değişiklikleri incelemek mümkündür. Proteinde meydana gelen konformasyon değişiklikleri de izlenebilir. Ek olarak, proteinin hedef DNA'sına ve dizi özgüllüğüne olan benzeşimi ile ilgili sorgular, hedef DNA'daki mutasyonlar dahil edilerek ele alınabilir. Kısacası, bu hassas ve ucuz yöntemin benzersiz anlayışı kromatin dinamiklerindeki değişiklikleri tahmin edebilir, böylece transkripsiyonel düzenleme anlayışını geliştirebilir.

ADAAD, MYC promotöründeki yapı gibi bir kök döngüyü stabilize eder Önceki deneysel kanıtlar, SMARCAL1'in MYC29'un negatif bir düzenleyicisi olduğunu göstermiştir. MYC geninin 159 bp uzunluğundaki promotör bölgesinin QGRS haritacısı tarafından analizi, ileri telin bir G-quadruplex oluşturma potansiyeline sahip olduğunu göstermiştir (Tablo 2). Mfold, MYC DNA'sının her iki ipliğinin de kök döng...

ATP'ye bağımlı kromatin remodeler'in DNA ligand ile etkileşimi CD spektroskopisi kullanılarak açıklanmaktadır. Üretilen zirveler tarafından analiz edilen bir gen promotöründeki indüklenen konformasyon değişiklikleri transkripsiyonal regülasyon mekanizmasını anlamak için kullanılabilir.

DNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için CD Spektroskopisi

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Protokol, ATP'ye bağımlı kromatin remodeling proteinlerinin neden olduğu DNA'nın ikinci yeniden yapılanmasındaki değişiklikleri görselleştirmemizi sağlar. DNA yapısındaki değişiklik transkripsiyon yönetmeliği ile ilişkilendirilebilir. Bu, oligonükleotiddeki yapısal değişiklikleri kaydetmek için çok az miktarda saf DNA kullanan kolay ve son derece hassas bir tekniktir.Bu yöntem, ATP'ye bağımlı kromatin remodeling proteinlerinin aracılık ettiği transkripsiyon regülasyonu hakkında fikir verebilir. Başlamak için, tamponların ve diğer reaksiyon bileşenlerinin çalışma konsantrasyonlarını taze hazırlayın ve reaksiyonları ayarlamadan önce dört santigrat derecede tutun, ardından NADH bağlantılı oksidasyon testi kullanarak farklı DNA moleküllerinin varlığında proteinin ATPase aktivitesini ölçün. 0,1 milimolar ADAAD, iki milimolar ATP, 10 nanomolar DNA ve 1X REG tamponu 96 kuyulu bir plakada 250 mikrolitrelik son hacme karıştırın.Ardından, reaksiyonu 37 santigrat derecelik bir inkübatörde 30 dakika kuluçkaya bırakın, ardından mikro plaka okuyucu ile birlikte sağlanan yazılımı kullanarak NAD + miktarını ölçün. Emiciliği 340 nanometre olarak ölçmek için NADH testine tıklayın ve 96 kuyu plakasını enstrümandaki plaka tutucusuna yerleştirin, ardından emiciliği kaydetmek için okuma plakası düğmesine tıklayın. CD spektrumunu yüksek saydamlıklı kuvars cuvettes'te toplayın.Dikdörtgen veya silindirik cuvettes kullanın. Cuvettes temizlemek için, birkaç kez su ile yıkayın, sonra temiz olup olmadığını kontrol etmek için cuvette su veya tampon tarama alın. Reaksiyonlar için PAGE saflaştırılmış DNA oligonükleotidleri kullanın.Hızlı soğutma için, DNA'yı ısıtma bloğunda üç dakika boyunca 94 santigrat derecede ısıtın ve hemen buzda soğutun. Yavaş bir soğutma için, DNA'yı üç dakika boyunca 94 santigrat derecede ısıtarak oda sıcaklığına dakika başına bir santigrat derece soğumasını bekleyin. Taban çizgisi spektrumunu kaydetmek için, 1,5 mililitre santrifüj tüpünde birer birer toplam beş kontrol reaksiyonunu ayarlayın.Reaksiyon hacmini tüm reaksiyonlarda 300 mikrolitrede tutun. CD spektrumunu kaydetmek için, 1,5 mililitre santrifüj tüpünde birer birer toplam beş deneysel reaksiyon ayarlayın. Taramayı kaydetmek için gazı açın ve CD spektrometresini açın.10 ila 15 dakika sonra lambayı kapatın, su banyoyu kapatın ve tutucu sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayın. Ardından, CD spektrum yazılımını açın ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye, dalga boyu aralığını 180 ila 300 nanometreye, nokta başına süreyi 0,5 saniyeye ve tarama numarasını beşe ayarlayın, ardından pro veri görüntüleyiciye tıklayın, yeni bir dosya yapın ve deneyin ayrıntıları ve tarihle yeniden adlandırın. Daha sonra, taban çizgisini ve deneysel reaksiyonları pipetleme ile karıştırın ve reaksiyon karışımlarını tek tek cuvette'e dikkatlice aktarın, böylece hava kabarcıkları olmamasını sağlayın.Bir zaman kursu deneyi yapıyorsanız, reaksiyonları gerekli süre boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, ardından taramayı yapın. ATP hidrolizi durdurmak için DNA, ATP, magnezyum ve protein içeren tampona EDTA ekleyin. ATPase aktivitesini tamamen engellemek için EDTA konsantrasyonunu ve kuluçka süresini artırın.Yazılımdaki karşılık gelen reaksiyonlardan taban çizgilerini çıkarın ve CD spektrum yazılımındaki veya veri çizim yazılımındaki verileri yumuşatın, ardından ortalama kalıntı eliptikliğine karşı bir dalga boyu grafiği çizin ve zirveleri analiz edin. M-kıvrımları, MYC DNA'sının her iki ipliğinin de kök halka benzeri bir yapı oluşturabileceğini gösterdi. İlerinin M-kat yapıları ve G dörtgen GECE'yi içeren ters DNA dizisi burada gösterilmiştir.ATP ve ADAAD'ın yokluğunda ve varlığında hızlı soğutulmuş GECE'nin CD spektrumu, ADAAD'ın biri 258 nanometrede, diğeri 210 nanometrede olmak üzere iki pozitif zirveye neden olduğunu gösterdi. EDTA'nın eklenmesi bu konformasyonsal değişimi bozmaktadır. CD spektrumları artık negatif 210 nanometre zirvesine ve 230 ve 250 nanometrede zirveleri olan geniş bir pozitif banda sahiptir.QGRS haritalayıcı ve M-fold analizi, DROSHA, DGCR8 ve DICER'in promotör bölgelerinin G dörtgeni ve kök benzeri yapılar oluşturma potansiyeline sahip olduğunu gösterdi. DROSHA çift beş'in CD spektrumu, ADAAD'ın 210 nanometrede negatif bir zirveye ve 260 nanometrede pozitif bir zirveye neden olduğunu gösterdi. Bu spektrum ADNA'nın bir özelliğidir.DGCR8 pair one'ın CD spektrumu 210 nanometrede pozitif bir zirve ve 260 nanometrede geniş bir negatif zirve gösterdi. Bu spektrum B'den X'e geçişin karakteristiğidir. DGCR8 çifti yedi için 210 ve 270 nanometrede güçlü pozitif zirveler ve 250 nanometrede negatif zirve görüldü.Bu spektrum paralel G dörtgen DNA yapılarının karakteristiğidir. Son olarak, Dicer çifti için biri 210 nanometrede pozitif zirve ve biri 230 nanometrede diğeri 260 nanometrede olmak üzere iki negatif zirve gözlendi. Bu tepeler A'dan X'e DNA geçişinin karakteristiğidir.DNA ve protein saflığının% 99 veya daha fazla olduğundan emin olun. Cuvette temiz olmalı ve taban çizgisi bir milidegreden az olmalıdır. Tüm reaktifler saf olmalıdır, böylece arka plan bir milidegreden azdır.

cd-spectroscopy-to-study-dna-protein-interactions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu videoda, ışınlanmış hücre çekirdeğindeki çift sarmallı DNA kırılma bölgelerinde DNA onarım proteinleri γH2AX ve 53BP1'in lokalizasyonunu görselleştirmek için immünofloresan yöntemini açıklıyoruz.

