Name: Embriyonik Gün 7.5te In Utero Nano-Enjeksiyon (NEPTÜN) ile Murin Nöral Plaka Hedefleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Öğrenin, embriyonik gün 7.5'te fare amniyon boşluğuna lentivirus enjeksiyonu ile nöral plakayı hedefleyen NEPTÜN protokolünü. Bu yöntem, genetik manipülasyon ve soyağacı izleme modelleri için hızlı bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bettina Semsch ve Jia Sun'a (Infinigene) farelere uzman bakımı için teşekkür ederiz; Görüntü yakalama ve konsültasyon konusunda yardım için Biomedicum Imaging Core'dan (BIC) Florian Salomons ve Göran Månsson. Finansman: Bu projeye verdikleri destek için aşağıdaki fon sağlayıcılara teşekkür ederiz: İsveç Araştırma Konseyi, Karolinska Enstitüsü (KI Vakıfları, Kariyer Geliştirme Hibesi, Ph.D. öğrenci KID finansmanı ve SFO StratNeuro finansmanı, Yenilikçi Tıp Merkezi), Ollie ve Elof Ericssons Vakfı, Tornspiran Vakfı, Jeansssons Vakfı, Sven ve Ebba-Christina Hagbergs Ödülü ve araştırma Bursu, Knut ve Alice Wallenberg Proje Hibesi, Fredrik ve Ingrid Thurings Vakfı, Lars Hiertas Minne, Çocukluk Çağı Kanseri Vakfı (Barncancerfonden), Åhlen Vakfı, Åke Wibergs Vakfı, Tore Nilssons Vakfı ve İsveç Vakıfları ERA'ya Hibe Vermeye Başladı. Şekil 4D, E BioRender.com ile oluşturulmuştur.

<ol><li>Theiler, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTheiler%2C+K+%22The+House+mouse.+Atlas+of+embryonic+development%22">The House mouse. Atlas of embryonic development</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1989).</li>
<li>Barresi, M. J. F., Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarresi%2C+MJF+%22Developmental+biology%22">Developmental biology</a>. , Sinauer Associates Inc. Publishers. Sunderland, Massachusetts. (2016).</li>
<li>Taylor, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+success+of+clinical+genome+sequencing+across+a+broad+spectrum+of+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Factors influencing success of clinical genome sequencing across a broad spectrum of disorders.</a> Nature Genetics. 47 (7), 717-726 (2015).</li>
<li>Pizzo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+variants+in+the+genetic+background+modulate+cognitive+and+developmental+phenotypes+in+individuals+carrying+disease-associated+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rare variants in the genetic background modulate cognitive and developmental phenotypes in individuals carrying disease-associated variants.</a> Genetics in Medicine. 21 (4), 816-825 (2019).</li>
<li>Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurulation+in+the+mouse%3A+Manner+and+timing+of+neural+tube+closure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Neurulation in the mouse: Manner and timing of neural tube closure.</a> The Anatomical Record. 223 (2), 194-203 (1989).</li>
<li>Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+and+bending+of+the+avian+neuroepithelium%3A+Morphometric+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Shaping and bending of the avian neuroepithelium: Morphometric analyses.</a> Developmental Biology. 109 (1), 127-139 (1985).</li>
<li>Smith, J. L., Schoenwolf, G. C., Quan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analyses+of+neuroepithelial+cell+shapes+during+bending+of+the+mouse+neural+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analyses of neuroepithelial cell shapes during bending of the mouse neural plate.</a> Journal of Comparative Neurology. 342 (1), 144-151 (1994).</li>
<li>Katahira, T., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+chick+embryos+with+a+vector-based+small+interfering+RNA+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Growth+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system.</a> Development Growth and Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).</li>
<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 230 (2), 376-380 (1997).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+functional+dissection+of+genetic+networks+via+tissue-specific+transduction+and+RNAi+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos.</a> Nature Medicine. 16 (7), 821-827 (2010).</li>
<li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-guided+microinjection+into+the+mouse+forebrain+in+utero+at+E9.5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (45), e2047(2010).</li>
<li>Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nature Neuroscience. 2 (9), 812-819 (1999).</li>
<li>Slevin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+ultrasound-guided+microinjection+for+interventional+studies+of+early+embryonic+and+placental+development+in+vivo+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">High resolution ultrasound-guided microinjection for interventional studies of early embryonic and placental development in vivo in mice.</a> BMC Developmental Biology. 6, 10(2006).</li>
<li>Mangold, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+manipulation+of+nervous+system+gene+expression+with+NEPTUNE%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly efficient manipulation of nervous system gene expression with NEPTUNE.</a> Cell Reports Methods. 1, 100043(2021).</li>
<li>Kameneva, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+human+embryos+identifies+multiple+sympathoblast+lineages+with+potential+implications+for+neuroblastoma+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of human embryos identifies multiple sympathoblast lineages with potential implications for neuroblastoma origin.</a> Nature Genetics. 53 (5), 694-706 (2021).</li>
<li>Kaiser, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEIS-WNT5A+axis+regulates+development+of+fourth+ventricle+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus.</a> Development. 148 (10), (2021).</li>
<li>Haddad, M. R., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+brain-directed+AAV+gene+therapy+results+in+rapid%2C+robust%2C+and+persistent+transduction+of+mouse+choroid+plexus+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Fetal brain-directed AAV gene therapy results in rapid, robust, and persistent transduction of mouse choroid plexus epithelia.</a> Molecular Therapy. Nucleic Acids. 2 (6), 101(2013).</li>
<li>Heavner, W., Pevny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+development+and+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Eye development and retinogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008391(2012).</li>
<li>Swamynathan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+development+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ocular surface development and gene expression.</a> Journal of Ophthalmology. 2013, 103947(2013).</li>
<li>Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+histology+of+rodent+and+human+major+salivary+glands%3A+-overview+of+the+Japan+Salivary+Gland+Society-sponsored+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica+et+Cytochemica%22%5BJournal%5D)">Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands: -overview of the Japan Salivary Gland Society-sponsored workshop.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 45 (5), 241-250 (2012).</li>
<li>Liu, H. X., Komatsu, Y., Mishina, Y., Mistretta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+contribution+to+lingual+mesenchyme%2C+epithelium+and+developing+taste+papillae+and+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest contribution to lingual mesenchyme, epithelium and developing taste papillae and taste buds.</a> Developmental Biology. 368 (2), 294-303 (2012).</li>
<li>Marmigère, F., Ernfors, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+and+connectivity+of+neuronal+subtypes+in+the+sensory+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Specification and connectivity of neuronal subtypes in the sensory lineage.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 8 (2), 114-127 (2007).</li>
<li>Zirlinger, M., Lo, L., McMahon, J., McMahon, A. P., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+the+bHLH+factor+neurogenin-2+marks+a+subpopulation+of+neural+crest+cells+biased+for+a+sensory+but+not+a+neuronal+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transient expression of the bHLH factor neurogenin-2 marks a subpopulation of neural crest cells biased for a sensory but not a neuronal fate.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 8084-8089 (2002).</li>
<li>Portales-Casamar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+toolbox+of+MiniPromoters+to+drive+selective+expression+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A regulatory toolbox of MiniPromoters to drive selective expression in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16589-16594 (2010).</li>
<li>Tervo, D. G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+designer+AAV+variant+permits+efficient+retrograde+access+to+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li>
<li>Loganathan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+driver+mutations+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas+converge+on+NOTCH+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling.</a> Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).</li>
</ol>

