Name: Maternal Crispantlarla Erken Gelişimde Annelik İfade Edilen Genlerin Rolünün Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Öğrenin maternal CRISPR tekniğiyle erken embriyonik gelişimde anne etkili genleri hızlıca belirlemeyi. Bu yöntem, tek nesilde yeni fenotipler keşfederek gelişim biyolojisi araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Geçmişteki ve şu anki Pelegri laboratuvarı hayvancılık personeline su tesislerine gösterdikleri özen için teşekkür ederiz. Ayrıca Ryan Trevena ve Diane Hanson tarafından el yazması hakkındaki yorumlar ve içgörüler için minnettarız. Finansman F.P.'ye NIH hibesi ile sağlandı (GM065303)

<ol><li>Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+factors+in+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Maternal factors in zebrafish development.</a> Developmental Dynamics. 228 (3), 535-554 (2003).</li>
<li>Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+interacts+with+Bucky+ball+to+form+germ+cells+and+is+required+to+pattern+the+zebrafish+body+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis.</a> Development. 142 (17), Cambridge, England. 2996-3008 (2015).</li>
<li>Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((aura+%28mid1ip1l%29+regulates+the+cytoskeleton+at+the+zebrafish+egg-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition.</a> Development. 143 (9), Cambridge, England. 1585-1599 (2016).</li>
<li>He, W. -X., et al. Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHe%2C+W-X+%22RNA%22">RNA</a>. 24 (12), RNA. New York, N.Y. 1738-1748 (2018).</li>
<li>Burger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mutagenesis+with+solubilized+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> Development. 143 (11), Cambridge, England. 2025-2037 (2016).</li>
<li>Jao, L. -E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).</li>
<li>Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reverse+genetic+screening+using+CRISPR+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish.</a> Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).</li>
<li>Shankaran, S. S., Dahlem, T. J., Bisgrove, B. W., Yost, H. J., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-directed+gene+editing+for+the+generation+of+loss-of-function+mutants+in+high-throughput+zebrafish+F0+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119 (1), 1-22 (2017).</li>
<li>Trubiroha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+CRISPR%2FCas-based+mutagenesis+assay+in+zebrafish+for+identification+of+genes+involved+in+thyroid+morphogenesis+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Rapid CRISPR/Cas-based mutagenesis assay in zebrafish for identification of genes involved in thyroid morphogenesis and function.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5647(2018).</li>
<li>Wu, R. S., Lam, I. I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+method+for+directed+gene+knockout+for+screening+in+G0+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish.</a> Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).</li>
<li>Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+maternal-effect+genes+in+zebrafish+using+maternal+crispants%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants.</a> Development. 148 (19), Cambridge, England. 199536(2021).</li>
<li>Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+zebrafish+primordial+germ+cells%3A+morphology+and+early+distribution+of+vasa+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).</li>
<li>Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation%2C+segregation%2C+and+dispersal+of+homotypic+germ+plasm+RNPs+in+the+early+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo.</a> Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).</li>
<li>Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionary+conserved+region+in+the+vasa+3%27UTR+targets+RNA+translation+to+the+germ+cells+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">An evolutionary conserved region in the vasa 3'UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish.</a> Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).</li>
<li>Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+vasa+homologue+RNA+is+localized+to+the+cleavage+planes+of+2-+and+4-cell-stage+embryos+and+is+expressed+in+the+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells.</a> Development. 124 (16), Cambridge, England. 3157-3165 (1997).</li>
<li>Gagnon, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+mutagenesis+by+Cas9+protein-mediated+oligonucleotide+insertion+and+large-scale+assessment+of+single-guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs.</a> PLoS ONE. 9 (5), 98186(2014).</li>
<li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v2%3A+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).</li>
<li>Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v3%3A+expanding+the+CRISPR+web+toolbox+beyond+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).</li>
<li>Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP%3A+a+CRISPR%2FCas9+and+TALEN+web+tool+for+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).</li>
<li>Moravec, C. E., Pelegri, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+accessible+protocol+for+the+generation+of+CRISPR-Cas9+knockouts+using+INDELs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An accessible protocol for the generation of CRISPR-Cas9 knockouts using INDELs in zebrafish.</a> Methods in Molecular Biology. 1920, Clifton, N.J. 377-392 (2019).</li>
<li>White, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+mRNA+expression+time+course+of+embryonic+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A high-resolution mRNA expression time course of embryonic development in zebrafish.</a> eLife. 6, 30860(2017).</li>
