Name: Eski Vivo Farede Portal Damarından Hepatik Perfüzyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Keşfedin portal ven perfüzyonu tekniği ile fare karaciğerinde metabolik çalışmalar yapmayı. Bu yöntem diyabet, NAFLD ve NASH gibi hastalık modellerinde karaciğer metabolizmasını gerçek zamanlı izlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889) finansmanıyla desteklenmiştir. Bu çalışmanın bir kısmı, Ulusal Yüksek Manyetik Alan Laboratuvarı'nın Ulusal Bilim Vakfı İşbirliği Anlaşması No tarafından desteklenen İleri Manyetik Rezonans Görüntüleme ve Spektroskopi (AMRIS) Tesisi'ndeki McKnight Beyin Enstitüsü'nde gerçekleştirildi. DMR-1644779 ve Florida Eyaleti.

Fareleri içeren deneyler, Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (protokol numarası #201909320) ile uyumlu olarak ele alınmıştır. Kullanılan fare suşu C57BL/6J idi; tüm fareler erkekti. Bu yöntem genellikle diğer standart fare suşlarını kullanan çalışmalar için de geçerlidir. Bu ameliyat, birlikte çalışan iki kişi tarafından en uygun şekilde gerçekleştirilir.
1. İlk kurulum
<ol><li>Krebs-Henseleit elektrolitleri 6 (25 mM NaHCO3, 112 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM her biri MgSO4, KH 2 PO4 ve 0.5 mM sodyum-EDTA,1.25mM CaCl2),6 mM sodyum laktat, 0.6 mM sodyum piruvat, 0.2 mM [U-13 C] sodyum propiyonat, % 10(v / v) D2O, ve 0.63 mM karışık yağ asitleri (palmitik asit (toplamın% 22.1'i), palmitoleik asit (% 5.2), stearik asit (% 2.7), oleik asit (% 27), linoleik asit (% 37.7), γ-linolenik asit (% 2.4) ve dekosaheksanoik asit (% 2.8) içeren) ile birlikte% 2 (w / v) sığır serum albümini içerir. HCl (ve gerekirse NaOH) kullanarak perfüzyonatın nihai pH'ını 7.3'e ayarlayın.</li>
</ol>2. Ameliyat öncesi kurulum
<ol><li>19.05 mm uzunluğunda 23G iğneli iki adet 1 mL şırınga monte edin. Bir şırıngayı 0,01 mL 1000 ünite/mL heparin ve 0,19 mL tuzlu su (%0,9 (w/v) NaCl ile suda doldurun; Tablo 1).</li>
	<li>İkinci şırıngayı 0.2 mL% 2 lidokain ve% 0.6 mL% 0.9 salin ile doldurun (Tablo 1). 27 G 38.1 mm iğneli başka bir 1 mL şırıngada, perfüzyonla doldurun ve 37 ° C'de muhafaza edin.</li>
</ol>3. Sütun kurulumunu karıştırın
<ol><li>500 mL perfüzyon içeren cam şişeyi su banyosuna yerleştirin (Şekil 1B). Su banyosunu açın ve sıcaklığı ~ 42 ° C'ye ayarlayın. Su banyosundaki yüksek sıcaklık, perfüzyon kolonunda 37 °C'nin korunmasını sağlar.</li>
	<li>Su 42 °C'ye kadar ısındığında, şişedeki perfüzyonu ince film oksijenatörü ve su ceketli 100 cm'lik cam sütun boyunca dolaştırmak için iki pompayı açın (Şekil 1A-E).</li>
	<li>Oksijenatör7'yi basınçlandırmak için oksijenlendirici gazı (%95 oksijen ve %5 karbondioksit) açın (Şekil 1C). Kateter takılıyken 8 mL/dak debi elde etmek için perfüzyon kolon yüksekliğini ayarlayın (akış hızı ölçümü için adım 9'a bakın)5,8,9. NOT: Akış hızı, perfüzyonun karaciğer tarafından atıldığı hızı ifade eder.</li>
</ol>4. Farenin anestezi altına alınması
<ol><li>IACUC protokolü ve diğer uygun güvenlik yönergelerinin gerektirdiği şekilde KKD'yi donlayın. NOT: Aşağıdaki adımlar 9-13 haftalık fareler için optimize edilmiştir.</li>
	<li>Fareyi izofluran odasına yerleştirin. Dağıtım gazını% 100 oksijene, 1 L / dak akış hızına ve izofluranı% 2'ye10'a çevirin. Nefes yavaşlayana ve sabit olana kadar bekleyin. NOT: Farenin sabit bir cerrahi düzleme ulaşması için, yavaş ve sabit bir solunum hızı ve ayak parmağı sıkışma refleksi eksikliği ile kanıtlandığı gibi, oksijen akış hızı ~ 1.5 L / dak ila ~ 3 L / dak'ya ve izofluran konsantrasyonu% 1 - 3 arasında ayarlanabilir. Taşıyıcı gaz ve izofluran konsantrasyonunun veriliş hızı, hayvanın yaşına ve ağırlığına ve gürültü ve ışık gibi faktörlere bağlıdır.</li>