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Bu protokolde embriyonik sağkalımı, enjeksiyonların kalitesini ve okumayı etkileyen birkaç adım vardır. Embriyoların gebelik yaşı, gece çiftleşmesinden sonra vajinal tıkaç günü öğlen saatlerinde E0.5 olarak tanımlanır. Öğleden sonra / akşam geç saatlerde E6.5'te hamilelik için ultrason kontrolünün yapılması, embriyoların ultrason ile tanımlanabilecek kadar gelişmesini sağlar. Kontrol (1) kaç tane tıkaç pozitif farenin gerçekten hamile olduğunun önceden taranmasına izin verir, (2) tıkaç pozitif farelerin hamile olmaması durumunda hiçbir virüsün gereksiz yere çözülmemesini ve boşa harcanmamasını sağlar ve (3) fareler üzerindeki gereksiz müdahaleleri azaltır (hamile olmayan kadınlarda ameliyattan kaçınır).
E7.5'te, embriyolar dış kuvvetlere karşı hassastır ve dikkatle kullanılmalıdır. Örneğin, uterus boynuzlarını çekmek veya desiduaları sıkmak embriyo rezorpsiyonuna yol açabilir. Uterus dokusu, dokunun kurumasını önlemek için kadın karnının dışındayken daima nemli tutulmalıdır. Desiduaların çoğunluğu kadın karnının içinde kalmalı ve enjeksiyonlar için sadece 3-4 tanesi maruz kalmalıdır. İğne keskinliği, başarılı enjeksiyonlar için bir diğer önemli belirleyicidir. Künt veya kırık iğne uçları, AC'ye girmeden önce desiduaların tekrar tekrar dürtülmesine veya modelleme kiline karşı sıkıştırılmasına neden olur ve bu da rezorpsiyon oranını artırabilir. Bu nedenle, iyi öğütülmüş ve keskin iğneler her zaman güvenli bir şekilde saklanmalı ve en fazla 2 dişiden sonra değiştirilmelidir.
Bu protokol, nöral plakanın tek bir lentivirüs enjeksiyonu ile nasıl hedefleneceğini açıklar. Ayrıca, transdüksiyon etkinliğinin tek hücreli klonlardan tüm beyne nasıl uyarlanabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, cilt ve oral epitel de dahil olmak üzere diğer nöral olmayan dokular da hedeflenir. Ek olarak, tüm hücre tipleri (progenitörler ve farklılaşmış hücreler) dönüştürülür, bu da bu yaklaşımı verimli ancak spesifik olmayan hale getirir. MiniPromoter'ların viral yapıda kullanılması, nöronlarda veya astrositlerde transgenin spesifik ekspresyonuna yol açar15. Bu, özel transgenik Cre hayvanlarının kullanımından kaçınma avantajına sahiptir ve bu nedenle işgücü miktarını (gerinim bakımı ve genotipleme) ve maliyetleri azaltır.
NEPTÜN'ün sınırlamaları arasında teknik zorluğu, hamile kadınları öngörülebilir ve tutarlı bir oranda elde etmedeki zorluklar ve özel enstrümantasyon edinme maliyetleri bulunmaktadır. Ayrıca, lentivirüs tarafından hücrelerin seçici olmayan bir şekilde hedeflenmesi, tekniğin hem yararı hem de bir sınırlaması olarak görülebilir. AC'ye daha büyük hacimlerin enjeksiyonu ekzensefali13 ile sonuçlanır, ancak burada açıklanan hacimlerle beyin malformasyonları ve eksensefali önlenir15. Bu nedenle, beyin gelişimi üzerinde olumsuz bir etki, embriyonik aşamaya ve AC boyutuna uyarlanmış doğru hacimlerin enjekte edilmesiyle dikkatlice kaçınılması gereken utero nano enjeksiyonlarla ilgili bir risktir.
Tekniğin gelecekteki uyarlamaları viral tropizme odaklanabilir. Adeno ilişkili virüsler (AAV'ler), CNS 17,26'daki farklı hücre tiplerini sağlam bir şekilde hedeflediği gösterilen farklı serotiplere sahiptir. Bununla birlikte, AAV'ler konakçı hücre genomuna entegre olmaz ve bu nedenle yüksek bölünme oranına sahip hücrelerde kaybolabilir. NEPTÜN'ün özgüllüğünü arttırmanın birkaç yolu olmasına rağmen, transgenik hayvanlar in vivo gen manipülasyonu söz konusu olduğunda hala altın standarttır. Cas9 fareleri ve sgRNA kodlayan lentivirüs, embriyonik epidermis27'de genetik tarama için kullanılmıştır ve ayrıca gelişmekte olan CNS'ye uyarlanabilir.
E7.5'teki AC'ye enjeksiyonlar, nörülasyonun başlamasından önce nöroektodermin hücrelerini etkili bir şekilde hedefler ve gelişmekte olan beyni utero elektroporasyondan daha verimli bir şekilde hedefler. Bu, beyin gelişimi için önemli olan genetik ipuçlarının daha erken bir zaman noktasından incelenmesine izin verir. Klasik genetik fare modellerinin aksine, NEPTUNE fonksiyonel gen analizi yapmak için esnek bir yaklaşım sunar. Aşırı ekspresyon veya gen delesyonunu takip eden fenotipler, aylara veya yıllara kıyasla günler ila haftalar içinde incelenebilir. Birden fazla viral yapının enjeksiyonları, bir embriyo içinde birkaç genin manipülasyonuna izin verir ve çift veya üçlü nakavt hayvanlarının oluşumunu önler. Bu nedenle, NEPTÜN sadece zaman kazandırmakla kalmaz, aynı zamanda araştırmalarda kullanılan hayvan sayısını da azaltabilir.

