Murine Oviduct'un Mikroseksiyonu ve Ayrışması: Bireysel Segment Tanımlama ve Tek Hücre İzolasyonu
November 4th, 2021
RNA bütünlüğünü korurken tek tek segmentlerin toplanmasına izin veren fare yumurta kanalının mikro dezenfeksiyonu için bir yöntem sunulmuştur. Ayrıca enzymatik olmayan ovidüktal hücre ayrışması prosedürü açıklanmıştır. Yöntemler fonksiyonel olarak farklı ovidüktal segmentlerin ve ayrışmış ovidüktal hücrelerin sonraki gen ve protein analizi için uygundur.
Farklı yumurta kanalı segmentleri farklı fizyolojik fonksiyonlara sahiptir ve patolojik değişime farklı olarak duyarlıdır. Çok küçük bir fare yumurta kanalındaki farklı segmentlerin tanımlanması, doku ayrışması ile iyi ayırt edilmiş hücrelerin iyi bir veriminin üretilmesi gibi zordur. Bu videoda, fare yumurtalığının nasıl çözüleceğini, farklı segmentlerin tek tek analiz edilebilmesi için nasıl tanınacağını ve son olarak, farklılaştırılmış ayrışmış hücrelerin nispeten yüksek veriminin nasıl üretileceğini göstereceğiz.
Ampullaya özgü ortamın daha iyi anlaşılması in vitro fertilizasyon tekniklerini geliştirebilir. Ayrıca, infundibulum'u diğer segmentlerle karşılaştırarak, infundibulumun kötü huylu dönüşüm eğilimini daha iyi anlayabiliriz. Tek hücreli ayrışma prosedürü stromal ve epitel hücrelerini yumurta kanalından kurtarır.
Yöntemimiz ayrıca bağışıklık, düz kas ve epitel hücre katkılarını fizyolojiye ve yumurta kanalı patolojisine ayrı ayrı analiz etme fırsatları sağlar. Diseksiyon mikroskobu altında çalışmak ilk başta zor olabilir. Aletlerinizin oviduct mikrodiseksiyon için yeterli olduğundan emin olmak için rahim gibi daha büyük bir tüple pratik yapmanızı tavsiye ederim.
Petri kabına yapışkanlı bir diş cilası parçası yapıştırarak ve kurumasını izin vererek başlayın. Daha sonra yemeği% 70 etanol ile sterilize edin. Yüzey artık diseksiyona hazır.
Diseksiyona hazır olduğunuzda, diş balmumunu içeren Petri kabını diseksiyon mikroskobu altında soğuk platformda hareketsiz hale getirin. Hayvanın ventral yüzeyini% 70 etanol ile dezenfekte edin. Daha sonra steril diseksiyon makası ile karın ve pelvik boşluğu açın.
Dorsal bihornal uterusun yerini bulmak için gastrointestinal sistemi bir tarafa hareket ettinin. Böbreğin hemen altındaki rahim yağ yastığında zarflanmış her bir yumurtalığı ve yumurtalığı bulmak için her bir rahim boynuzu rostral olarak takip edin. Daha sonra hem yumurtalıklarla birlikte lateral oviducts hem de diseksiyon makası kullanılarak hala bağlı distal rahim boynuzu bir kısmını kesin.
Her bir lateral rahim boynuzu, hala sarmal yumurtalığa ve yumurtalığa bağlı olan boynuzun yaklaşık bir ila iki santimetresi ile kesin. Dokuyu hemen iki mililitre soğuk diseksiyon ortamına batırın, ardından diseksiyon için dokuyu sabitlemek için steril 25 kalibrelik bir iğne ile rahim dokusunu diş mumumuna yapıştırın. Yumurta kanalını net bir şekilde görselleştirmek için yumurtalık yağ yastığını ve bağ dokusunu temizleyin ve parçalara ayırın.
Bir ila iki damla steril% 1 toluidin mavi boya çözeltisi dağıtmak ve 30 saniye ila bir dakika boyunca kuluçkaya yatmak için bir mililitre şırınna kullanın. Soğuk DPBS ile durulayın ve ardından tüm sıvıyı çıkarın. Yumurtalığı sarmal yumurtalıktan hafifçe çekin.
Tubal dokudan ödün vermeden yumurtalığı yumurtalıktan çıkarmak için geniş bağdaki bursal zarı kesin. Rahim tubal kavşağına yanal bulunan yumurta kanalının distal fimbrial ucunu bulun. Tüpü yavaşça çekin ve yumurta kanalını aşamak için yaylı mikro makasla mezosalpinkste kesin.