<li>Aanes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+mRNA+sequencing+deciphers+novelties+in+transcriptome+dynamics+during+maternal+to+zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish mRNA sequencing deciphers novelties in transcriptome dynamics during maternal to zygotic transition.</a> Genome Research. 21 (8), 1328-1338 (2011).</li>
<li>Aken, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ensembl+gene+annotation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Database%3A+The+Journal+of+Biological+Databases+and+Curation%22%5BJournal%5D)">The Ensembl gene annotation system.</a> Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).</li>
<li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+and+identification+of+CRISPR%2FCas9-generated+gene+knockouts+in+the+model+system+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e56969(2018).</li>
<li>Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((efficient+multiple+genome+modifications+induced+by+the+crRNAs%2C+tracrRNA+and+Cas9+protein+complex+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish.</a> PloS One. 10 (5), 0128319(2015).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1115(2009).</li>
<li>Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+into+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Microinjection into zebrafish embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 127, Clifton, N.J. 125-132 (1999).</li>
<li>Biology Mouse,, Zebrafish,, Chick, JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology%3A+Mouse%2C+Zebrafish%2C+and+Chick.+Zebrafish+Microinjection+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Biology: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques.</a> JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>D'Agostino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+cheap+methodology+for+CRISPR%2FCas9+zebrafish+mutant+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A rapid and cheap methodology for CRISPR/Cas9 zebrafish mutant screening.</a> Molecular Biotechnology. 58 (1), 73-78 (2016).</li>
<li>Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ploidy+manipulation+of+zebrafish+embryos+with+Heat+Shock+2+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54492(2016).</li>
<li>Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+oocyte+culture-based+manipulation+of+zebrafish+maternal+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).</li>
<li>Kushawah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas13d+induces+efficient+mRNA+knockdown+in+animal+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos.</a> Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).</li>
<li>Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+haploid+zebrafish+embryos+by+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51708(2014).</li>
<li>Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GFP-based+genetic+screen+reveals+mutations+that+disrupt+the+architecture+of+the+zebrafish+retinotectal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection.</a> Development. 132 (13), Cambridge, England. 2955-2967 (2005).</li>
<li>Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., Gömann, J., Dosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+Bucky+ball-GFP+transgene+visualizes+germ+plasm+in+living+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expression+Patterns%3A+GEP%22%5BJournal%5D)">A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish.</a> Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).</li>
<li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRscan%3A+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Bu makalede sunulan protokol, hem ileri hem de geri genetik teknikler için gerekli olan çoklu nesiller yerine, tek bir nesilde bir anne-etkili fenotipin tanımlanmasına ve birincil moleküler karakterizasyonuna izin vermektedir. Şu anda, annelik tarafından ifade edilen birçok genin rolü bilinmemektedir. Bu bilgi eksikliği kısmen, anne-etki genlerini tanımlarken bir fenotipi görselleştirmek için gereken ekstra üretimden kaynaklanmaktadır. Geçmişte, zebra balığında anne-etkisi genlerinin hızlı bir şekilde tanımlanması, trans...

Maternal olarak biriken ürünlerden oluşan bir havuz (örneğin, RNA'lar, proteinler ve diğer biyomoleküller), embriyonun zigotik genomu aktive edilene kadar tüm erken hücresel süreçler için gereklidir1. Bu ürünlerin oositten erken tükenmesi tipik olarak embriyonik öldürücüdür. Bu genlerin gelişimdeki önemine rağmen, annelik tarafından ifade edilen birçok genin rolü şu anda bilinmemektedir. Zebra balıklarında CRISPR-Cas9 gibi gen düzenleme teknolojisindeki ilerleme, anne tarafından eksprese edilen genlerinhedeflenmesini sağlar 2,3,4. Bununla birlikte, bir anne-etki fenotipinin tanımlanması, zigotik bir fenotiple karşılaştırıldığında ekstra bir nesil gerektirir, bu nedenle daha fazla kaynak gerektirir. Son zamanlarda, CRISPR-Cas9'un bialelik düzenleme yeteneği, "gevrekler" olarak bilinen enjekte edilen (F0) embriyoların somatik dokularındaki embriyonik fenotipleri taramak için kullanılmıştır5,6,7,8,9,10. Crispant tekniği, somatik hücrelerdeki aday genlerin kaynak verimli bir şekilde taranmasına izin verir ve gelişimdeki belirli yönlerin anlaşılmasını kolaylaştırır. Bu yazıda açıklanan protokol, anne-etki fenotiplerinin veya "maternal gevreklerin" tek bir nesil11'de tanımlanmasına izin vermektedir. Bu şema, kılavuz RNA'ları tek bir gene çoklayarak ve germ hattındaki bialelik düzenleme olaylarını teşvik ederek elde edilebilir. Bu maternal gevrek embriyolar brüt morfolojik fenotiplerle tanımlanabilir ve hücre sınırları için etiketleme ve DNA modellemesi11 gibi birincil karakterizasyona tabi tutulur. Gözlemlenebilir fenotipin ve indüklenen INDELL'lerin temel moleküler karakterizasyonunun kombine analizi, hedeflenen genin erken gelişimdeki rolünün tahmin edilmesini sağlar.