Beyin ve omurilik, embriyogenez 1,2 sırasında oluşumu başlatan ilk organlar arasındadır. Nörogelişimsel bozukluklarla ilişkili genler tanımlanmakla birlikte, genetik varyantların fonksiyonel sorgulaması 3,4'ün gerisinde kalmıştır. Koşullu nakavt farelerin üretimi aylar veya yıllar alabileceğinden, gelişmekte olan beyindeki gen fonksiyonunu hızlı bir şekilde araştırmak için alternatif bir teknik ilgi çekicidir. Fare embriyolarında, nörülasyon - nöral plakanın merkezi sinir sistemine (CNS) yol açmak için nöral tüpe dönüştüğü morfogenetik süreç - gebe kalmasonrası 8 ila 10. günler arasında gerçekleşir 5. Nörülasyonun başlamasından önce, nöral plaka, ektodermin bir parçası olarak, CNS 6,7 içindeki sayısız nöronal ve glial hücre tipine çoğalacak ve farklılaşacak tek bir sütunlu hücre katmanından oluşur. Bu nedenle, CNS'deki gen ekspresyonunda deneysel olarak uzun süreli değişiklikleri indüklemek için, nöral plakayı hedeflemek, tüm progenitör hücrelerin erişilebilirliği de dahil olmak üzere belirgin avantajlar sunar.
Nörobilimde, ovo elektroporasyonunda8,9 ve fare embriyolarının viral transdüksiyonu, embriyonik CNS gen ekspresyonunu manipüle etmek için kullanılmıştır. Gelişmekte olan civciv embriyosu, yumurtadaki civciv embriyosunun erişilebilirliği ve bunun sonucunda gen ekspresyonunu manipüle etmenin kolaylığı nedeniyle omurilik gelişimi sırasında gen fonksiyonunu incelemek için tercih edilen bir model olmuştur. Özellikle, ovo plazmidinde elektroporasyon, her civciv omuriliğinde deneysel ve kontrol koşulları oluşturur. Elektroporasyon, hücre zarı geçirgenliğine neden olur ve embriyoya iki elektrot aracılığıyla bir elektrik darbesi uygulayarak negatif yüklü DNA'yı (negatif) katottan (pozitif) anoda doğru yönlendirir. Farelerde, utero elektroporasyon genellikle nörülasyonun tamamlandığı embriyonik aşamalarla sınırlıdır ve beyin veya omurilik zaten birkaç hücre katmanından oluşur ve bu da düşük elektroporasyon verimliliği10 ile sonuçlanır. Plazmid elektroporasyonu geçici gen ekspresyonu ile sonuçlanır ve genellikle az sayıda hücreyi hedef alır.
Ultrason rehberliğinde utero mikroenjeksiyon, cilt ve beyin gibi farklı embriyonik yapıları manipüle etmek için kullanılmıştır11,12,13,14. Bununla birlikte, gelişmekte olan murin CNS'yi hedef alan enjeksiyonlar düşük etkinlik göstermiş veya embriyonik sağkalımı olumsuz etkilemiştir12,13,14. Bu nedenle, yüksek titreli lentivirüsün E7.5'teki amniyotik boşluğa (AC) verilmesi için geliştirilmiş bir protokol geliştirilmiştir; bu, in uteronano-injection15 ile neural pgeç targeting için NEPTÜN olarak adlandırılmıştır. Enjeksiyonlar, E13.5'te tüm beynin% >95'inin uzun süreli hedefleme etkinliği ile sonuçlandı. Ayrıca, gebeliğin ultrason doğrulaması sırasında, araştırma hayvanları üzerinde gereksiz prosedürleri en aza indirmek ve enjeksiyon başarısını en üst düzeye çıkarmak için kadınları ve gebelikleri gelişim aşamasına göre sıralamak için bir evreleme adımı tanıtıldı. Enjeksiyon verimliliği ve hayatta kalma, AC boyutundaki artışla sıkı sıkıya bağlantılıdır. Bu nedenle, bu makalede, embriyonun emilimine neden olmayacak AC'ye uygun bir hacim vermek için enjeksiyondan önce AC boyutunun nasıl ölçüleceği açıklanmaktadır. NEPTÜN, mevcut in utero yaklaşımlara sağlam bir alternatiftir ve fonksiyon çalışmaları kazancı ve kaybı, soy izleme veya tarama15,16 dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli kullanımlar için uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>1 mL Şırınga</td><td>BD Bioscience</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>27 G İğne</td><td>BD Bioscience</td><td>300635</td><td></td></tr><tr><td>3.5 inç kılcal damarlar</td><td>Drummond Scientific</td><td>3000203G/X</td><td>Ev içi iğneleri çekmek için kullanıldı</td></tr><tr><td>70 MHz MS Serisi dönüştürücü</td><td>Visual Sonics</td><td>MS700</td><td></td></tr><tr><td>Aquasonic şeffaf ultrason jeli</td><td>Parker Laboratuvarları</td><td>Mar-50</td><td></td></tr><tr><td>Autoclip Aplier 9 mm</td><td>Angthos</td><td>12020-09</td><td></td></tr><tr><td>CD1 fareler</td><td>Charles River, Almanya</td><td>Crl:CD1(ICR)</td><td>Dişiler: 8 haftalıktan itibaren Erkekler: 12 haftalıktan itibaren</td></tr><tr><td>Pamuklu Çubuk</td><td>OneMed Sverige AB</td><td>120788</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Pansuman forseps narin düz 13 cm</td><td>Agnthos</td><td>08-032-130</td><td></td></tr><tr><td>EG-400 Narishige Mikropipet Öğütücü</td><td>Narishige</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>EZ klipsleri 9 mm</td><td>Angthos</td><td>59027</td><td>klipsleri</td></tr><tr><td>İris Makas, Süper Kesim, düz, 9 cm</td><td>Agnthos</td><td>307-336-090</td><td></td></tr><tr><td>İzofloran</td><td>Baxter Medical AB</td><td>EAN: 50085412586613</td> İsveç Eczanesi Kimwipes Kimberly <td>Clarke'dan satın alındı</td></tr><tr><td></td><td></td><td>7557</td><td></td></tr><tr><td>Membran Bant</td><td>Görsel Sonics</td><td>SA-11053</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter Aleti</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Modelleme Clay</td><td>Sense AB</td><td>10209</td><td></td></tr><tr><td>Fare İşleme Masası</td><td>Görsel Sonics</td><td>50249</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II Otomatik Enjektör Kiti</td><td>Drummond</td><td>3-000-205A</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>HS234526C</td><td></td></tr><tr><td>Merkezi açıklıklı Petri kabı (alçak duvar)</td><td>Visual Sonics</td><td>SA-11620</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı, (&Oslash; xH): 92 x 16 mm</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>Rely+On Virkon</td><td>DuPont</td><td>130000132037</td><td>dezenfektan</td></tr><tr><td>Silikon membran</td><td>Visual Sonics</td><td>SA-11054</td><td></td></tr><tr><td>Steri 250, sıcak boncuk sterilizatörü</td><td>Angthos</td><td>31100</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Bant (1,25 cm x 9,14 m)</td><td>Medicarrier</td><td>67034</td><td></td></tr><tr><td>Vevo Compact Dual (Orta Hava & O2) Anestezi Sistemi</td><td>Görsel Sonics</td><td>VS-12055</td><td></td></tr><tr><td>Vevo Görüntüleme İstasyonu 2</td><td>Görsel Sonics</td><td>VS-11983</td><td></td></tr><tr><td>Vevo2100</td><td>Görsel Sonics</td><td>VS-20047</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 6-0; C-3 iğne, 45 cm mor filament</td><td>Agnthos</td><td>J384H</td><td></td></tr></tbody></table>

