Toksisite Testi ve Fenotipik İlaç Taraması için iPSC Türevi Kardiyomiyositlerde Yüksek Verimli Optik Kontrol ve Kalsiyum Sinyalinin Kaydedilmesi

Yüksek verimli ilaç taraması ve toksisite testi için iPSC türevi kardiyomiyositlerde tetiklenen hücresel aktivitenin tüm optik kontrolü ve gözlemlenmesi için sayısız yöntem gösteriyoruz. Zaman ve uzaydaki fenotipik kalıpların çok parametrik nicelleştirilmesini sağlayın, ilaçların etkisini saatler veya günler boyunca gözlemlemeye izin verin. Bu yöntem, fonksiyonel tarama ve toksisite testi için nevrozlar veya beta hücreleri gibi farklı hücre tiplerine uygulanabilir.

Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir biyo-görüntüleme mühendisi olan Wan-Chi Su olacak. iPSC kardiyomiyositleri çözülmek üzere soğuk depodan çıkarılmadan önce çok kuyulu plakayı hazırlayın. 96 kuyucuklu mikro plakanın her bir oluğunu, tüm yüzeyleri iyice kaplamak için mililitre fibronektin başına 50 mikrogram ile 100 mikrolitre% 0.02 jelatin çözeltisi ile kaplayın.

iPSC kardiyomiyositlerini sıvı azot depolama tankından 37 santigrat derece su banyosuna aktarın. Şişeyi ikinci sınıf bir biyo-güvenlik kabinine alın ve içeriği dokuz mililitre oda sıcaklığında ortam içeren yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe yavaşça aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 200 kez G'de santrifüj yapın.

Süpernatantı pipetle atın ve hücreleri 10 mikromolar ROCK inhibitörü Y27632 ile bir mililitre ortamda yavaşça yeniden askıya alın. Plaka hücreleri, üreticinin talimatlarına göre, santimetre kare başına 100.000 ila 150.000 hücre yoğunluğunda 96 kuyu plakasını kapladı. 24 saat sonra, plakanın yüzeyine tutturulmuş hücrelerin diğer hücrelerle temas halinde olduğundan emin olun.

Hücreleri 72 saat boyunca kapladıktan sonra GECI'nin viral kitlerini buz üzerinde çözer. Bakım ortamı ile çift mukavemetli bir viral kit stok çözeltisi hazırlayın. Orta hacmi kuyucuk başına 100 mikrolitreye ayarlayarak hücreleri enfeksiyona hazırlayın.

Önceden karıştırılmış viral çözeltinin 100 mikrolitresini kuyucuklara ekleyin ve 37 santigrat derecede sekiz ila 16 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, 200 mikrolitre önceden ısıtılmış ortam ile değiştirin. Bir görüntüleme sistemi kullanarak GECI'lerin ifadesini transdüksiyondan 24 saat sonra görselleştirin.

Fonksiyonel testler yapılmadan önce nemlendirilmiş inkübatördeki hücreleri koruyun. Yüksek içerikli görüntüleme sisteminin tüm cihazlarını açın. Oda sıcaklığının% 5 karbondioksit takviyesi ile 37 santigrat dereceye ulaştığını doğrulayın.

Görüntüleme yazılımını açın ve 96 kuyucuklu bir plaka için plaka ayarını seçin. Odaya kapaksız bir 96 kuyucuklu plaka yerleştirin ve canlı hücre sızdırmazlık halkasını üstüne yükleyin. Gerekli uzamsal çözünürlüğe göre 20X, 60X ve 20X suya daldırma objektif lensini seçin.

Deneysel elde etmeden önce net görüntüler çekmek için odağı ayarlayın. Kalsiyum aktivitesi kaydı için kuyucuk başına rastgele üç ila beş bölge seçin. Farklı göstergeler için uygun filtreleri seçin.