	<li>Karnı% 70 alkolle dezenfekte edin. Heparini abdominal yağ tabakasına derin bir deri altı enjeksiyonu ile uygulayın (Şekil 2). Fareyi 10 dakika boyunca anestezi odasına geri yerleştirin. NOT: Bu prosedür terminal olduğu için tıraş gerekli değildir.</li>
</ol>5. Selyotomi
<ol><li>Fareyi anestezi odasından ameliyat platformuna aktarın ve sırtüstü pozisyona yerleştirin (Şekil 3).</li>
	<li>Farenin burnunu bir burun konisine yerleştirin ve pençeleri aşağı doğru bantlayın. Boyna boğulmaya yol açabilecek herhangi bir gerginlik uygulamamaya dikkat edin.</li>
	<li>Lidokaini, anterior iliak krest bölgesi11'e bilateral subkutan enjeksiyon yoluyla uygulayın (Şekil 3). Tüm ağrı reflekslerinin yokluğunu doğrulamak için bir ayak parmağı sıkışma testi yapın.</li>
	<li>İç organları açığa çıkarmak için çöliyotomi yapın (Şekil 4). 3 cm genişliğinde bir kesi yapın (farenin tüm karnının genişliği). NOT: Genişlik, farenin yaşına ve diyetine göre değişecektir.</li>
	<li>Ksifoid süreci sıkıştırarak traksiyonu çeken bir hemostat kullanarak insizyonu genişletin (Şekil 4).</li>
</ol>6. Portal venin kanülasyonu
<ol><li>Portal damarı kaplayan ince ve kalın bağırsakları temizlemek için pamuk uçlu bir aplikatör kullanın. Portal venin kemerinin altına karaciğere proksimal olarak ipek bir sütür yerleştirin (Şekil 4A).</li>
	<li>Anatomik yapıya bağlı olarak, ikinci ipek sütürü karaciğerden inferior mezenterik ven distalinin proksimal veya distalini yerleştirin (Şekil 4A)12,13. Her iki dikiş için de 2-0 dikiş kullanın.</li>
	<li>Dikişler yerine oturduğunda, portal veni 22G kateter14 ile kanüle edin (Şekil 4B). Kateteri yerleştirirken, eğimi sivri tutun. Portal damarına en fazla 15° açı ile girin.</li>
	<li>Kateter tapperinden geçen ilk dikişi bağlayın. Portal ven kanüle edildikten sonra kateteri portal venin dalından 2-3 mm distal olarak ipek dikiş ile sabitleyin (Şekil 4B). NOT: Asistan, kateterin yerinden çıkmasını veya portal venin yırtılmasını önlemek için omuzlarını ve bileklerini yuvarlamalıdır. Her dikiş iki düğüm gerektirir.</li>
	<li>Daha sonra, kateterin alt kısmını ikinci dikişle sabitleyin. Cerrahi asistanın yardımıyla, kateteri portal venin distal kısmına ve çevresindeki dokuya sabitlemek için dikişle bir düğüm bağlayın.</li>
</ol>7. Portal ven kanülasyonu sonrası karaciğer rezeksiyonu
<ol><li>Kateter sabitlendikten sonra, kan ve hava kabarcıklarını temizlemek için kateterin içine 38.1 mm uzunluğunda 27G iğneli 1 mL'lik bir şırınga yerleştirin. NOT: Genellikle kateterden basınçtan kan geri akışı vardır.</li>
	<li>Perfüzyon kolonunu (Şekil 1A) kateterle eşleştirmek için sabit bir stopcock ile 1 mm ID. x 5 mm O.D. silikon tüp kullanın ve tamponun perfüzyonun başlangıcını işaretleyen karaciğere akışına izin verin. Perfüzyonun başlangıcını işaretlemek için bu noktada bir zamanlayıcı başlatın.</li>
	<li>İnferior vena kavaya makas kullanarak bir kesi yaparak artan vasküler basıncı hafifletin.</li>
	<li>Karaciğer rengindeki homojen değişimi pembe / kırmızıdan soluk sarıya doğru gözlemleyerek karaciğerden perfüzyon akışını onaylayın. Akış onaylandıktan sonra, mideyi, ince bağırsağı, kalın bağırsağı ve sağ böbreği çevreleyen dokudan çıkarın.</li>
	<li>Cerrahi asistanın yardımıyla, cerrah karaciğeri rezeke etmek için parietal periton ve torasik dokuyu keserken karaciğeri karın ve göğüs boşluğu etrafında manevra yapın.</li>
	<li>Son olarak, karaciğeri yukarı doğru kaldırın ve karaciğeri makasla yerinde tutan kalan bağ dokularını kesin. Görüş kolaylığı için karaciğeri yavaşça manipüle edin. Karaciğere yapışan kürkleri, NMR tüpü içinde kapsüllemeden önce perfüzyonla durulayarak çıkarın. NOT: Bu prosedürde sadece karaciğer çıkarılır. Diğer tüm organlar hayvanın vücudunda bırakılır. Safra kanalı, deneyin protokolüne göre çıkarılabilir. Bu deney için olmasına rağmen, yerinde bırakıldı.</li>