embriyonik gün 7.5'te in utero nano-enjeksiyon (neptÜn) ile murin nöral plaka hedefleme

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Utero'da gelişmekte olan fare beynindeki gen ekspresyonunu manipüle etmek , fonksiyonel genetik çalışmaları için büyük bir potansiyele sahiptir. Bununla birlikte, daha önce büyük ölçüde nörülasyon sonrası embriyonik aşamaların manipülasyonu ile sınırlandırılmıştır. Amniyotik boşluğu embriyonik günde (E)7.5 enjekte etmek ve lentivirüs vermek, cDNA veya shRNA'yı kodlamak, nöral plaka ve nöral krest hücrelerinin% >95'ini hedef alarak gelecekteki beyin, omurilik ve periferik sinir sistemine katkıda bulunan bir protokol geliştirilmiştir. Bu protokol, cam kılcal damar iğnelerinin öğütülmesi, gebelik doğrulaması, ultrason görüntüleme kullanılarak gelişimsel evreleme ve embriyonik aşamalarla eşleşen optimal enjeksiyon hacimleri dahil olmak üzere başarılı bir transdüksiyon elde etmek için gerekli adımları açıklamaktadır. 
Bu protokolü takiben, gelişmekte olan beynin %>95'inin yüksek titreli lentivirüs ile transdüksiyonunu sağlamak ve böylece tüm beyin genetik manipülasyonunu gerçekleştirmek mümkündür. Buna karşılık, daha düşük viral titreler kullanarak mozaik transdüksiyonu elde etmek mümkündür, bu da genetik taramaya veya soy izlemeye izin verir. E7.5'teki enjeksiyon ayrıca göz, dil ve periferik sinir sisteminin farklı bölmelerine katkıda bulunan ektoderm ve nöral tepeyi de hedefler. Bu teknik, deneylerde kullanılan fare sayısını azaltma yararıyla, fare nöral plakası ve ektoderm kaynaklı dokulardaki gen ekspresyonunu prenörülasyon aşamalarından manipüle etme imkanı sunar.

