Yaşlı Yetişkinlerin Plazmasındaki Fenolik Metabolitlerin Kütle Spektrometri Analizine Bağlanan Yarı Hedefli Ultra Yüksek Performanslı Kromatografi

Bu protokolün amacı, plazmadaki fenolik metabolitleri yarı hedefli bir UPLC-MS / MS yöntemiyle tespit etmektir. Plazma proteinleri, UPLC ekipmanına enjeksiyondan önce etanol ve konsantre numunelerle çökeltildi ve mobil fazda yeniden askıya alındı. Bileşikler, metabolomik, yazılım ve farklı ücretsiz çevrimiçi veritabanları için PCDL yöneticisi kullanılarak laboratuvarda bir araya getirilen yarı hedefli bir kütüphane kullanılarak tanımlandı.

Brosimum alicastrum tohum unu ile formüle edilmiş bir çörek ve içecek formülü ile beslenme müdahalesi uyguladık. Girişim sonunda katılımcıların beslenme ve sarkopenik durumları iyileştirildi ve plazmanın toplam fenolik içeriği arttırıldı. Ancak hangi fenolik bileşiklerin emildiğini ve olumlu etkiye katkıda bulunduğunu tanımlamamız gerekir.

Bu antioksidanlar bakımından zengin gıdaların tüketiminden sonra emilen fenolik bileşiklerin tanımlanması ve miktarının belirlenmesi zor bir iştir, ancak bu fitokimyasalların biyolojik aktivitesini göstermek için gereklidir. Çoğu fenolik bileşenin biyoyararlanımı düşüktür, dahası% 5'inden azı plazmaya yapısal dönüşüm olmadan girer. Çoğu metilasyon, sülfonasyon veya glukuronidasyon gibi çeşitli biyotransformasyondan geçer.

Çok çeşitli çalışmalar, biyoakışkanlardaki en yaygın metabolitleri UPLC-MS ve UPLC-MS / MS ile tanımlamıştır. Bununla birlikte, bakteri metabolitinin büyük bir kısmı, tam bilgilerini içeren veritabanlarının eksikliğinden kaynaklanmamaktadır. Metabolit tanımlama, metabolit standartlarının maliyeti ve ticari kullanılabilirliği nedeniyle karmaşıktır.

Bu nedenle, en iyi strateji hedefsiz veya yarı hedefli MS / MS metabolit analizi olabilir. Bu analiz, moleküler özellik bilgisinin, kütle-yük oranı monoizotopik tam kütlenin, izotopik dağılımın ve parçalanma paterninin kullanımına dayanır. Kimyasal kimliği belirlemek ve polifenol bakımından zengin diyetlerin tüketiminden sonra biyosıvılarda tanımlanan polifenol metabolitlerini içeren ücretsiz çevrimiçi veritabanlarıyla karşılaştırmak.

Bu çalışmada, beslenme müdahalesinde yer alan bir grup yaşlı kişinin plazma örneklerini analiz etmek için yarı hedefli bir UPLC-MS / MS yöntemi geliştirdik. Plazma örneklerini analize kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Plazma örneklerini oda sıcaklığında 15 dakika veya 37 santigrat derecede beş dakika boyunca defrost edin.

200 mikrolitre plazma örneğini iki milimetrelik bir mikrotüpe yerleştirin ve 1000 mikrolitre saf etanol ile karıştırın. 30 saniye boyunca vorteks plazma örneği. Beş dakika boyunca 6.580 santrifüj kuvvetinde santrifüj numunesi.

Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı bir mikropipet veya Pasteur pipet ile toplayın ve yeni bir mikrotüpe yerleştirin. Süper natantı rezerve et. Bir peleti 1000 mikrolitre saf etanol ile karıştırın, 30 saniye boyunca köşeye koyun ve ardından aynı koşullarda santrifüj yapın.

Süpernatantı toplayın ve ilk süpernatan ile karıştırın. 135 psi'de saf azot kullanarak etanol'ü numuneden çıkarın. Numune kaybını önlemek için iğneyi mikrotüpün üstünden bir santimetre uzakta tutun ve numune kuruyana kadar yıkayın.