</ol>8. Karaciğeri kolondan asmak
<ol><li>Cerrah karaciğeri ve tüpü asistana verdiğinde, asistan tüpün kateter ve kolondan bağlantısını keser.</li>
	<li>Kateterin üstünde bir menisküs oluşana kadar kateteri perfüzyonla doldurun. Kateteri karaciğerin asılması ve perfüzyonu için kolona takın. NOT: Kateter üzerindeki perfüzyon boncuğu, karaciğerin bağlanana kadar çalışması için yeterli hacim sağlar. Karaciğere bağlı kateter, kolonun dibine takılarak preslenir.</li>
	<li>Karaciğeri kapsüllemek için 100 cm'lik cam kolona 20 mm'lik bir NMR tüpü vidalayın (Şekil 5). Karaciğer ve portal venin burulmasını önlemek için, NMR tüpünü yavaşça vidalayın. Burulma meydana gelirse ve akış durdurulursa, NMR tüpünü sökün ve yeniden vidalayın. Bu, tıkanıklığı giderecek ve akış geri dönecektir.</li>
	<li>Çalışmanın ayrıntılarına dayanarak karaciğeri 30-60 dakika boyunca perfüze edin. NOT: Zaman, perfüzyon deneyine dayanmaktadır. Bu deney için, metabolik ciro 30 dakika içinde ölçüldü. Karaciğer perfüzyonunun sabit bir duruma ulaşması 10 dakika kadar sürebilir. Kararlı duruma geçme zamanı, inferior vena kava kesildikten ve hepatik akış sağlandıktan sonra başlar.</li>
</ol>9. Akış ölçümü
<ol><li>Bir tartım teknesini üstten yüklemeli bir teraziye yerleştirin ve teraziyi sıfırlayın. Boruyu, NMR'den eferentat çeken makaralı pompadan tartım teknesine yerleştirin ve zamanlayıcıyı çalıştırın.</li>
	<li>Karaciğerin akış hızını veren 1 dakikadan fazla biriken sıvı kütlesini tartın. Tüpü tekrar atık/toplama kabına yerleştirin.</li>
</ol>10. Oksijen Ölçümü
NOT: Oksijen sayacı ölçümleri üreticinin talimatlarına göre ayarlanmıştır15.
<ol><li>Platin kubbeye 20 μL% 50 KCl doymuş çözelti içeren elektrodu yerleştirin ve elektrotun alt platin halkasının etrafına beş adet 10 μL damla yerleştirin.</li>
	<li>Yapıştırıcıyı sigara kağıdından çıkarın. Sigara kağıdının üzerine bir parça politetrafloroetilen membran koyun.</li>
	<li>İki parçayı elektrotun üzerine yerleştirin. Elektrotun üst kısmına küçük bir O-ring takın. Kağıdı, elektrot üzerindeki alt platin halkaya düz bir şekilde yerleştirmek için kesin. NOT: Bazı çıkıntılar kabul edilebilir. Elektrotun gümüşünü örtmek çok önemlidir.</li>
	<li>Daha büyük O-ringi elektrot üzerine yerleştirin. Elektrodu su odasına takın ve elektrodu yerinde tutmak için tabanı sıkın. Su banyosunu açın ve 37 ° C'ye kadar ısınmaya bırakın.</li>
	<li>Açık oksijen ölçer yazılımı. Havaya Doymuş Su > Kalibre Et'e tıklayın. Karıştırıcı hızını 75'e ve sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayın.</li>
	<li>50 mL'lik bir şişeyi yarıya kadar suyla doldurun ve 2 dakika boyunca kuvvetlice çalkalayın. Bu havaya doymuş sudur,% 100 standart olarak kullanın. Oksijen ölçer haznesini ~ 2 mL su ile doldurun ve iki parçalı tıpayı üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Ekranda Tamam'a tıklayın ve sinyalin plato yapmasına izin verin. Sinyal bir platoya ulaştığında, Tamam'ı tıklayın. Sıvıyı odaya atın ve kağıt mendille kurulayın.</li>
	<li>10.6-10.7 arasındaki adımları tekrarlayın, ancak 200 mM sodyum sülfit (% 0 standart) ile. Kalibrasyonu kaydet'e tıklayın. NOT: %0 standardı için kuvvetli bir sarsıntı gerekmez.</li>
	<li>Perfüzyon sırasında iki adet 5 mL şırınga kullanın. Dolaşımdaki perfüzyonat (oksijen girişi) için bir şırınga ve ikincisi NMR tüpünden efferent perfüzyonat (oksijen çıkışı) için.</li>
	<li>Hem giriş hem de çıkış ölçümleri için perfüzyon hazırlarken, her seferinde 3-4 mL çizin. NOT: Bu sütun, karaciğerden akan perfüzyonu geri çekmek için NMR tüpüne erişime izin veren cam boruya sahiptir.</li>
	<li>Dolaşımdaki perfüzyonu ölçün, önce adım 10.6'daki su gibi ve adım 10.7'de atın. Efferent perfüzyon için aynı adımları tekrarlayın.</li>
	<li>Her 10 dakikada bir oksijen ölçümleri yapın.</li>
</ol>