Kullanılan her görüntüleme kanalı için uygun ışık yayan diyot gücünü ayarlayın. Kardiyomiyositlerde eksprese edilen MNG-GECO ve K-GECO probları tarafından bildirilen kalsiyum geçicilerini gözlemlemek için akış alımı için kamera pozlama süresini maksimum 40 milisaniye veya 25 hertz'e ve 30 saniyelik bir kayıt süresine ayarlayın. Daha yüksek kare hızlarında sinyal-gürültü oranı ikiden azsa LED gücünü artırın.

Optogenetik stimülasyon için, mavi ışığın gücünü ve frekansını bir hertz'de optimize edin ve edinime başlayın. DMSO'da E4031 Dofetilide ve Verapamil'i yeniden askıya alın ve Tyrode'un tamponuyla seyreltin. Bileşikleri karşılık gelen hedefe iyi yerleştirin.

Otomatik mikro-akışkan sistem aracılığıyla çift mukavemetli bileşiğin 100 mikrolitresini kuyucuklara ekleyin ve istenen kuluçka süresinden sonra edinime başlayın. Yazılım ile darbe özelliğini, zaman içinde çözünürlüğü otomatik olarak algılayarak sinyal alanını arka plandan izole edin. Vuruş sıklığını, pik sinyalini, kalsiyum geçici süresini% 50 kalsiyum geçici süresi% 90 yükselme süresini ve bozunma süresini analiz etmek için kalsiyum pik analiz yazılımını kullanın.

Videoda, ilaç tedavileri olan veya olmayan iPSC türevi kardiyomiyositler tarafından eksprese edilen NMG-GECO'daki spontan kalsiyum salınımının gözlemlenmesi gösterilmiştir. MNG-GECO kullanılarak elde edilen kinetik izler, küçük moleküler iyon kanalı inhibitörleri Verapamil, Dofetilide ve E4031'in kalsiyum geçicilerini beklendiği gibi etkilediğini göstermiştir. E4031'in doz yanıtını standartlaştırılmış, tempolu koşullar altında değerlendirmek için channelrhodepsin-2 ve K-GECO'yu ifade eden iPSC CM'ler bir hertz ve 470 nanometre ışık darbeleri kullanılarak optik olarak kontrol edildi ve kırmızı K-GECO sinyali kullanılarak gözlemlendi.

Tepe genliğinin ilerleyici azalmaları ve kalsiyum geçicilerinin bozunma süresindeki artış, artan E4031 konsantrasyonları ile meydana gelir. E4031'in doza bağımlı etkisi, pik genlikteki azalmalar için en belirgin olanıydı. Berrak kalsiyum geçicileri, viral transdüksiyondan bir ay sonra veya optik hız için kullanılan ek ışık olmadan görünür kalır.

Grafik, LVNC iPSC CM modunda vuruş hızını artıran, kasılma aralığını düzenli hale getiren ve geçici kalsiyum genliğini artıran bir ilacı göstermektedir. Vuruş sıklığının değişkenliği ve kalsiyum geçici süresi üzerindeki müteakip etki, iPSC CM kültürde korundukça da değişir. ER LAR-GECO, MTG-Sepia ve NIR-GECO dahil olmak üzere çeşitli GECI'ler, sırasıyla endoplazmik retikulum, sarkoplazmik retikulum, mitokondri ve sitosolde ortaya çıkan gerçek zamanlı kalsiyum aktivitesi ölçümü için tek tek ekspresyon için veya hücre modellerinde kombinasyon halinde geliştirilmiştir.

GECI'ler, farklı hücre içi kalsiyum depolarını incelemek için iPSC CM modelinde birleştirilebilir. Kardiyomiyositleri eksprese eden K-GECO, zamanla tutarlı dayak davranışı gösterdi. Bununla birlikte, Fluo-4 yüklemesi bu modelde hem vuruş frekansını hem de CTD'yi etkiledi, bu da Fluo-4'ün kendisinin bu tür deneylerin sonuçlarını etkileyebileceğini düşündürdü.

Kontrol ve hasta kaynaklı hücrelerden fenotipik profilleri incelemek için basit bir yol sunarken, iPSC ara maddesi çeşitli hastalıklarda ilaç keşfine ışık tutabilir.