Kuru numuneleri 100 mikrolitrede bir tanesinde askıya almak, bir asetonitril karışımını suyla karıştırmaktır. 45 mikro naylon şırınga membranından doğrudan bir HPLC şişesi mikro ekine filtreleyin C 18 ters fazlı kolonla donatılmış UPLC'ye üç mikrolitre numune enjekte edin. Otomatik örnekleyici sıcaklığını 20 Santigrat ve kolon termostatını 25 Santigrat olarak ayarlayın.

Her numuneyi üçlü olarak enjekte edin. Suda çözücü A olarak% 0.1 formik asit ve% 100 asetonitril çözücü B olarak kullanın.Akış hızını dakikada 0.4 milimetreye ve bir gradyan programına aşağıdaki gibi ayarlayın, sıfır ila bir dakika% 10 B, bir ila dört dakika% 30 B, dört ila altı dakika% 38 B, altı ila sekiz dakika% 60B, sekiz ila 8.5 dakika% 60B, 8,5 ila dokuz dakika %10 B. Kütle spektrometresini negatif mod iyonizasyonuna ayarlayın.

Azotu 300 santigrat derecede kurutma gazı ve dakikada 13 litrede akış hızı olarak kullanın. Nebülizör basıncını 30 psi'ye ayarlayın. 4.000 voltta kılcal bir voltaj, 175 voltta parçalayıcı voltaj ve 65 voltta Skimmer voltajı ayarlayın.

100 ila 1100 m/z arasındaki kütleleri tarayın ve kütle spektrometrisi için 50 ila 1000 m/z arasındaki kütleleri tarayın. Veri alımını Otomatik MS/MS moduna ayarlayın. Aşağıdaki referans kütlesini kullanın, 119.036 ve 966.0007.

Fenolik bileşikleri, fenolik metabolitleri ve bilimsel literatürde ilgi çeken diğer bileşikleri araştırın. UPLC sisteminde bulunan veritabanı yönetim yazılımını açın. Dosya'yı ve ardından yeni kişisel veritabanı bileşik kitaplığı PCDL'yi seçin.

Ardından yeni PCDL oluştur'u seçin. PCDL LC/MS metabolomik türünü seçin. PCDL için adı ayarlayın.

Ardından oluştur'u seçin. Araç çubuğunda PCDL'yi ve ardından düzenlemeye izin ver seçeneğini belirleyin. Ardından bileşikleri bul düğmesine tıklayın.

Bileşikler kişisel kütüphaneye iki şekilde eklenebilir, ilk olarak enstrümanın genel kütüphanesinden kopyalanarak. Bunu yapmak için, şu ana kadar veri yönetimine dahil edilen mevcut veritabanlarını açın. Bileşikleri bul düğmesine tıklayın.

Tek arama seçeneğinde, ilgilenilen bileşiği bulmak için bileşik arama ölçütlerini girin. Bileşik sonuçlar tablosunda, faiz bileşiğini seçin. Birden fazla bileşik seçmek için, ilk bileşiği tıklatın, sonra CTRL tuşunu basılı tutun ve ardından ilgilenilen her bir bileşiği tıklatın.

Ardından, vurgulanan tüm bileşiklere sağ tıklayın ve PCDL'ye Ekle'yi seçin. Yeni pencerede, özelleştirilmiş kişisel veritabanı dosyasını arayın ve seçin. Kutuyu işaretleyin, varsa bileşik için spektrum içerir.

Ekle düğmesini tıklatın. Yeni iletişim kutusunda, eklenen yeni bileşikleri kontrol etmek için Evet'i seçin. İlgilendiğiniz daha fazla bileşik aramaya devam etmek için Hayır'ı seçin.

İkincisi, yeni bileşikler cihazın genel kütüphanesinde mevcut değilse manuel olarak eklenebilir. Bu açık için, özel kişisel veritabanı. Açıldıktan sonra PCDL'yi ve ardından düzenlemeye izin ver seçeneğini seçin.

Bileşikleri düzenle seçeneğini belirleyin. Yeni ekle düğmesini tıklayın. Pencerenin üst kısmında, yeni bileşiğin bilgilerini tamamlayın.

Formülü, adı, IUPAC adını, CAS numarasını, Chemspider ID'yi ve diğer tanımlayıcıları doldurun. Ücretsiz çevrimiçi kütüphanelerde bulunan bilgileri kullanarak, Chemspider, PubChem ve Phenol Explorer, yeni ilgi alanı bileşiğinin bilgilerini doldurmak için. İşiniz bittiğinde, yeni bileşik bilgileri özel kişisel veritabanına kaydetmek için Yeni olarak kaydet düğmesine tıklayın.