<ol><li>Ragavan, M., McLeod, M. A., Giacalone, A. G., Merritt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+Dihydroxyacetone+Is+a+Sensitive+Probe+of+Hepatic+Gluconeogenic+State%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized Dihydroxyacetone Is a Sensitive Probe of Hepatic Gluconeogenic State.</a> Metabolites. 11 (7), 441(2021).</li>
<li>Lumata, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+%2813%29C+Magnetic+Resonance+and+Its+Use+in+Metabolic+Assessment+of+Cultured+Cells+and+Perfused+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized (13)C Magnetic Resonance and Its Use in Metabolic Assessment of Cultured Cells and Perfused Organs.</a> Methods in Enzymology. 561, 561-573 (2015).</li>
<li>Moreno, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+detection+of+hepatic+gluconeogenic+and+glycogenolytic+states+using+hyperpolarized+%5B2-13C%5D+dihydroxyacetone%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time detection of hepatic gluconeogenic and glycogenolytic states using hyperpolarized [2-13C] dihydroxyacetone.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35859-35867 (2014).</li>
<li>Moreno, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+%CE%B4-%5B1-13C%5D+gluconolactone+as+a+probe+of+the+pentose+phosphate+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+Biomedicine%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized δ-[1-13C] gluconolactone as a probe of the pentose phosphate pathway.</a> NMR in Biomedicine. 30 (6), (2017).</li>
<li>Merritt, M. E., Harrison, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R., Burgess, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flux+through+hepatic+pyruvate+carboxylase+and+phosphoenolpyruvate+carboxykinase+detected+by+hyperpolarized+13C+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Flux through hepatic pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase detected by hyperpolarized 13C magnetic resonance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (47), 19084-19089 (2011).</li>
<li>Bailey, L. E., Ong, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Krebs-Henseleit+solution+as+a+physiological+buffer+in+perfused+and+superfused+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+Methods%22%5BJournal%5D)">Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations.</a> Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).</li>
<li>Kolwicz, S. C. Jr, Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Cardiac+Function+and+Energetics+in+Isolated+Mouse+Hearts+Using+31P+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069(2010).</li>
<li>Hwang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+butylated+hydroxylanisole+against+hydrogen+peroxide-induced+apoptosis+in+primary+cultured+mouse+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Protective effect of butylated hydroxylanisole against hydrogen peroxide-induced apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes.</a> Journal of Veterinary Science. 16 (1), 17-23 (2015).</li>
<li>Bessems, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+rat+liver%3A+standardization+of+a+time-honoured+model%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused rat liver: standardization of a time-honoured model.</a> Laboratory Animals. 40 (3), 236-246 (2006).</li>
<li>Beal, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Small+Animal+Model+of+Ex+Vivo+Normothermic+Liver+Perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541(2018).</li>
<li>Collins, J. B., Song, J., Mahabir, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+and+duration+of+intradermal+mixtures+of+bupivacaine+and+lidocaine+with+epinephrine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Canadian+Journal+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Onset and duration of intradermal mixtures of bupivacaine and lidocaine with epinephrine.</a> The Canadian Journal of Plastic Surgery. 21 (1), 51-53 (2013).</li>
<li>Medical Dictionary. , Merriam-Webster. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.merriam-webster.com/medical">https://www.merriam-webster.com/medical</a> (2022).</li>
<li>Thorpe, D. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThorpe%2C+DR+%22A+Dissection+in+Color%3A+The+Rat+%28and+the+Sheep%27s+Brain%29%22">A Dissection in Color: The Rat (and the Sheep's Brain)</a>. , National Press Books. Palo Alto, CA. (1968).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Hepatocytes+and+Sinusoidal+Endothelial+Cells+from+Mouse+Liver+Perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).</li>
<li>Operations Manual Setup, Installation and Maintenance. , Hansatech Instruments. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf">https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf</a> (2006).</li>
<li>Heparin. , DrugBank Online. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://go.drugbank.com/drugs/DB01109">https://go.drugbank.com/drugs/DB01109</a> (2022).</li>
<li>Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+anesthesia+and+euthanasia+on+metabolomics+of+mammalian+tissues%3A+studies+in+a+C57BL%2F6J+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model.</a> PloS One. 10 (2), 0117232(2015).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler. Fon verenlerin çalışmanın tasarımında hiçbir rolü yoktu; verilerin toplanmasında, analizinde veya yorumlanmasında; yazının yazımında; veya sonuçları yayınlama kararında.