Zebra balığında, döllenme sonrası ilk 24 saat (hpf) sırasında, küçük bir hücre grubu, germ hattı12,13,14,15'in öncüsü olan ilkel germ hücrelerine dönüşür. F0 dişileri tarafından yerleştirilen debriyajlarda, geri kazanılan maternal gevrek embriyoların oranı, hedeflenen gende kaç germ hücresinin bialelik bir düzenleme olayı içerdiğine bağlıdır. Genel olarak, embriyoda düzenleme olayı ne kadar erken gerçekleşirse, germ hattında CRISPR-Cas9 mutasyonlarının gözlenme olasılığı o kadar yüksek olur. Çoğu durumda, maternal gevrek embriyoların fenotipleri, gelişmekte olan oositte bulunan iki maternal aleldeki fonksiyon kaybından kaynaklanır. Oosit mayozu bitirdiğinde, maternal alellerden biri embriyodan polar cisim yoluyla ekstrüde edilirken, diğer alel maternal pronükleusa dahil edilir. Çoklu maternal gevrek haploidlerin dizilimi, fenotip-11'e katkıda bulunan germ hattında bulunan mutasyonların (eklemeler ve / veya delesyonlar (INDEL'ler)) bir karışımını temsil edecektir.
Aşağıdaki protokol, maternal etki genlerinde CRISPR-Cas9 mutasyonları oluşturmak ve maternal crispant yaklaşımı kullanarak karşılık gelen fenotipi tanımlamak için gerekli adımları açıklamaktadır (Şekil 1). Birinci bölüm, kılavuz RNA'ların etkili bir şekilde nasıl tasarlanacağını ve oluşturulacağını açıklarken, ikinci ve üçüncü bölümler mikroenjeksiyonla maternal gevreklikler oluşturmak için kritik adımlar içermektedir. CRISPR-Cas9 karışımı enjekte edildikten sonra, enjekte edilen embriyolar PCR (bölüm dört) aracılığıyla somatik düzenlemeler için taranır. Enjekte edilen F0 embriyoları geliştikten ve cinsel olgunluğa ulaştığında, F0 dişileri vahşi tip erkeklere geçirilir ve yavruları annelik etkisi fenotipleri için taranır (beşinci bölüm). Altıncı bölüm, CRISPR-Cas9 kaynaklı INDEL'leri tanımlamak için Sanger dizilimi ile birleştirilebilen maternal gevrek haploidlerin yapımına ilişkin talimatları içermektedir. Ek olarak, Tartışma, bu yöntemin duyarlılığını ve gücünü artırmak için protokolde yapılabilecek değişiklikler içerir.

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 8.4)</td><td>Invirogen</td><td>15568025</td><td>PCR karışımı için</td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf Tüpleri</td><td>Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP'ler</td><td>Thermo Fischer Bilimsel</td><td>18427013</td><td>gRNA</td></tr><tr><td>100 BP merdiveni</td> sentezi <td>Jel elektroforezi için</td><td>Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td></tr><tr><td>%100 RNAse içermeyen etanol</td><td>Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>%100 RNAse ücretsiz etanol</td><td>Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100ml Beher</td><td>IVF için</td><td>Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td></tr><tr><td>5 M Amonyum Accetate</td><td>Thermo Fischer Bilimsel</td><td>MEGAshortscript T7 Transkripsiyon Kitinde Bulundu</td><td>gRNA Sentezi</td></tr><tr><td>% 70 etanol</td><td></td><td></td><td>gRNA sentezi (70 mL etanol + 30 mL &nbsp; nükleaz içermeyen su)</td></tr> <tr><td>Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID</td><td>FHC INC</td><td>27-30-1</td><td>Mikroenjeksiyon</td></tr><tr><td>Toplu İlaç için Sodyum Bikarbonat 35 pound</td><td>Toplu Resif Kaynağı</td><td>255</td><td>Balık malzemeleri</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>MiliporeSigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 Proteini, NLS'li</td><td>PNABio</td><td>CP01</td><td></td></tr><tr><td>ChopChop</td><td></td><td></td><td>https://chopchop.cbu.uib.no/</td></tr> <tr><td>Sabit oligonükleotid</td><td>Entegre DNA Teknolojiler (IDT)</td><td></td><td>AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC Tüp</td></tr> Bebek <tr><td>için</td><td>Depresyon Cam</td><td>Plaka Thermo Fischer Scientific</td><td>13-748B</td></tr><tr><td>Tüp Bebek Diseksiyon Forseps</td><td>Dumont</td><td>SS</td><td></td></tr><tr><td>Tüp</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Bebek için Diseksiyon Makası Güzel Bilim Araçları 14091-09Diseksiyon Steroskopu (iletilen ışık kaynağı ile)</td> <td>IVF</td>DNA Temiz ve İçin <td>Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td></tr><tr><td> Yoğunlaştırıcı -5</td><td>Zymo Research</td><td>D4014</td><td>gRNA DNA Jel Yükleme Boyasının Sentezi</td></tr><tr><td>(6x)</td> <td>Jel elektroforezi için</td> <td>Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td></tr><tr><td>EconoTaq DNA Polimeraz</td><td>Lucigen</td><td>30032-1</td><td>PCR