DNA Onarım Protein Etkileşimlerinin İmmünofloresan Tabanlı Görselleştirilmesi

Bu video, ATP'ye bağımlı kromatin yeniden şekillenme proteininin varlığında DNA'da meydana gelen konformasyonel değişiklikleri incelemek için dairesel dikroizm (CD) spektroskopi tekniğini göstermektedir. ATP hidrolizinin varlığında ve yokluğunda ölçülen CD spektrumlarındaki değişiklikler, ATP'nin yeniden şekillendiricinin bağlı DNA'da konformasyonel değişiklikleri indükleme yeteneğindeki önemini gösterir.

DNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Dairesel Dikroizm Spektroskopisi Tekniği

Diferansiyel taramalı florimetri, proteinlerle etkileşimler için küçük molekül kütüphanelerini taramak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Burada, küçük bir molekül ile protein ortağı arasındaki ayrışma sabitinin bir tahminini sağlamak için bu analizleri genişletmek için basit bir yöntem sunuyoruz.

Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi

Burada, DNA-protein etkileşimleri site-specifically değiştirilmiş λ DNA substrat ve protein etiketli bir kuantum nokta kullanarak toplam iç yansıma floresans mikroskobu tarafından (TIRFM) eğitim için bir iletişim kuralı mevcut.

Qdot etiketli Protein ve Site-specifically tarihinde λ DNA molekülünü düzeyinde arasındaki etkileşimi görüntülenmesi

Modern floresan etiketleme tekniklerini kullanarak canlı hücrelerdeki membran reseptör dinamiklerini incelemek için Förster Rezonans Enerji transferi (FRET) ile birlikte canlı hücre çift renkli floresan çapraz korelasyon spektroskopisi (FCCS) gerçekleştirmek için deneysel bir protokol ve veri analizi iş akışı sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi ve Protein Dinamiklerini incelemek için Çift Renkli Floresan Çapraz Korelasyon Spektroskopisi

Yüksek verimli tek moleküllü bir görüntüleme tekniği olan DNA perdesi, çeşitli protein-DNA etkileşimlerinin gerçek zamanlı görselleştirilmesi için bir platform sağlar. Mevcut protokol, bir Schizosaccharomyces pombe bromodomain içeren AAA+ ATPaz olan Abo1'in biyolojik rolünü ve moleküler mekanizmasını araştırmak için DNA perdesi tekniğini kullanmaktadır.

Histon Düzeneğinin Moleküler Mekanizmasının DNA Perde Tekniği ile Deşifre Edilmesi

Bu makale, streptavidin bazlı bir biyokatman interferometrisi (BLI) sistemi kullanarak DNA-protein etkileşimlerini incelemek için bir protokolü açıklamaktadır. Etkileşimin denge bağlanma afinitesini(KD) belirlemek için temel veya ileri bağlanma kinetiğini kullanmak için temel adımları ve hususları ana hatlarıyla belirtir.

DNA-Protein Etkileşimlerinin Streptavidin Tabanlı Biyotabaka İnterferometrisi ile İncelenmesi

Bu protokol, bileşikler ve protein molekülleri arasındaki bağlanmayı tespit etmek için benzersiz bir yöntemi tanımlar ve minimum protein numune kaybı ve yüksek veri doğruluğu avantajları sunar.

Diferansiyel Taramalı Floresan ile CD40 Protein-Umbelliferon Etkileşiminin Tespiti

Bu protokol, DNA polimerazlar ve G-dörtlü yapılar gibi engeller arasındaki etkileşimlerin gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlayan floresan mikroskobu tabanlı tek moleküllü DNA replikasyon testini ana hatlarıyla belirtir.

G-Dörtlülerinde DNA Polimeraz Dinamiğinin Tek Moleküllü Floresan Görselleştirmesi

Bu protokol, DNA içsel floresan spektrumlarının örnek hazırlanması, veri toplama ve analizi üzerine ayrıntılı işlemler sağlar.

İçsel Kontrast kullanarak DNA moleküllerinin spektroskopik süper çözünürlüklü görüntülemesi

Keşfedin, ATP bağımlı kromatin yeniden yapılandırma proteinleriyle DNA arasındaki etkileşimleri CD spektroskopisi kullanarak inceleyin. Bu hassas yöntem, transkripsiyonel düzenleme mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

DNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için CD Spektroskopisi

Daha fazla video keşfet