Murine Oviduct'un Mikroseksiyonu ve Ayrışması: Bireysel Segment Tanımlama ve Tek Hücre İzolasyonu
4 Kasım 2021
RNA bütünlüğünü korurken tek tek segmentlerin toplanmasına izin veren fare yumurta kanalının mikro dezenfeksiyonu için bir yöntem sunulmuştur. Ayrıca enzymatik olmayan ovidüktal hücre ayrışması prosedürü açıklanmıştır. Yöntemler fonksiyonel olarak farklı ovidüktal segmentlerin ve ayrışmış ovidüktal hücrelerin sonraki gen ve protein analizi için uygundur.
Farklı yumurta kanalı segmentleri farklı fizyolojik fonksiyonlara sahiptir ve patolojik değişime farklı olarak duyarlıdır. Çok küçük bir fare yumurta kanalındaki farklı segmentlerin tanımlanması, doku ayrışması ile iyi ayırt edilmiş hücrelerin iyi bir veriminin üretilmesi gibi zordur. Bu videoda, fare yumurtalığının nasıl çözüleceğini, farklı segmentlerin tek tek analiz edilebilmesi için nasıl tanınacağını ve son olarak, farklılaştırılmış ayrışmış hücrelerin nispeten yüksek veriminin nasıl üretileceğini göstereceğiz.
Ampullaya özgü ortamın daha iyi anlaşılması in vitro fertilizasyon tekniklerini geliştirebilir. Ayrıca, infundibulum'u diğer segmentlerle karşılaştırarak, infundibulumun kötü huylu dönüşüm eğilimini daha iyi anlayabiliriz. Tek hücreli ayrışma prosedürü stromal ve epitel hücrelerini yumurta kanalından kurtarır.
Yöntemimiz ayrıca bağışıklık, düz kas ve epitel hücre katkılarını fizyolojiye ve yumurta kanalı patolojisine ayrı ayrı analiz etme fırsatları sağlar. Diseksiyon mikroskobu altında çalışmak ilk başta zor olabilir. Aletlerinizin oviduct mikrodiseksiyon için yeterli olduğundan emin olmak için rahim gibi daha büyük bir tüple pratik yapmanızı tavsiye ederim.
Petri kabına yapışkanlı bir diş cilası parçası yapıştırarak ve kurumasını izin vererek başlayın. Daha sonra yemeği% 70 etanol ile sterilize edin. Yüzey artık diseksiyona hazır.
Diseksiyona hazır olduğunuzda, diş balmumunu içeren Petri kabını diseksiyon mikroskobu altında soğuk platformda hareketsiz hale getirin. Hayvanın ventral yüzeyini% 70 etanol ile dezenfekte edin. Daha sonra steril diseksiyon makası ile karın ve pelvik boşluğu açın.
Dorsal bihornal uterusun yerini bulmak için gastrointestinal sistemi bir tarafa hareket ettinin. Böbreğin hemen altındaki rahim yağ yastığında zarflanmış her bir yumurtalığı ve yumurtalığı bulmak için her bir rahim boynuzu rostral olarak takip edin. Daha sonra hem yumurtalıklarla birlikte lateral oviducts hem de diseksiyon makası kullanılarak hala bağlı distal rahim boynuzu bir kısmını kesin.
Her bir lateral rahim boynuzu, hala sarmal yumurtalığa ve yumurtalığa bağlı olan boynuzun yaklaşık bir ila iki santimetresi ile kesin. Dokuyu hemen iki mililitre soğuk diseksiyon ortamına batırın, ardından diseksiyon için dokuyu sabitlemek için steril 25 kalibrelik bir iğne ile rahim dokusunu diş mumumuna yapıştırın. Yumurta kanalını net bir şekilde görselleştirmek için yumurtalık yağ yastığını ve bağ dokusunu temizleyin ve parçalara ayırın.