Bu cerrahi prosedür zordur ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kapsamlı bir uygulama gerektirir. İzofluran ve taşıyıcı gaz, hayvanın yaşayabilirliğini cerrahi prosedürün mümkün olduğunca büyük bir kısmı boyunca korumak için gerektiği gibi ayarlanmalıdır. Çevre, günün saati, yaş, kilo ve diğer bazı faktörler anesteziyi etkileyecektir. Kilo, diyet, farelerin suşu ve yaş, yağ birikimi portal venin görselleştirilmesine müdahale edebileceğinden ameliyatı etkileyebilir. Pençeleri bantlarken, boyunda boğulmaya neden ola...

Ex vivo perfüzyonlar hepatik metabolizma çalışmasında çok önemlidir ve portal ven yoluyla perfüzyon bu çalışmalar için standarttır. Hepatik metabolizmayı izole olarak incelemek için, diğer organlardaki metabolizmadan (yani tüm vücut metabolizması) kaynaklanan komplikasyonları önlemek ve hormon mevcudiyeti (insülin, glukagon vb.) üzerinde kontrol sağlamak için karaciğer vücuttan rezeke edilmelidir. Bu yaklaşım, diyabet, NAFLD ve NASH gibi hastalıkların hepatik metabolizma üzerindeki etkilerini ve ilaç etki mekanizmalarını anlamak için gerekli olabilir. Bu makale hepatik rezeksiyon ve perfüzyon için bir rehber niteliğindedir. Bu metabolik karaciğer çalışmalarını yeterli titizlik ve tekrarlanabilirlik ile gerçekleştirmek için kolaylaştırılmış bir prosedür geliştirdik. Ameliyat doğru yapılmazsa, elde edilen metabolik verilerde belirgin değişkenlik vardır. Literatür 1,2,3,4,5'te tanımlandığı gibi, nükleer manyetik rezonans (NMR) spektrometresinde in situ metabolik çalışmalar bağlamında portal ven kateterizasyonu ve karaciğer rezeksiyonu yapmak için organize bir yöntem tanımladık.
Şu anda, bir NMR içinde bir cam sütun kullanılarak ex vivo hepatik perfüzyonu tanımlayan bir literatür yoktur. Ayrıca, prosedürün fare karaciğeri ile nasıl gerçekleştirileceğine dair net bir örnek sunan, özellikle portal venin nasıl kateterize edileceğini, bir karaciğerin nasıl rezeke edileceğini, aktarılacağını ve karaciğerin bir cam sütuna nasıl asılacağını gösteren bir video veya metin yayını da yoktur. Genetiği değiştirilmiş fare, karaciğer metabolizmasını incelemek için her yerde kullanıldığından, bu tam bir açıklamayı hak eden önemli bir prosedürdür. Karaciğer perfüzyon ameliyatları yeni değildir, ancak bu makale, bu prosedürle ilgilenen herkese yardımcı olmak için bu makalede açıklanan teknik mükemmelliği gösteren bir video eşliğinde altın standart bir yöntemdir. Burada sunulan yöntem, hastalık modellerinde metabolitlerin işlevini ve döngüsünü tespit etmek için gerçek zamanlı metabolizmaya en iyi şekilde uygulanacaktır.
Bu yöntem, karaciğerin bir NMR tüpü içinde perfüzyonla kapsüllenmiş kanülün dibinde asılı kalmasını sağlayan 100 cm'lik su ceketli bir cam sütun kullanır. Cam ceket içindeki ısıtılmış su, perfüzyon sıcaklığını kontrol etmek için kullanılır. İnce tabakalı bir oksijenatör, pH kontrolü için% 95 / % 5 O 2 / CO2 ile basınçlandırılır. Üç ayrı pompa kullanılarak, karaciğere sabit basınç sağlayan perfüzyon kolon yüksekliği ayarlanır. Akış hızları, sabit basınç uygulamasının ötesinde kontrol edilmez (Şekil 1). Karaciğerin uygun şekilde çalıştığını doğrulamak için, oksijen ölçümleri akış hızları ile birlikte alınır. Ellerimizde, bu ön koşullar kümesi, karaciğer metabolik fonksiyonunun değerlendirilmesi için oldukça tekrarlanabilir NMR deneylerine yol açmaktadır.

