Zonular Liflerin Viskoelastik Özelliklerinin Belirlenmesinde Biyolojik Hazırlık ve Mekanik Teknik
16 Aralık 2021
Protokol, hücre dışı matris viskoelastisitesinin incelenmesi ve protein bileşimine veya çevresel faktörlere bağımlılığı için bir yöntem tanımlamaktadır. Hedeflenen matris sistemi fare zonule'sidir. Yöntemin performansı, vahşi tip zonular liflerin viskoelastik davranışı ile mikrofibril ilişkili glikoprotein-1'den yoksun olanlar karşılaştırılarak gösterilmiştir.
Yöntemimizin önemi, soruyu cevaplama yeteneğinde yatmaktadır, zonular liflerin viskoelastik özellikleri nelerdir, göz içindeki lensi askıya alan lifler? Tekniğimizin ana avantajı, hedefli gen modifikasyonları olan ve olmayan farelerden gelen küçük ve hassas zonular liflerin viskoelastik özelliklerini ölçebilmesidir. Mikrofibril proteinleri kodlayan genlerdeki mutasyonlar, kalıtsal birkaç syndromik koşulun altında yatırmaktadır.
Tekniğimizi kullanarak, spesifik mutasyonların mikrofibrillerin biyomekanik özelliklerini nasıl değiştirdiğini araştırabiliriz. Başlamak için, fareyi ötenazi sonrası, ince tokmaklar kullanarak gözleri çıkarın. Bir fiksasyon iğnesinin ucunu gözün duvarına yerleştirin ve lense zarar vermemeye dikkat ederek vitreus mizahının ortasına yerleştirin.
Saplanmış gözü% 4 paraformaldehit ve fosfat tamponlu salin ile dolu bir tüpe dikkatlice aktarın. İğneyi, sabitleme süresi boyunca göz içinde 15 ila 20 milimetre cıvaya eşdeğer pozitif basınç sağlayan numunenin 25 santimetre üzerinde bulunan sabitlenmiş bir rezervuara bağlayan vanayı açın ve numuneyi bir gecede sabitlemek için bırakın. Ertesi gün, fiksasyon iğnesini çıkarın ve gözü fosfat tamponlu salin içinde 10 dakika yıkayın.
Oftalmik cerrahi makas ve stereo mikroskop kullanarak, optik sinir kafasının yakınındaki göz duvarında tam kalınlıkta bir kesi yapın. Hassas silier işlemleri ve ilişkili zonular lifleri dikkatlice tutarken, kesimi ekvatora doğru ve daha sonra gözün ekvatoral çevresine doğru uzatın. Dünyanın arkasını çıkararak lensin arka yüzeyini açığa çıkarın.
Parçalanmış gözü forseps kullanarak tampon çözeltisinden çıkarın ve kornea aşağı bakacak şekilde kuru bir görev mendilinin üzerine yerleştirin. Korneayı kurutmak için silecek yüzeyinin üzerine hafifçe sürükleyin. 50 milimetrelik Petri kabının dibine bir damla anında tutkal uygulayın ve platformu sabitlayın.
Kabı stereo mikroskobun sahne plakasına yerleştirin, böylece tutkallı kuyu görüntülenir. Gözü Petri kabının platform kuyularına yerleştirmek için üç mikrolitre anında tutkal ekleyin. Dikkatlice kuyuya yerleştirin ve lensin arkası yukarı doğru dönecek şekilde hızla ayarlayın.
Lensin açıkta kalan tarafını kuru bir silmenin köşesiyle hafifçe şişirerek kurulayın. Zonular viskoelastik tepkiyi ölçmek için teraziyi açın, Petri kabını tartıya yerleştirin, ardından ölçek günlüğü programını ve kamera yazılımını başlatın. Servomotor kumandasını aç.
Bilgisayarda denetleyici uygulamasını başlatın ve hareket parametrelerini 50 mikrometre artışlarla ayarlayın. Kılcal çubukta 90 derece büküm oluşturun. Bükülmüş kılcal damarı kılcal prob tutucusuna kaydırın ve sabitleme vidalarını sıkın.