Bir ila iki damla steril% 1 toluidin mavi boya çözeltisi dağıtmak ve 30 saniye ila bir dakika boyunca kuluçkaya yatmak için bir mililitre şırınna kullanın. Soğuk DPBS ile durulayın ve ardından tüm sıvıyı çıkarın. Yumurtalığı sarmal yumurtalıktan hafifçe çekin.
Tubal dokudan ödün vermeden yumurtalığı yumurtalıktan çıkarmak için geniş bağdaki bursal zarı kesin. Rahim tubal kavşağına yanal bulunan yumurta kanalının distal fimbrial ucunu bulun. Tüpü yavaşça çekin ve yumurta kanalını aşamak için yaylı mikro makasla mezosalpinkste kesin.
Infundibular bölgeyi üretmek için tüpü kesin. Daha sonra ampullery bölgesini iki ve üç dönüş arasında keserek tüketime edin. Son olarak, kalan kısmı istimik bölge olan rahim tubal kavşağına kesin.
Parçalanmış doku segmentlerini sıvı nitrojene hemen dondurun ve ardından RNA izolasyonu için dokuya 200 mikrolitre soğuk RNA ekstraksiyon reaktifi ve bire bir homojenizasyon boncuk karışımı ekleyin. Fimbrial bölgeden başlayarak, tüpü yaylı makasla uzunlamasına kesin ve luminal epitelleri açığa çıkarmak için kaldıraç olarak epips kullanın. Yarık açık kısımları ve kalan yumurta kanalını yaklaşık bir ila iki milimetrelik parçalara ayırın.
Daha sonra dokuya beş mililitre sıcak enzimatik olmayan ayrışma tamponu ekleyin ve 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Occludin, nüklei ve asetilasyonlu tubulin için pozitif bir hücre kümesinin floresan ve faz kontrast görüntüleri burada gösterilmiştir. Kırmızı occludin, mavi çekirdekleri ve yeşil asetillenmiş tübulin anlamına geliyor.
Siliated apikal kenarlık protokol boyunca bozulmadan kalır ve tek hücrelere daha fazla sindirime dayanır. Bu temsili görüntülerde birleştirilmiş, kırmızı, mavi, faz kontrastı ve yeşil kanallar gösterilir. Kısa bir pronaz inkübasyonundan sonra, hücrelerin çoğunluğu tektir.
Propidium iyodür boyama Brightfield, kırmızı kanal PI pozitif ve birleştirmede yaklaşık% 93 canlılık gösterir. Birleştirmedeki içe, tek bir ayrışmış hücrede bozulmamış bir sınır gösterir. Bu tür hücreler aktif olarak cilia'yı dövüyor.
Tüm RNA mikrovolum spektrofotometre ve biyoanalyzer tarafından verim ve kalite için değerlendirildi. Sonuçlar, bu yöntemin, aşağı akış tahlilleri için uygun verim için iki hayvandan havuzlamanın gerekli olabileceği infundibular örnekler dışında segment başına 800 ila 1.200 nanogram RNA verdiğini göstermektedir. Infundibulum için sunulan sonuçlar, toplam dört infundibular bölgeden olmak üzere iki hayvandan toplanmaktadır.
Bu protokol, bir mikrovolum spektrofotometresi ve bir biyoanalyzer ile analiz edilen saf RNA'yı başarıyla elde eder. Örnekler, saf RNA nükleotid türlerinin tipik bir örneği olan 1,8 ila 2 arasında 260 ila 280 nanometre emilim oranına sahiptir. Numunelerin biyoanalizesi, aşağı akış ekspresyözü ve sıralama analizi için uygun olan yedinin üzerinde değerlendirilen RNA bütünlük sayısı ile yüksek RNA bütünlüğü gösterdi.
Tubal sistemi diseksiyon platformuna yapıştırmak için uterus boynuzundan bir ila iki santimetre tutmayı unutmayın. Ek olarak, toluidin mavi boyasının kullanımı, yumurta kanalının hızlı bir şekilde geri tepmesine yardımcı olur. Ne kadar hızlı geri tepme, koruma ve en az RNA bozulması o kadar iyi olur.