<table><tbody><tr><td>1 mL Luer-Lock Tek Kullanımlık Steril Tek Kullanımlık Şırınga</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Spesifik Olmayan Marka</td></tr><tr><td>100 cm Su Ceketli Cam Sütun</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Özel Yapım</td></tr><tr><td>2-0 İpek Sütür</td><td>Braintree Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>22 Gauge Catherter 1 inç. Güvenlik Olmadan</td><td>Terumo</td><td>SRFF2225</td><td></td></tr><tr><td>23 G 0,75 inç. Hipodemerik İğneler</td><td>Exel International</td><td>26407</td><td></td></tr><tr><td>27 G 1.5 inç. Hipodemerik İğneler</td><td>Exel International</td><td>26426</td><td></td></tr><tr><td>4x4 inç. Cerrahi Platform</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Özel Yapım</td></tr><tr><td>%70 Alkollü Mendil</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Spesifik Olmayan Marka</td></tr><tr><td>Sirkülasyonlu Su Banyosu</td><td>MS Lauda</td><td>N/A</td><td>Model artık üretilmiyor</td></tr><tr><td>Pamuk Uçlu Aplikatör</td><td>N/A</td><td>N/A Spesifik</td><td>Olmayan Marka</td></tr><tr><td>Hassas Çalışma Makası; Düz; keskin-keskin; 30 mm bıçak uzunluğu; 4 3/4 "</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Forseps</td><td>İnce Bilimsel Aletler</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 - İnce Forseps</td><td>İnce Bilimsel Aletler</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>Kanama Durdurucular</td><td>İnce Bilimsel Aletler</td><td>13015-14</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodyum Enjekte Edilebilir 1000 birim / mL</td><td>RX Jenerikler</td><td>71288-0402-02</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Patterson Veteriner</td><td>14043-0704-06</td><td></td></tr><tr><td>Lidokain HCl %2</td> <td>VEDCO Inc.</td><td>50989-0417-12</td><td></td></tr><tr><td>Membran İnce Tabakalı Oksijenatör</td><td>Radnoti</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum Makas; Kıvrımlı; Kör; 27 mm Bıçak Boyu; 5"</td> <td>Roboz</td><td>RS-6013</td><td></td></tr><tr><td>Oksijen Ölçüm Sistemi</td><td>Hanstech Instruments Ltd.</td><td>N / A Tuzlu Ürün</td>% 0.9 Çözelti <td></td></tr><tr><td></td><td>N / A</td><td>N / A Salin</td><td>laboratuvar Ölçeğinde yapılır</td></tr><tr><td></td><td>N / A</td><td>N / A Spesifik</td><td>olmayan Marka</td></tr><tr><td>&nbsp; Değişken Hızlı Analog Konsol Pompa Sistemleri</td><td>Cole Palmer</td><td>N/A</td><td>Modelleri uygulamaya göre özeldir</td></tr><tr><td>Tartı botları</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Spesifik Olmayan Marka</td></tr></tbody></table>