E7.5'e hPGK-H2B-GFP lentivirüs11,12 enjekte edilen embriyolar E13.5'te toplandı ve floresan diseksiyon mikroskobu altında incelendi (Şekil 5A). Nöral plağın başarılı bir şekilde transdüksiyonu, esas olarak beyinde ve diğer ektoderm türevi dokularda, örneğin deride floresan bir muhabirin güçlü ekspresyonuna sahip embriyolarla sonuçlanır (Şekil 5A, B). Aşırı yüksek bir hacmin enjeksiyonu (burada önerilen hacimlerden daha büyük, örneğin, ≥500 nL) AC'deki basıncı arttırır ve tam rezorpsiyona (veriler gösterilmemiştir) veya ekzensefali gibi nöral tüp defektlerine (Şekil 5A) neden olabilir. E7.5'teki başarılı enjeksiyonlar, ön beyinden arka beyne düzgün bir şekilde transdüksiyonla sonuçlanır (Şekil 5C-J).
2 × 10 10bulaşıcı ünite (IFU) civarındaki lentiviral titreler% 95'in üzerinde hedefleme elde ederken, ~ 1 × 109 IFU'luk titreler% 15 hedefleme verimliliği15'e ulaşır. Ek olarak, koroid pleksus17,18 gibi elektroporasyon kullanılarak hedeflenmesi daha önce zor olan yapılar da hedeflenmektedir (Şekil 5 E,F). Düşük titreli enjeksiyonlar, tek hücreli klonların (Şekil 5C, Şekil 5E ve Şekil 5G, H) transdüksiyonu ile sonuçlanırken, yüksek titreli virüs kullanımı tüm beynin yaklaşık% 100'ünü dönüştürür (Şekil 5D, Şekil 5F, Şekil 5H ve Şekil 5J ). Bu nedenle, NEPTÜN klonal transdüksiyon, soy izleme ve genetik tarama yaklaşımları için veya tüm beyinde gen aşırı ekspresyonunun veya downregülasyonunun küresel etkilerini incelemek için kullanılabilir.
Memeli göz gelişimi, embriyonik ektodermin üç türevi arasındaki iyi organize edilmiş iletişimin sonucudur: nöral retina (NR) ve retinal pigment epiteli (RPE), ventral ön beynin nöroepitelinden türetilirken, yüzey ektodermi gelecekteki lens ve kornea epiteline yol açar. Bununla birlikte, korneanın diğer iki tabakası olan santral stroma ve posterior endotel, perioküler mezenkimin nöral krest hücrelerinden türetilir19,20. E7.5'te yüksek titreli lentivirüs ile enjekte edilen E13.5 embriyoları boyunca koronal kesitler, beyne benzer şekilde, gözün nöral dokusunun yanı sıra lens, kornea ve mezenkimin yüksek ve düzgün transdüksiyonunu göstermiştir (Şekil 5K). Nörülasyon ilerledikçe, E8.5 ve E9.5'teki enjeksiyonlar, lens ve kornea epitelinin (Şekil 5L ve Şekil 5N) sürekli hedeflenmesine neden olurken, gözün nöroektoderm kaynaklı dokularının transdüksiyonu E8.5'te (Şekil 5L, M) daha az verimlidir veya E9.5'i hedeflemez (Şekil 5N).
Çoğu viral partikül enjeksiyon üzerine maruz kalan dokuları enfekte ederken, bazı partiküller daha sonra gelişen ektodermal olmayan türetilmiş dokuları dönüştürür (Şekil 6A). Tükürük bezleri ve kanalları oral epitel21'den E11.5 civarında gelişir ve NEPTÜN ile hedeflenir (Şekil 6B). E9.5'teki enjeksiyonları takiben, dilin lingual epiteli iyi dönüştürülür; Bununla birlikte, altta yatan mezenkim negatiftir (Şekil 6C; parantezler dönüştürülmüş hücreleri gösterir; yıldız işaretleri dönüştürülmüş hücreleri değil otofloresan sinyalini gösterir). Ek olarak, lingual epitel içinde, negatif kesitlerle ayrılmış pozitif kümeler vardır (Şekil 6C, beyaz ok uçları), papilla yüzeyinin transdüksiyonunu düşündürmektedir. Nöral krest hücreleri, altta yatan dil mezenkiminde ve lingual epitel içinde, tat papillalarının ve tat tomurcuklarının gelişiminde rol oynadıkları tanımlanmıştır22. Gerçekten de, E7.5'teki enjeksiyonlar, E13.5'te dil mezenkiminin yaygın bir şekilde transdüksiyonuna neden olur (Şekil 6D), bu da erken enjeksiyonların nöral krest hücrelerini hedef aldığını ve dildeki mezenkimlere katkıda bulunduğunu düşündürmektedir.
Omurgalılarda, dorsal kök ganglionları (DRG'ler), periferik sinir sisteminin (PNS) merkezi bir bileşenidir, çünkü vücudun çevresinden gelen tüm somatosensoriyel girdiler (sıcaklık, ağrı, basınç) DRG nöronlarının aktivasyonu yoluyla beyne iletilir23. DRG'nin hem nöronları hem de glial hücreleri, gövde nöral krest hücrelerinden türetilir24. Her yerde bulunan hPGK promotörünün floresan muhabirin ekspresyonunu kontrol ettiği lentiviral enjeksiyon, merkezi ve periferik sinir sisteminin (Şekil 7A) yaygın bir şekilde hedeflenmesine yol açarak, omurilikteki hem nöronları hem de progenitörleri (Şekil 7B) ve DRG'yi (Şekil 7C) dönüştürür. Doublecortin25 için bir MiniPromoter kullanmak, GFP ekspresyonunu sadece nöronlarla sınırlamayı mümkün kılar (15 ve Şekil 7D, E).