Bu yöntem, bireysel segment dizilimine izin vererek RNA dizilimi için uygun kalitede RNA elde etmek için yeterlidir. Hücre ayrışması, daha hassas bir segment ve hücre analizi sağlayan tek hücreli sıralama veya akış sitometrisi için uygundur. Yöntem, segment veya tek hücre düzeyindeki farklılıkları maskeleyen tüm tüp analizinin ötesine geçmesine yardımcı olacaktır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, RNA bütünlüğünü koruyarak bireysel segmentlerin toplanmasına olanak tanıyan fare oviduktunun mikrodiseksiyonu için bir yöntem sunmaktadır. Ayrıca, gen ve protein analizi için uygun, ovidukt hücresi disosiasyonuna yönelik enzim içermeyen bir prosedürü tanımlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Üreme Biyolojisi
Arka Plan
- Farklı ovidukt segmentleri benzersiz fizyolojik fonksiyonlara sahiptir.
- Bu segmentler, patolojik değişikliklere olan duyarlılıkları açısından farklılık gösterir.
- Küçük fare oviduktlarındaki segmentlerin tanımlanması zordur.
- Doku disosiasyonu yoluyla iyi diferansiye olmuş hücreler üretmek güçtür.
Çalışmanın Amacı
- Fare oviduktunun açılmasını göstermek.
- Farklı ovidukt segmentlerini tek tek belirlemek ve analiz etmek.
- IVF tekniklerini geliştirmek amacıyla ampulla ortamına ilişkin anlayışı artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Fare oviduktunun mikrodiseksiyonu.
- Belirgin ovidukt segmentlerinin tanımlanması.
- Oviduktal hücrelerin enzim dışı disosiyasyonu.
- Stromal ve epitel hücrelerin analizi.
Ana Sonuçlar
- Bireysel ovidukt segmentlerinin başarıyla tanımlanması.
- Elde edilen diferansiye disosiye hücrelerin yüksek verimi.
- İnfundibulumun malign transformasyondaki rolüne dair içgörüler.
- İn vitro fertilizasyon tekniklerinde potansiyel iyileştirmeler.
Sonuçlar
- Sunulan yöntemler, ovidukt segmentlerinin detaylı analizini kolaylaştırmaktadır.
- Segmente özgü işlevlerin anlaşılması, üreme araştırmalarını geliştirebilir.
- Gelecekteki çalışmalar, fertilite tedavileri üzerindeki etkiler üzerine odaklanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Bu yöntem, fare oviduktunun küçük boyutu ve karmaşık anatomisinin neden olduğu teknik engelleri aşarak, yapıya dair hassas moleküler ve hücresel analiz yapılmasına olanak tanır. Fizyolojik ve patolojik süreçlerin segmente özgü incelenmesine imkan vererek; üreme biyolojisi, onkoloji ve immünolojide hedef doğrulamayı ve mekanistik risk azaltmayı destekler. Bu yaklaşım, RNA bütünlüğünü koruyarak ve RT-qPCR, RNAseq ve akış sitometrisi gibi sonraki uygulamalar için canlı, farklılaşmış tek hücreler sağlayarak preklinik modellerdeki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Segmente özgü fizyolojik fonksiyonların ve infundibulumdaki malign transformasyon gibi patolojik değişikliklere karşı farklı duyarlılıkların incelenmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Segment başına 800–1,200 ng saf RNA verimi sağlayarak RT-qPCR ve RNAseq için yeterli miktarda materyal sunar ve güvenilir hedef doğrulama iş akışlarını destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Siliya sınırları sağlam ve canlılığı yüksek (yaklaşık %93) tam diferansiye olmuş oviduktal hücreleri izole ederek, alt analizler için valide edilmiş biyolojik sistemlerin hazırlanmasını kolaylaştırır.