Infundibular bölgeyi üretmek için tüpü kesin. Daha sonra ampullery bölgesini iki ve üç dönüş arasında keserek tüketime edin. Son olarak, kalan kısmı istimik bölge olan rahim tubal kavşağına kesin.
Parçalanmış doku segmentlerini sıvı nitrojene hemen dondurun ve ardından RNA izolasyonu için dokuya 200 mikrolitre soğuk RNA ekstraksiyon reaktifi ve bire bir homojenizasyon boncuk karışımı ekleyin. Fimbrial bölgeden başlayarak, tüpü yaylı makasla uzunlamasına kesin ve luminal epitelleri açığa çıkarmak için kaldıraç olarak epips kullanın. Yarık açık kısımları ve kalan yumurta kanalını yaklaşık bir ila iki milimetrelik parçalara ayırın.
Daha sonra dokuya beş mililitre sıcak enzimatik olmayan ayrışma tamponu ekleyin ve 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Occludin, nüklei ve asetilasyonlu tubulin için pozitif bir hücre kümesinin floresan ve faz kontrast görüntüleri burada gösterilmiştir. Kırmızı occludin, mavi çekirdekleri ve yeşil asetillenmiş tübulin anlamına geliyor.
Siliated apikal kenarlık protokol boyunca bozulmadan kalır ve tek hücrelere daha fazla sindirime dayanır. Bu temsili görüntülerde birleştirilmiş, kırmızı, mavi, faz kontrastı ve yeşil kanallar gösterilir. Kısa bir pronaz inkübasyonundan sonra, hücrelerin çoğunluğu tektir.
Propidium iyodür boyama Brightfield, kırmızı kanal PI pozitif ve birleştirmede yaklaşık% 93 canlılık gösterir. Birleştirmedeki içe, tek bir ayrışmış hücrede bozulmamış bir sınır gösterir. Bu tür hücreler aktif olarak cilia'yı dövüyor.
Tüm RNA mikrovolum spektrofotometre ve biyoanalyzer tarafından verim ve kalite için değerlendirildi. Sonuçlar, bu yöntemin, aşağı akış tahlilleri için uygun verim için iki hayvandan havuzlamanın gerekli olabileceği infundibular örnekler dışında segment başına 800 ila 1.200 nanogram RNA verdiğini göstermektedir. Infundibulum için sunulan sonuçlar, toplam dört infundibular bölgeden olmak üzere iki hayvandan toplanmaktadır.
Bu protokol, bir mikrovolum spektrofotometresi ve bir biyoanalyzer ile analiz edilen saf RNA'yı başarıyla elde eder. Örnekler, saf RNA nükleotid türlerinin tipik bir örneği olan 1,8 ila 2 arasında 260 ila 280 nanometre emilim oranına sahiptir. Numunelerin biyoanalizesi, aşağı akış ekspresyözü ve sıralama analizi için uygun olan yedinin üzerinde değerlendirilen RNA bütünlük sayısı ile yüksek RNA bütünlüğü gösterdi.
Tubal sistemi diseksiyon platformuna yapıştırmak için uterus boynuzundan bir ila iki santimetre tutmayı unutmayın. Ek olarak, toluidin mavi boyasının kullanımı, yumurta kanalının hızlı bir şekilde geri tepmesine yardımcı olur. Ne kadar hızlı geri tepme, koruma ve en az RNA bozulması o kadar iyi olur.
Bu yöntem, bireysel segment dizilimine izin vererek RNA dizilimi için uygun kalitede RNA elde etmek için yeterlidir. Hücre ayrışması, daha hassas bir segment ve hücre analizi sağlayan tek hücreli sıralama veya akış sitometrisi için uygundur. Yöntem, segment veya tek hücre düzeyindeki farklılıkları maskeleyen tüm tüp analizinin ötesine geçmesine yardımcı olacaktır.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, fare yumurta kanalının mikrodiseksiyonu için bir yöntem sunar ve RNA bütünlüğünü koruyarak bireysel segmentlerin toplanmasını sağlar. Ayrıca, gen ve protein analizi için uygun olan yumurta kanal hücre disosiasyonu için enzimatik olmayan bir prosedürü açıklar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Üreme Biyolojisi
Arka Plan
- Farklı yumurta kanalı segmentlerinin benzersiz fizyolojik işlevleri vardır.