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3.jpg"> Şekil 5: NEPTÜN ile yüksek verimlilik veya klonal transdüksiyon. (A) Standart aydınlatma ile aydınlatılmış diseksiyon mikroskobu altındaki E13.5 embriyoları (sol panel) ve GFP için aydınlatılmış aynı embriyolar (sağ panel). En solda enjekte edilmemiş embriyo, en sağda başarılı bir şekilde enjekte edilen embriyo, beyinde pozitif sinyal verir (en sağdaki embriyo). Enjekte edilen aşırı hacim nedeniyle ekzensefalik embriyo (orta embriyo). (B) E7.5 enjeksiyonu ile cilt ve beyin hedefleme. Ölçek çubuğu = 50 μm. (C, D) E13.5 düşük klonal transdüksiyon (C) veya yüksek verimli transdüksiyon (D) ile ön beynin konfokal görüntüleri. (C, E, G, I) Beyindeki farklı bölgelerin klonal transdüksiyonu. (D, F, H, J) Beyindeki farklı bölgelerin yüksek verimli transdüksiyonu. Ölçek çubukları = 200 μm. Farklı transdüksiyon etkinlikleri CNS'nin diğer alanlarını temsil eder. (E, F) Koroid Pleksus hedefleme, klonal olarak (E) veya yüksek verimlilikte (F). Ölçek çubukları = 200 μm. (G, H) Klonal hedefleme (G) ve arka beynin yüksek verimli (H) hedeflemesi, büyütülmüş (I, J). Ölçek çubukları = 200 μm. (K) E13.5'te gözde GFP muhabir ekspresyonu, E7.5'te utero enjeksiyondan sonra (L, M) E15.5'te gözde GFP muhabir ekspresyonu, E8.5'te (L) utero enjeksiyondan sonra, (M) veya E9.5'te (N) büyütülmüş kutulu bölge. Otofloresan kan damarları beyaz yıldızlarla işaretlenmiştir. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: NEPTÜN = neural pgeç t argeting ile in uteronano-injection; C = Kornea; LE = Lens Epiteli; LF = Lens lifleri; M = Mezenkim; NR = Nöral Retina; AÇIK = Optik Sinir; RPE = Retinal Pigment Epiteli; GFP = yeşil floresan protein; CNS = merkezi sinir sistemi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig06.jpg"> Şekil 6: Nöral olmayan dokuların in utero transdüksiyonu. (A) E15.5 ağız boşluğunun konfokal görüntüsü. Embriyoya E9.5'te floresan muhabir lentivirüs enjekte edildi. Ölçek çubuğu = 200 μm. (B, C) (B) İç panelin büyütülmesi; tükürük kanalı epiteli virüs ile transdüe edilir. (C) İç panelin büyütülmesi; GFP muhabir virüsü (beyaz parantez) ile transdüke edilen dorsal lingual epitel. Nöral krest hücrelerinden türetilen altta yatan mezenkim negatiftir. Beyaz ok uçları, virüs tarafından dönüştürülmüş epitel hücreleri ile çevrili negatif nöral tepe hücrelerine sahip papillaları gösterir (otofloresan kan hücreleri / damarlar beyaz yıldızlarla işaretlenmiştir). Ölçek çubukları = 50 μm. (D) E7.5'te floresan muhabir virüsü ile enjeksiyonlardan sonra E13.5 dil mezenkiminin şematik ve konfokal görüntüsü. Ölçek çubuğu = 50 μm. Kısaltmalar: D = Dorsal; M = Mezenkim; N = Nazofarenks; SLD = Dil Altı Kanalı; SMD = Submandibuler Kanal; T = Dil; V = Ventral; GFP = yeşil floresan proteini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig07.jpg"> Şekil 7: Nöral tepe kaynaklı dorsal kök ganglion hücrelerinin transdüksiyonu. (A) E7.5'te NEPTÜN hedeflemesi hem CNS hem de PNS'nin hedeflenmesine izin verir. (B) E13.5 omuriliğin konfokal görüntüsü ve E7.5'te hPGK-H2B-GFP muhabir lentivirüsü ile enjekte edilen DRG'ler hem SOX2 + nöral progenitörlerin hem de NeuN + nöronlarının transdüksiyonunu göstermektedir. Ölçek çubuğu = 100 μm. (C) SOX2+ (beyaz oklar) ve NeuN+ (beyaz ok uçları) hücre popülasyonlarında GFP ekspresyonlu DRG'yi gösteren B'nin kutulu bölgesi. Ölçek çubuğu = 20 μm. (D) E13.5 omuriliğin ve DRG'nin konfokal görüntüsü, E7.5'te DCX-H2B-GFP lentivirüsü ile enjekte edilir ve yalnızca DCX + hücrelerini hedef alır. Ölçek çubuğu = 100 μm. (E) DCX+ nöronlarla sınırlı GFP ekspresyonuna sahip DRG'yi gösteren D'nin kutulu bölgesi (beyaz ok uçları). DCX hücreleri GFP (beyaz oklar) için negatiftir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Kısaltmalar: NEPTÜN = neural pgeç t argeting ile in utero nano-injection; CNS = merkezi sinir sistemi; PNS = periferik sinir sistemi; DRG'ler = sırt kökü gangliyonu; GFP = yeşil floresan proteini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig07large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokolde, E7.5'teki fare amniyotik boşluğunun lentivirüs ile nasıl enjekte edileceğini açıklıyoruz, bu da tüm sinir plakasının düzgün bir şekilde transdüksiyonuna yol açarak, hayatta kalma veya embriyonik gelişim üzerinde minimum zararlı etkiye sahiptir.