Kılcal uçlara küçük bir UV kürleme tutkalı ekleyin. Manipülatördeki manuel ayarlamaları kullanarak kılcal probun ucunu hareket ettirİn ve doğrudan lensin üstüne yerleştirin. Ön görsel inceleme ve mikroskop kamerası kullanarak yan görünüm sayesinde, UV tutkalının alt kısmının lensin üst kısmına ortalanmış olarak göründüğünü inceleyin.
Kameradan bakarken, UV tutkal lensle temas edene ve üst yüzeyinin 1/3 ila 1/2'sini kaplayana kadar prob ucunu küt atlayın. Tutkal, 380 ila 400 nanometre dalga boyu yöne yakın bir UV ışık kaynağı ve yaklaşık bir miliwatt yoğunluk kullanarak kürlayın. Göz en az iki milimetre derinliğe kadar kaplanana kadar Petri kabına PBS çözeltisi ekleyin.
Mikroskobun önüne ve Petri kabına dokunmadan yakın bir şekilde silindirik bir lens yerleştirin. Aynı zamanda, bir zamanlayıcı programında günlüğe kaydetmeyi başlatın. Kamerayı kullanarak gözün ve sondanın fotoğrafını çekin.
60 saniye sonra, 50 mikrometre yer değiştirmeye başlayın. Deney tamamlanana kadar her 60 saniyede bir tekrarlayın, tüm zonular liflerin kırılmasıyla belirtildiği gibi. Bir çalıştırma tamamlandıktan sonra ölçek günlüğü verilerini kaydedin ve uyumlu bir elektronik tablo biçimine verin.
Ayrıca, çalıştırma sırasında elde edilen lens resimlerini kaydedin. Verileri elektronik tabloya alın. İlk ve son ölçek okumasını kullanarak, buharlaşma nedeniyle zaman içinde arka plan okumasındaki sürüklenmeyi enterpolasyona tabi edin, ardından enterpolasyonlu arka planı her zaman noktasında okumadan çıkarın.
Tahlil yapıldıktan ve buharlaşma için düzeltildikten sonra, viskoelastik verilerin grafiği ters çevrilir. Anlık ve rahat kuvvetlerin büyüklüğü, yaklaşık 1.000 saniyeye kadar her adımda artar, daha sonra zonular lifler tüm lifler kırıldığında 1.500 saniyelik zaman noktasına ulaşılana kadar kırılmaya başladığında düşer. Bu gösteri için, vahşi tip ve MAGP-1 eksikliği olan fareler için viskoelastik yanıt da karşılaştırıldı.
Sıfır ila 600 saniyelik ilk zamanda, grafikler birbirine benzer ve zonular liflerin viskoelastik özelliklerinin önemli ölçüde değiştirilmediğini düşündürür. Bununla birlikte, MAGP-1 nakavt faresinde, lifler zamanından önce kırılır. Zonular lif kırma kuvvetleri, magp-1 için bir aylık ve bir yıllık aşamalarda vahşi tip farelere karşı barfiks yöntemi ile elde edildi.
Sonuçlar, liflerin gücünün yabani tip fareler için yaşla birlikte arttığını gösterdi. Bu adımlar sırasında Petri kabı ile herhangi bir yanlışlıkla temas, göz duvarının göz merceğine göre kaymasına neden olabilir ve zonular liflere zarar verebilir. Bu barfibril tahlil, mikrofibrillerin gerilme mukavemetine katkıda bulunan proteinlerin tanımlanmasına yardımcı olur.
Bu bilgileri, zonular liflerin iç kısmının daha gerçekçi modellerini oluşturmak için kullanacağız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, hücre dışı matrisin viskoelastik özelliklerinin incelenmesi için bir yöntem belirlemektedir, özellikle fare zonulüne odaklanmaktadır. Protein bileşimi ve çevresel faktörlerin bu özellikleri nasıl etkilediğini, vahşi tip zonuler lifler ile mikrofibrill-ilişkili glikoprotein-1 eksikliği olan liflerin karşılaştırılması yoluyla gösterir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyoloji
- Biyomekanik
Arka Plan
- Zonuler lifler, göz içindeki merceği askıda tutar.
- Viskoelastik özellikler, biyomekanik davranışı anlamak için çok önemlidir.
- Mikrofibrill proteinlerindeki mutasyonlar, kalıtsal sendromik durumlara yol açabilir.