eski vivo farede portal damarından hepatik perfüzyon

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Diyabet, pre-diyabet, alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) ve alkolsüz steatohepatit (NASH) gibi metabolik hastalıklar giderek yaygınlaşmaktadır. Ex vivo karaciğer perfüzyonları, titizlikle kontrol edilebilen beslenme koşullarında nükleer manyetik rezonans (NMR) kullanarak karaciğer metabolizmasının kapsamlı bir analizine izin verir. Siliko simülasyonları, hormon eylemlerini ve farmasötik müdahalenin etkilerini değerlendirmenin birincil teorik bir aracı olmaya devam ettiğinden, perfüze edilmiş karaciğer, hepatik metabolizmayı anlamak için en değerli test yataklarından biri olmaya devam etmektedir. Bu çalışmalar hepatik fizyolojiye ilişkin temel anlayışlara rehberlik ettiğinden, sonuçlar doğru ve tekrarlanabilir olmalıdır. Ex vivo hepatik perfüzyonun tekrarlanabilirliğinde en büyük faktör cerrahinin kalitesidir. Bu nedenle, in situ NMR deneyleri bağlamında ex vivo fare karaciğer perfüzyonlarını gerçekleştirmek için organize ve kolaylaştırılmış bir yöntem sunduk. Ayrıca benzersiz bir uygulamayı tanımlıyoruz ve bu çalışmalarda karşılaşılan ortak sorunları tartışıyoruz. Genel amaç, in situ NMR deneyleri bağlamında hepatik rezeksiyonlarda ve perfüzyonlarda tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için altın standart olarak gördüğümüz birkaç yıl boyunca rafine ettiğimiz bir tekniğe karmaşık olmayan bir rehber sağlamaktır. Mıknatıs için alanın merkezine olan mesafe ve NMR deneyi sırasında dokunun müdahaleye erişilememesi, yöntemlerimizi yeni kılmaktadır.

Karaciğer fonksiyonu öncelikle oksijen tüketimi ve akış hızı ile değerlendirilir. 4-8 mL/dak akış hızı ve 1 μmol/min.g oksijen tüketimi tipiktir. Bu önlemler, belirli deneysel koşullara ve biyolojik farklılıklara bağlı olarak değişecektir.
Kullanılan izofluran'ın tam miktarı, kullanılan anestezi sisteminin tipine, farenin ortamına ve yaşına / ağırlığına bağlı olacaktır. Ameliyat sırasında, izofluran ve dağıtım gazı değişmez, ancak cerrahi alanın özelliklerine bağlı olarak bazı değişiklikler ge...

Protokol, portal ven perfüzyonu yoluyla metabolik çalışmalar için sağlam bir fare karaciğerini rezeke etmenin basit bir yöntemini açıklar.

Eski Vivo Farede Portal Damarından Hepatik Perfüzyon

Metabolic diseases such as diabetes, pre-diabetes, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and nonalcoholic steatohepatitis (NASH) are becoming ...

Bu video, metabolik karaciğer çalışmalarını yeterli titizlik ve tekrarlanabilirlikle gerçekleştirmek için geliştirilen ve vivo perfüzyon çalışmaları için hepatik rezeksiyon yapmak için bir rehber görevi görebilecek aerodinamik bir prosedürü göstermektedir. Bu teknik, hastalık modellerinde ciro metabolitlerinde işlevi tespit etmek için gerçek zamanlı metabolizmaya en iyi şekilde uygulanır. Perfüzyon, karaciğer için mevcut olan besin maddelerinin ve hormonların hassas kontrolünü sağlar.Teknik tedaviye yönelik olmamasına rağmen, karaciğer perfüzyonları diyabet, NAFLD ve NASH gibi hastalıkların etiyolojisini ve hepatik metabolizma üzerindeki etkisini anlamada etkili olabilir. Yeni farmasötikler geliştikçe, hepatik merkezi enerji metabolizmasını değerlendirmek için yöntemler gerekli hale gelir. Bu yöntem, kanserler de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların modelleriyle ve hastalığın ilerlemesinin birkaç farklı aşamasında kullanılabilir.Başlangıç olarak, anestezi indüksiyonundan sonra farenin burnunu bir burun konisine yerleştirin ve pençelerini bantlayın. Lidokaini, anterior iliak krest bölgesinde bilateral olarak deri altı enjeksiyonu yoluyla uygulayın. Tüm ağrı reflekslerinin yokluğu

ex-vivo-hepatic-perfusion-through-the-portal-vein-in-mouse

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu videoda, karaciğer hücrelerini izole etmeden önce kollajenaz çözeltisi kullanılarak portal ven yoluyla fare karaciğeri perfüzyonu için bir prosedür açıklanmaktadır.

İn Vivo Murin Karaciğer Perfüzyonu: Kemirgen Karaciğerini Portal Ven Yoluyla Çözelti ile İnfüzyon Etmek İçin Bir Yöntem

Kupffer hücreleri olarak adlandırılan karaciğer makrofajları, dolaşımdaki nanopartiküllerin yakalanmasından sorumludur. Burada Kupffer hücre izolasyonu için yüksek hücre saflığı ve verimine sahip bir yöntemi açıklıyoruz. Modifiye LDH testi, Kupffer hücrelerinde karbon nanotüplerin neden olduğu toksisiteyi ölçmek için burada kullanılır.