Embriyonik Gün 7.5'te In Utero Nano-Enjeksiyon (NEPTÜN) ile Murin Nöral Plaka Hedefleme

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...

NEPTÜN, embriyonik 7.5. günden itibaren fare embriyonik sinir sisteminin hedeflenmesine ve genetik manipülasyonuna izin verir ve günler içinde nakavt veya soy izleme modellerinin üretilmesini sağlar. Bu protokol uyarlanabilir, esnek ve hızlıdır. Farklı soruları aylar veya yıllar yerine günler içinde ele almak için shRNA, cdRNA veya barkodlu viral kütüphaneler sunabiliriz.NEPTÜN'ün nörobilimde içgörüler sağlayacağını umuyoruz, ancak diğer organ sistemlerine de uyarlanabilir. Amniyotik boşluğu tanımlamak oldukça zor olabilir, bu nedenle ultrason görüntüsüne bakmak için zaman ayırın ve belki de elinizde bir ders kitabı veya başka bir anatomi kaynağı bulundurun. İğneyi yüklemeye başlamak için, cam iğneyi metal pistonun üzerine kaydırın, koletin bağlı kalmasını sağlayın, ancak hafifçe gevşetin.Ardından, kılcal iğneyi metal pistonla birlikte ara parçaya ulaşana kadar ön contadan geçirin. Pistonu iğnenin içine itmek ve yağı iğne ucundan dışarı atmak için Boş tuşuna basın. Ardından, yağı ve çözeltiyi bölen bir hava kabarcığı oluşturmak için Doldur düğmesine basın.Son olarak, iğneyi indirin, ucu çözeltiye batırın ve iğneyi yüklemek için tekrar Doldur'a basın. Isıtma masasında ideal boyutta amniyotik boşluklara sahip anestezi uygulanmış bir dişi fareyi sabitledikten sonra, kornea kurumamasını önlemek için her iki göze de göz jeli uygulayın ve deri altından bir ağrı kesici enjekte edin. Daha sonra, mililitre klorheksidin çözeltisi başına 0.5 miligram ile ıslatılmış bir bezle silerek alt karnı sterilize edin ve cildi kurutun.Daha sonra, cerrahi makas kullanarak, alt karın bölgesinde 1.5 ila 2 santimetrelik dikey orta hat cilt kesisi yapın. Daha sonra cildi nazikçe kaldırın ve ameliyattan sonra dikiş atmayı kolaylaştırmak için insizyon noktasının yaklaşık bir santimetre etrafındaki altta yatan kas tabakasından serbest bırakın. Daha sonra, kas tabakasına bir santimetrelik dikey orta hat kesisi yapın.Bir çift forseps kullanarak, cildin ve kas tabakasının bir tarafını kaldırın ve başka bir çiftle uterus boynuzlarını arayın. Daha sonra, forseps kullanarak, embriyolar arasındaki dokuyu tutun ve her iki uterus boynuzunu da karından dikkatlice çekin. Her iki taraftaki yumurtalıktan servikse veya serviksten yumurtalıklara kadar embriyoları sayın ve numaralandırın.Daha sonra, nemli bir pamuklu çubukla, enjekte edilecek ilk üçü hariç, tüm embriyoları nazikçe karın boşluğuna geri itin. Daha sonra, ticari olarak temin edilebilen modifiye edilmiş bir Petri kabının yuvarlak merkezi açıklığına yapıştırılmış elastik bir zar üzerine bir damla PBS yerleştirin ve embriyoların hemen üzerinde tutun. Elastik insizyona kapalı forseps yerleştirin, ardından elastik insizyonu açmak için forsepsleri serbest bırakın ve sıvıyı embriyoların üzerine bırakın.Forseps kullanarak, üç embriyoya karşılık gelen uterus bölümünü elastik yoldan çekin ve Petri kabını farenin karnına hafifçe tüneyin. Dört kil ayağı kullanarak, fare üzerindeki baskıyı azaltmak için Petri kabını karın üzerine sabitleyin ve sabitleyin ve ayrıca görüntülemenin farenin nefes alma ve kalp atışına duyarlılığını azaltın. Daha sonra, forseps ve nemli bir pamuklu çubuk kullanarak, elastiğin farenin derisinin etrafına kapatıldığından emin olmak için uterusu ve elastiği ayarlayın ve PBS sızıntısını önleyin.Daha sonra, uterusu sabitlemek için, modelleme kil silindirini embriyoların veya uterusun sağına bastırın ve embriyolar ve uterus tamamen PBS ile kaplanana kadar Petri kabına PBS ekleyin. Enjeksiyonların kaydedilmesini kolaylaştırmak için, ultrason probunu PBS'ye batırın ve fareyi veya ameliyat masasını, ilk embriyo ultrason probu ile hizalanacak şekilde ayarlayın. Her üç embriyoyu da tarayın ve amniyotik boşlukları inceleyin.Daha sonra, ultrason makinesini kullanarak, uygun enjeksiyon hacmini belirlemek için amniyotik boşluğun çapını ölçün. Enjeksiyon kontrolörünü kullanarak, belirlenen enjeksiyon hacimlerini ve enjeksiyon hızını, saniyede 23 nanolitrelik bir enjeksiyon hızı ile yavaşlayacak şekilde ayarlayın. İğneyi PBS'ye indirdikten sonra, raylı sistemdeki ana tekerlekleri kullanarak, sıvı iğne ucuna ulaşana kadar nanoenjektör kontrolöründe Boş düğmesine basın.Ardından, iğneyi PBS'den çıkarın ve yaklaşık istenen hacimde bir damlanın boşaltıldığını doğrulamak için Enjekte Et düğmesine basın. İğneyi tekrar PBS'ye indirin ve iğneyi ultrason probu ve embriyo ile hizalamak için nanoenjektörü mikromanipülatördeki Y-düzlemi tekerleği ile hareket ettirin. Rahim duvarına göre neredeyse dik bir enjeksiyon açısı sağlamak için enjeksiyon açısı tekerleği ile iğne açısını ayarlayın.Daha sonra, mikromanipülatör üzerindeki enjeksiyon tekerleğini kullanarak, iğneyi tek bir hareketle amniyotik boşluğa yerleştirin. İğne ucu ultrason görüntüsünden kaybolursa, iğneyi tekrar odakta tutmak için probu ileri veya geri hareket ettirin. Ardından, uygun sayıda Enjekte Et düğmesine basarak istediğiniz hacmi enjekte edin.Gerekli hacim enjekte edildikten sonra, iğneyi nazik bir hareketle geri çekmeden önce 5 ila 10 saniye bekleyin. Aşamayı bir sonraki embriyoya taşıyın ve gösterildiği gibi diğer iki embriyo için enjeksiyonu tekrarlayın. Daha sonra, mikromanipülatörü kullanarak ultrason probunu ve iğneyi PBS'den çıkarın, hasar ve yaralanmayı önlemek için iğneyi operatörden uzaklaştırın.Forseps kullanarak, birinci ve ikinci embriyoları elastik yoldan yavaşça iterek tekrar karın içine yerleştirin. Ardından, üçüncü embriyoya bitişik dokuyu yavaşça kavrayın ve uterusu elastik insizyonun üst ucuna doğru çekin. Forseps ile dördüncü ila altıncı embriyoları yavaşça yukarı çekin ve üçüncü embriyonun karın içine tekrar girmesine izin verin.Optimal amniyotik boşluklara sahip tüm embriyolar enjekte edildikten sonra, embriyoları ve uterusu yavaşça farenin karnına geri itin. Nöral plağın başarılı bir şekilde transdüksiyonu, beyinde ve cilt gibi diğer ektoderm kaynaklı dokularda floresan muhabirin güçlü ekspresyonuna sahip embriyolarla sonuçlanır. Aşırı yüksek hacimlerin enjekte edilmesi, ekzensefali gibi nöral tüp defektlerine neden olabilir.Embriyonik gün 7.5'teki başarılı enjeksiyonlar, koroid pleksus da dahil olmak üzere ön beyinden arka beyne düzgün bir transdüksiyonla sonuçlanır. Düşük titre enjeksiyonları, tek hücreli klonların transdüksiyonu ile sonuçlanırken, yüksek titre virüsü tüm beynin yaklaşık% 100'ünü dönüştürür. Embriyonik gün 13.5 embriyoları boyunca koronal kesitlerde göz, lens, kornea ve mezenkimde nöral dokunun yüksek ve homojen transdüksiyonu görüldü.Embriyonik gün 9.5'te enjeksiyonu takiben, oral epitelden embriyonik gün 11.5 civarında tükürük bezleri ve kanalları gelişir. Dilin lingual epiteli iyi transdüe edilirken, altta yatan mezenkim negatiftir. Ek olarak, lingual epitel içindeki pozitif kümeler, papiller yüzeyin transdüksiyonunu düşündüren negatif kesitlerle ayrılır.Embriyonik gün 7.5'teki enjeksiyonlar, embriyonik gün 13.5'te dil mezenkiminin yaygın transdüksiyonu ile sonuçlanır, bu da erken enjeksiyonların nöral krest hücrelerini hedef aldığını ve dildeki mezenkimlere katkıda bulunduğunu düşündürür. Lentiviral enjeksiyonlar ayrıca merkezi ve periferik sinir sisteminin yaygın bir şekilde hedeflenmesine yol açarak, omurilikteki hem nöronları hem de progenitörleri ve ayrıca dorsal kök gangliyonlarını dönüştürür. İyi hazırlık şarttır.Sızıntı olmadığından ve embriyoların iyi sabitlendiğinden emin olun, böylece tamamen sıçan boşluğuna enjeksiyonlara odaklanabilirsiniz. NEPTÜN'den sonra analiz, beynin immünofloresan analizi, tek hücreli RNA dizilimi veya enjekte edilen embriyoların davranışsal analiz için doğmasına izin verilmesi gibi çeşitli yöntemlerle yapılabilir.