- Operasyonel Değer: Hücre bütünlüğünü koruyan, çoğunlukla enzimatik olmayan bir disosiasyon tamponu kullanarak, akış sitometrisi ve tek hücre RNAseq için tekrarlanabilir tek hücre izolasyonuna olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: İmmün, düz kas ve epitel hücrelerinin ovidukt fizyolojisi ve patolojisine olan katkılarının ayrı ayrı değerlendirilmesine olanak tanıyarak hastalığa özgü sistem analizini destekler.
- Operasyonel Değer: Embriyolojik kökenler ve epitel hücre tipi oranlarıyla uyumlu, segment bazlı moleküler ve hücresel veriler sağlayarak keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan sürecin sürekliliğini sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, ovidukt segmenti düzeyinde hipotez test edilmesine olanak tanıyarak ve hassas biyolojik sistem hazırlığı yoluyla mekanistik risk azaltımını destekleyerek, erken biyolojiden öncü bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürecine entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Farklı epitel hücre tipi oranlarına sahip dört fonksiyonel ovidukt segmentinin ayrı ayrı analiz edilmesine olanak tanıyarak hipotez testlerini ve yolakların netleştirilmesini destekler.
- Tarama: Tarama platformlarında kantitatif analiz için uygun, canlı ve diferansiye hücreler sağlayan standartlaştırılmış disosiasyon yoluyla assay hazırlığına imkan tanır.
- Analitikler: Segmentler ve hücre tipleri arasında koşulların karşılaştırılmasına izin veren yüksek bütünlüklü RNA (RIN >7) ve kantifiye edilebilir tek hücre çıktıları sunar.
- Translasyonel Araştırma: İnfundibulum kaynaklı seröz intraepitelial karsinom öncül lezyonları gibi segmente özgü hastalık yatkınlıklarının analizini mümkün kılarak preklinik süreklilikle bağ kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Üreme, fertilite, kanser ve immünoloji programları genelinde ovidukt araştırmaları için yeniden kullanılabilir bir kapasite oluşturarak, segment düzeyindeki farkları maskeleyen tüm tüp analizlerine olan bağımlılığı azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Segmente özgü hedef doğrulaması yoluyla öngörülebilir güven ve karmaşık doku sistemlerindeki mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: RNA degradasyonunu minimize eden, tanımlanmış bir mikrodissection ve dissosiyasyon protokolü aracılığıyla standardizasyon, tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik.
- Stratejik Değer: Segmente özgü patolojik yatkınlıkların erken tespitini sağlayarak daha iyi devam/durdurma kararları, sermaye verimliliği ve azaltılmış geç evre biyolojik risk.
- Portföy Etkisi: Bireysel ovidukt segmentleri ve hücre popülasyonlarından elde edilen mekanistik içgörülere dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirme ve geliştirme kararları.
Uygulama Hususları
- Diseksiyon mikroskopisi ve doku işleme konusunda uzmanlık gerektirir; başlangıç aşamasında uterus gibi daha büyük yapılar üzerinde pratik yapılması önerilir.
- Diseksiyon mikroskopları, yaylı mikro makaslar, 25-gauge iğneler ile RNA ekstraksiyonu ve hücre analizi için gerekli ekipmanlar dahil olmak üzere enstrümantasyon gerektirir.
- Kullanıcılar ve deneyler arasında tutarlılığı sağlamak için diseksiyon zamanlaması, toluidin mavisi boyama ve soğuk doku işleme süreçlerinin ekipler arası standartlaştırılmasını gerektirir.
- Protokol fare ovidukt boyutları (200–400 μm çap) için optimize edildiğinden, farklı model sistemleri için adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Alt analizler için yeterli RNA verimine ulaşmak amacıyla iki hayvandan infundibulum örneklerinin birleştirilmesi gerekliliği gibi pratik sınırlamalar içerir.