- Bu segmentler patolojik değişikliklere duyarlılık bakımından farklılık gösterir.
- Küçük fare yumurta kanallarındaki segmentlerin tanımlanması zordur.
- Dokunun disosiasyonu yoluyla iyi farklılaşmış hücreler elde etmek zordur.
Çalışmanın Amacı
- Fare yumurta kanalının açılmasının gösterilmesi.
- Farklı yumurta kanalı segmentlerinin bireysel olarak tanımlanması ve analiz edilmesi.
- IVF tekniklerinin iyileştirilmesi için ampül ortamının anlaşılmasına katkıda bulunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Fare yumurta kanalının mikrodiseksiyonu.
- Farklı yumurta kanalı segmentlerinin tanımlanması.
- Yumurta kanal hücrelerinin enzimatik olmayan disosiasyonu.
- Stroma ve epitel hücrelerinin analizi.
Ana Sonuçlar
- Bireysel yumurta kanalı segmentlerinin başarılı bir şekilde tanımlanması.
- Elde edilen farklılaşmış disosiyal hücrelerin yüksek verimi.
- Fundus'un malign transformasyondaki rolü hakkında içgörüler.
- In vitro fertilizasyon tekniklerinde potansiyel iyileştirmeler.
Sonuçlar
- Sunulan yöntemler, yumurta kanal segmentlerinin detaylı analizini kolaylaştırır.
- Segmente özgü işlevlerin anlaşılması, üreme araştırmalarını güçlendirebilir.
- Gelecek çalışmalar, doğurganlık tedavilerindeki etkilere odaklanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables precise molecular and cellular analysis of the murine oviduct by overcoming technical barriers posed by its small size and complex anatomy. It supports target validation and mechanistic de-risking in reproductive biology, oncology, and immunology by allowing segment-specific interrogation of physiological and pathological processes. The approach enhances predictive confidence in preclinical models by preserving RNA integrity and yielding viable, differentiated single cells for downstream applications such as RT-qPCR, RNAseq, and flow cytometry.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of segment-specific physiological functions and differential susceptibility to pathological changes such as malignant transformation in the infundibulum.
- Operational Value: Provides pure RNA yields of 800–1,200 ng per segment, sufficient for RT-qPCR and RNAseq, supporting reliable target validation workflows.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream assays by isolating fully differentiated oviductal cells with intact ciliated borders and high viability (approximately 93%).
- Operational Value: Uses a mostly non-enzymatic dissociation buffer that preserves cell integrity, enabling reproducible single-cell isolation for flow cytometry and single-cell RNAseq.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system analysis by enabling separate evaluation of immune, smooth muscle, and epithelial cell contributions to oviduct physiology and pathology.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by providing segment-resolved molecular and cellular data aligned with embryological origins and epithelial cell type ratios.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early biology to lead identification by enabling hypothesis testing at the oviduct segment level and supporting mechanistic de-risking through precise biological system preparation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by allowing individual analysis of the four functional oviduct segments with distinct epithelial cell type ratios.
- Screening: Enables assay readiness through standardized dissociation that yields viable, differentiated cells suitable for quantitative analysis in screening platforms.
- Analytics: Delivers high-integrity RNA (RIN >7) and quantifiable single-cell outputs that allow comparison of conditions across segments and cell types.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling analysis of segment-specific disease susceptibility, such as infundibulum-derived precursor lesions to serous intraepithelial carcinomas.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for oviduct research across reproduction, fertility, cancer, and immunology programs, reducing reliance on whole-tube analysis that masks segment-level differences.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through segment-specific target validation and reduction of mechanistic ambiguity in complex tissue systems.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via a defined microdissection and dissociation protocol that minimizes RNA degradation.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by enabling early detection of segment-specific pathological susceptibilities.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on mechanistic insights from individual oviduct segments and cell populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in dissection microscopy and tissue handling, with initial practice recommended on larger structures like the uterus.
- Needs instrumentation including dissection microscopes, springform micro-scissors, 25-gauge needles, and equipment for RNA extraction and cell analysis.
- Demands cross-team standardization of dissection timing, toluidine blue staining, and cold tissue handling to ensure consistency across users and experiments.
- Involves adaptation considerations for different model systems, as the protocol is optimized for murine oviduct dimensions (200–400 μm diameter).
- Includes practical limitations such as the need to pool infundibular samples from two animals to achieve sufficient RNA yield for downstream assays.