Nanoparçacık Toksisite Testi için Kupffer hücre izolasyonu

Bu iletişim kuralının amacı yüksek canlılık ve yüksek verim tetkikine ve sinüsoidal endotel hücreleri karaciğer elde etmektir. Bu bir tür IV collagenase eriyik yolu ile portal ven, hepatositlerin ve sinüsoidal endotel hücreleri elde etmek için farklı aralıklarla tarafından takip ile karaciğer Ventriküler tarafından gerçekleştirilir.

Arıtma tetkikine ve fare karaciğer sinüsoidal endotel hücrelerinden perfüzyon

Önemli karaciğer donör kan olmadığını ve karaciğer bağış için ölçüt genişletilmiştir. Normothermic ex vivo karaciğer perfüzyon (NEVLP) değerlendirmek ve organ işlevini değiştirmek için geliştirilmiştir. Bu çalışma NEVLP bir fare modeli gösterir ve karaciğer koruma yaralanma azaltmak için pegile-katalaz, yeteneğini sınar.

Ex Vivo Normothermic karaciğer perfüzyon küçük bir hayvan Model

Bir protokol mesane, prostat, cinsel organlar, kemik, kas ve ayak derisi de dahil olmak üzere fare alt vücut, yerinde perfüzyon için açıklanmıştır.

Farelerde Alt Karın Organları nın ve Arka Ekstremitelerin Situ Kapalı Devre Perfüzyonunun Oluşturulması

Yağ asidi β-oksidasyonu, hepatositler de dahil olmak üzere birçok farklı hücre tipinde enerji üretmekten sorumlu önemli bir metabolik yoldur. Burada, 14C etiketli palmitik asit kullanarak taze izole edilmiş primer hepatositlerde yağ asidi β-oksidasyonunu ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Yeni İzole Edilmiş Fare Hepatositlerinin Süspansiyonunda Yağ Asidi β-Oksidasyonunun Ölçülmesi

Mevcut protokol, alkolsüz steatohepatit (NASH) sırasında hücre dışı matriks (ECM) yeniden şekillenmesinin dinamiklerini görselleştirmek için güvenilir bir platform oluşturmak üzere karaciğer in situ perfüzyon / desellülarizasyon ve iki foton mikroskopi yöntemlerini optimize etmektedir.

Alkolsüz Steatohepatitin Bir Fare Modelinde Karaciğer Hücre Dışı Matriksin 3D Görüntülenmesi

Lipid yüklü hepatositler karaciğer rejenerasyonuna özgüdür, ancak genellikle yoğunluk gradyan santrifüjleme ile kaybolurlar. Burada, steatotik hepatositleri tutan ve farelerde parsiyel hepatektomi sonrası rejenere hepatositlerin temsili popülasyonlarını veren optimize edilmiş bir hücre izolasyon protokolü sunuyoruz.

Farelerde Parsiyel Hepatektomi Sonrası Rejenere Hepatositlerin İzolasyonu

Fare karaciğerleri için normotermik ex vivo karaciğer perfüzyonu (NEVLP) sistemi oluşturuldu. Bu sistem mikrocerrahide deneyim gerektirir ancak tekrarlanabilir perfüzyon sonuçlarına izin verir. Fare karaciğerlerini kullanma yeteneği, yeni perfüzyon katkı maddelerini tanımlamak için moleküler yolakların araştırılmasını kolaylaştırır ve organ onarımına odaklanan deneylerin yürütülmesini sağlar.

Normothermic Ex Vivo Karaciğer Makinesi Farede Perfüzyon

Burada, karaciğer mimarisini bozmadan, ancak karaciğer dışı faktörlerin yokluğunda karaciğer metabolizmasının akut ve doğrudan regülasyonunu incelemek için fare karaciğerinin yerinde perfüzyonu için sağlam bir yöntem sunuyoruz.

Hepatik Glikoz Üretimi, Ürejenez ve Lipoliz, Perfüze Fare Karaciğer Modeli Kullanılarak Ölçüldü

Burada, fare gözünün ön kamarasına aşılanmış karaciğer sferoidlerinin noninvaziv in vivo görüntülemesine izin veren bir platformu tarif ediyoruz. İş akışı, birincil karaciğer hücrelerinden sferoidlerin üretilmesinden fare gözüne transplantasyona ve konfokal mikroskopi ile hücresel çözünürlükte in vivo görüntülemeye kadar uzanır.

Fare gözünün ön kamarasına aşılanmış karaciğer sferoidlerinin in vivo görüntülenmesi

Keşfedin portal ven perfüzyonu tekniği ile fare karaciğerinde metabolik çalışmalar yapmayı. Bu yöntem diyabet, NAFLD ve NASH gibi hastalık modellerinde karaciğer metabolizmasını gerçek zamanlı izlemeyi sağlar.

Eski Vivo Farede Portal Damarından Hepatik Perfüzyon

Daha fazla video keşfet