Özel kişisel veritabanını tamamlamak için işlemi ilgilendiğiniz tüm bileşiklerle tekrarlayın. Fenolik bileşikleri ve fenolik metabolitleri tanımlamak için cihazın kalitatif yönetici yazılımını kullanın. Örnek dosyayı açın.

Kromatogram panelinde, Kromatogramları tanımla'yı seçin ve toplam iyon kromatogramı TIC'yi, MS EIC'nin ekstrakte edilmiş iyon kromatogramını ve MS / MS'nin EIC'sini çıkarın. Bileşikleri bul panelinde, formüle göre bul seçeneklerini belirleyin.

Yeni pencerede, formül kaynağını ve ardından veritabanı eğik çizgi kitaplığı seçeneğini seçin. Daha önce oluşturulmuş kişisel veritabanını bulun ve aç'a tıklayın. Formül eşleştirme seçeneğini belirleyin ve milyonda beş parçalık bir kütle eşleşme toleransı (ppm) ayarlayın.

Negatif iyonlar seçeneğini belirleyin ve yalnızca eksi H iletişim kutusunu seçin. Sonuç seçeneğinde, EIC ayıklama işlemini işaretleyin, temizlenmiş spektrumu ayıklayın, ham spektrumu ayıklayın ve yapılandırılmış iletişim kutuları ekleyin. Sonuç filtreleri seçeneğini belirleyin.

Ve sonra puan ise uyar, sonra skor eşleşmesini% 80 olarak ayarlayınSonra skor ise eşleşmiyor işareti yapın ve puanı% 75 olarak ayarlayınArdından, numunede ilgilenilen bileşikleri tanımlamak için formüle göre bileşikleri bul'a tıklayın. Plazma örneklerinin yarı hedefli UPLC MS / MS analizi yoluyla fenolik metabolitlerin tanımlanması için adım adım süreç bir sonraki şekilde gösterilmiştir. İlk olarak, toplam iyon-kromatogram, ücretsiz çevrimiçi veritabanlarından elde edilen 645 fenolik bileşiği ve metabolitlerini içeren, kendi kendine oluşturulan bir PCDL veritabanı kullanılarak elde edildi.

Daha sonra, ekstrakte edilen iyon-kromatogram ve parçalanma paterni veya beş ppm'den daha az kütleye sahip iyonlar, eşleşme toleransı elde edildi. Son olarak, tespit edilen piklerin izotopik dağılımı teorik bileşiklerinkiyle karşılaştırıldı. Bu analizden, plazma örneklerinde toplam 25 fenolik bileşik ve metabolit tanımlanmıştır.

Tasarım yönteminin absorbe fenolik bileşiklerin veya metabolitlerinin tanımlanmasındaki etkinliğini değerlendirmek için, 30 günlük müdahaleden önce ve sonra elde edilen çalışma katılımcılarının beş örneği analiz edilmiştir. Her bileşiğin nispi bolluğu, tedaviden önce AUC ile tedaviden sonra eğrinin altındaki alanın bölünmesiyle hesaplandı. Tablo dördüncü, brosimum alicastrum unu içeren gıdaların 30 günlük tüketiminden sonra plazmada bir artış gösteren 12 fenol bileşiğinin listesini göstermektedir.

Fenilasetik asit sadece tedaviden sonra sürekli olarak daha yüksek konsantrasyonda bulunan metabolitti. Glisitin, glikozile izoflavon ve üç hidroksifenilvalerik asit, beş numunenin üçünde artmış, ancak diğer ikisinde azalmıştır. Bir lignan olan Gomisin M2, beş numunenin üçünde ancak beslenme müdahalesinden sonra tespit edildi.

Diğer fenolik bileşikler ve metabolitler sadece bir numunede ve sadece tedaviden sonra bulundu. Mevcut makalede geliştirilen yöntem, çoğu yerde yaratıldığı amaç için çok uygun olduğunu göstermektedir. Tedavi başına örnek basit ve etkiliydi.

Fenolik metabolitlerin UPLC ayrımı ve yarı hedefli MS/MS tanımlaması sağlandı.