- Bu özellikleri anlamak, genetik etkilerin göz sağlığı üzerindeki etkilerini araştırmada yardımcı olabilir.
Çalışmanın Amacı
- Zonuler liflerin viskoelastik özelliklerini nicellemek.
- Belirli gen mutasyonlarının bu özellikler üzerindeki etkisini değerlendirmek.
- Hassas biyolojik yapıları incelemek için güvenilir bir yöntem sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Zonuler lifleri elde etmek için farelerin ötanazi işleminden sonra kullanılması.
- Göz çıkarmak için ince forseps kullanılması.
- Analiz için göze fiksasyon iğnesi yerleştirilmesi.
- Vahşi tip ve genetik olarak modifiye edilmiş farelerden alınan liflerin karşılaştırılması.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, viskoelastik özellikleri başarıyla nicellemek için kullanılabilir.
- Vahşi tip ve mutant lifler arasında özelliklerde farklılıklar gözlendi.
- Belirli mutasyonların biyomekanik özellikleri değiştirdiği gösterildi.
- Teknik, daha ileri genetik çalışmalar için uygulanabilir.
Sonuçlar
- Bu yöntem, zonuler liflerin biyomekanik özellikleri hakkında bilgiler sağlar.
- Genetik modifikasyonların etkilerini keşfetmek için kullanılabilir.
- Bulgular, göz ile ilgili sendromik durumları anlamak için katkıda bulunabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables quantitative assessment of viscoelastic properties in zonular fibers, a model extracellular matrix system, to evaluate how specific protein mutations alter biomechanical function. By providing a sensitive, reproducible readout of fiber integrity under controlled mechanical stress, it supports target validation in ocular disease mechanisms and preclinical de-risking of genetic therapies. The approach offers a scalable platform for probing ECM-protein relationships relevant to connective tissue disorders beyond the eye.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking zonular protein composition to measurable changes in viscoelastic behavior.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct comparison of wild-type and genetically modified fibers under standardized mechanical load.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying proteins whose loss correlates with premature fiber failure under defined displacement thresholds.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces validated biological systems (zonular fiber preparations) with quantifiable tension outputs suitable for downstream compound or genetic screening.
- Reproducibility: Standardized fixation, mounting, and displacement protocols ensure consistent baseline measurements across experimental runs.
- Scalability: Platform design allows parallel processing of multiple samples using identical Petri dish wells and capillary probe setups.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models human syndromic conditions arising from microfibril protein mutations, enabling preclinical evaluation of genotype-phenotype relationships.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase target validation with preclinical assessment by providing a common biomechanical readout across wild-type and disease-model systems.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypic changes stem from altered ECM viscoelasticity rather than off-target developmental effects.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by delivering early-phase biomechanical data that informs target confidence and assay readiness for downstream validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how gene mutations affect the load-bearing capacity of zonular microfibrils.
- Screening: Generates assay-ready preparations with force-displacement readouts enabling comparison of wild-type, heterozygous, and homozygous mutant conditions.
- Analytics: Outputs time-resolved tension measurements that allow calculation of instantaneous and relaxed force parameters, facilitating statistical comparison across genotypes.
- Translational Research: Provides a disease-relevant system for evaluating whether rescued protein expression restores viscoelastic profiles toward wild-type baselines.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized biomechanical platform applicable to other tensile ECM systems (e.g., tendons, ligaments) with minimal protocol adaptation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating the contribution of specific ECM proteins to tissue-level viscoelasticity.
- Operational Value: Delivers standardized, low-cost measurements with sensitivity to detect age- and genotype-dependent changes in fiber strength.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective biomechanical criteria for target prioritization in connective tissue-targeted programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by quantifying the functional consequence of genetic modifications on load-bearing ECM networks.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ocular dissection, microsurgery, and biomechanical testing under microscopy.
- Depends on precision instrumentation including servomotor controllers, force-sensitive scales, and UV curing systems for probe-lens attachment.
- Necessitates standardized fixation and mounting procedures to prevent sample drift or mechanical artifact during tension measurement.
- Involves adaptation considerations when applying the pull-up technique to ECM systems with differing structural organization or tensile strength.
- Practical limitations include sample preparation time and the need for controlled environmental conditions (e.g., PBS buffering) to minimize evaporation artifacts during extended runs.