murine-neural-plate-targeting-utero-nano-injection-neptune-at

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Utero sağkalım cerrahisinde farelerde gen ekspresyonu gelişimi sırasında moleküler manipülasyon izin verir. Burada, yüksek frekanslı ultrason görüntüleme embriyonik gün fare beyin (E) 9.5 retroviral vektörlerin enjeksiyon kılavuzunu kullanımı açıklanmaktadır.

Fare önbeyin içine Ultrason Rehberliğinde Mikroenjeksiyon In Utero E9.5 az

Utero elektroporasyon nöronal progenitör hücrelerinin in vivo transfecting için değerli bir yöntemdir. Elektrotlar ve elektroporasyon gelişimsel timepoint yerleştirme bağlı kortikal hücrelerin bazı altkümelerini hedeflenebilir. Hedeflenen hücreler daha sonra in vivo veya in vitro genetik değişiminin etkileri analiz edilebilir.

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

Utero elektroporasyon gelişmekte olan merkezi sinir sistemi (MSS) bir mekansal ve zamansal olarak kontrollü bir şekilde hızlı bir gen teslimat için izin verir. Burada son derece uyarlanabilir tarif telencephalon diensefalon ve retina da dahil olmak üzere birden fazla embriyonik MSS etki alanı ifade yapıları sunmak için kullanılabilir utero elektroporasyon protokol.

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

Gelişmekte olan fare beyninin içine bir gen transferi yöntemi eşsiz bir cerrahi yöntem ve elektrotlar özel şekli ile tarif edilir. Bu benzersiz tekniği, beyin gelişimi okuyan birçok Nörobilimadamları yardımcı olacak zamansal ve mekansal plazmid DNA transfeksiyon sağlar.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

Anne metabolizma atlar neurulation sırasında, fare embriyo doğrudan farmakolojik manipülasyonu için izin veren bir yöntem açıklanmıştır. Bu teknik, zaman noktası ve farmakolojik ajan değişen neurulation farklı yönlerini incelemek için adapte edilebilir.

Nöral Tüp Kapatma Fare Tüm Embriyo Kültürü

Kaynak: Mangold, K., H el. al., Embriyonik Günde In Utero Nano-Enjeksiyon (NEPTÜN) ile Murin Nöral Plaka Hedefleme 7.5. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, embriyonik bir fare modelinde nöral plaka hedefleme için rahim içi nano enjeksiyon yöntemini göstermektedir. Amniyotik boşluğa yüksek titreli bir lentiviral çözelti enjekte edilir, burada nöral plaka hücrelerine entegre olur ve nörogelişimsel araştırma ve terapötik uygulamalar için stabil gen manipülasyonu sağlar.

Bir Embriyonik Fare Modelinde In Utero Nanoenjeksiyon Yoluyla Nöral Plaka Hücre Manipülasyonu

Bu protokolün amacı, bir kaybı: tanımlamak ve kazanç-of trofoektoderm ve preimplantasyon fare embriyoları iç hücre kütlesi farklılaşma yol açan bir sahne özgü reseptör olarak neogenin tanımlamak için de geçerlidir fonksiyonu yöntemi etmektir.

Preimplantasyon Fare Embriyolar Erken Hücre Kader Belirleyicileri Araştırma kaybı: ve Kazanç fonksiyon-Yaklaşımı

Burada, Xenopus laevis embriyolarının böbreğine yol açan bireysel blastomerlere enjeksiyonları hedeflemek için kader haritalarını ve soy izleyicilerini kullanmak için bir protokol sunuyoruz.

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

Transmisyon elektron mikroskobu ve rahimde iletim sinir sisteminin iyi ultrastructure morfolojik değişiklikler geliştirme sırasında çalışmak için güçlü bir yaklaşımdır. Bu kombine yöntem değişiklikleri içine derin anlayışlar nöroplastisite ile ilgili topografik ifadelerinin temel yapısal detayları verir.

Sonra Ultrastructural nöroplastisite parametrelerinde Utero iletim gelişmekte olan fare beyin ve omurilik değerlendirilmesi

Nöral kök/progenitor hücreleri, hücresel olayların farklı sonuçlarına yol açan Çentik sinyal bileşenlerinin çeşitli ifade dinamiklerini sergilerler. Bu tür dinamik ifade, gen ekspresyonlarında hızlı değişimlerin görselleştirilmesini sağlayan son derece hassas biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanılarak statik analizle değil, gerçek zamanlı izleme ile ortaya çıkabilir.

Murin Nörogenezi Sırasında Çentik Sinyal Dinamiğinin Gerçek Zamanlı Biyolüminesans Görüntülemesi

Burada utero elektroporasyon kullanarak embriyonik gelincik beyin genetik manipülasyon gerçekleştirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntem in vivo neokorteks nöral progenitor hücrelerinin hedeflemesine olanak sağlar.

Utero Elektroporasyon in Ferret Neokorteks nöral progenitor hücrelerinin Vivo Hedefleme

Öğrenin, embriyonik gün 7.5'te fare amniyon boşluğuna lentivirus enjeksiyonu ile nöral plakayı hedefleyen NEPTÜN protokolünü. Bu yöntem, genetik manipülasyon ve soyağacı izleme modelleri için hızlı bir yaklaşım sunar.

Embriyonik Gün 7.5'te In Utero Nano-Enjeksiyon (NEPTÜN) ile Murin Nöral Plaka Hedefleme

Daha fazla video keşfet