karışımı için</td></tr><tr><td>Elektroferez Güç Kaynağı</td><td>Jel elektroforezi için</td><td>Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td></tr><tr><td>Topluluk</td><td></td><td></td><td>https://useast.ensembl.org/index.html</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Femtojet Mikroenjektör için Femtotips Mikro Yükleyici İpuçları</td><td>Thermo Fischer Mikroenjeksiyon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>için Bilimsel E5242956003 Etanol (200 geçirmez, nükleaz içermez)</td><td>Any Maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000021</td><td>Mikroenjeksiyon</td></tr><tr><td>Balık Ağı</td> için <td>Herhangi Bir Maker</td><td></td><td>Balık malzemeleri</td></tr><tr><td>Dondurulmuş Salamura Karides</td><td>Salamura Karides Doğrudan</td><td></td><td>Balık malzemeleri</td></tr><tr><td>Genel Çok Amaçlı Agaroz</td><td>Jel elektroforezi için</td><td>Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td></tr><tr><td>Gene Spesifik oligonükleotid</td><td>Entegre DNA Teknolojileri (IDT)</td><td></td> <td>TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG</td></tr><tr><td>Eldiven</td><td>Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buz Kovası</td><td>Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anında Okyanus tuzu</td><td>Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td><td>Balık malzemeleri</td></tr><tr><td>Invitrogen UltraPure Etidyum Bromür, 10 mg / mL</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15-585-011</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MiliporeSigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>MiliporeSigma</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Erkek & Dişi zebra balığı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 Transkripsiyon Kiti</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM1354</td> E3 MgCl için <td>gRNA</td></tr><tr><td>Metilen Mavisi</td><td>Thermo Fischer Bilimsel</td><td>AC414240250</td><td></td></tr> Sentezi <tr><td>2</td><td>MiliporeSigma</td><td>7791-18-6</td><td>PCR karışımı için</td></tr><tr><td>MgSO2&middot; 7H2O</td><td>MiliporeSigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon plastik kalıp</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>Mikroenjeksiyon</td>Mikromanipülatör için <td>Z-Kalıpları</td></tr><tr><td></td><td>Mikroenjeksiyon için Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td><td>Mikropipetleyiciler için</td></tr><tr><td></td><td>Herhangi Bir Maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>Filtreli mikropipetleyici uçları (tüm boyutlar)</td><td>Filtresiz herhangi bir Maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropippetter uçları (tüm boyutlar)</td><td>Mikroenjeksiyon</td> MS-222 için Herhangi bir <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrodalga Mineral Yağ</td><td>MiliporeSigma</td><td>m5904-5ml</td><td></td></tr><tr><td>(Trikain-D)</td><td>Herhangi bir Maker</td><td></td><td>FDA onaylı</td></tr><tr><td>Na2 HPO4</sub</td><td>>MiliporeSigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>MiliporeSigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHC03</td><td>MiliporeSigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>MiliporeSigma</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>Yapışmaz, RNaz İçermeyen Mikrofüj Tüpleri, 1.5 mL</td><td>Ambion</td><td>AM12450</td><td>gRNA</td></tr><tr><td>nükleaz içermeyen su</td> sentezi <td>Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kağıt</td><td>Havlu Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pastro Pipetler</td><td>Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Şerit Tüpleri</td><td>Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri Plakaları 100 mm çap</td><td>Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenol Kırmızısı çözeltisi</td><td>MiliporeSigma</td><td>P0290</td><td>Mikroenjeksiyon</td></tr><tr><td>Plastik Haşereler</td> için <td>VWR</td><td>47747-358</td><td>Tüp Bebek</td></tr><tr><td>Plastik Kaşık</td> İçin <td>Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td><td>IVF</td></tr><tr><td>Premium Sınıf Salamura Karides Yumurtaları</td><td>Salamura Karides Doğrudan</td><td></td><td>İnce Mesh</td></tr><tr><td>RNA Jel Yükleme Boyası</td><td></td><td>MEGAshortscript T7 Transkripsiyon Kitinde bulundu</td><td>Jel elektroforezi</td></tr><tr><td>için RNAse AWAY</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>21-402-178</td><td></td></tr><tr><td>Ölçek</td><td>Herhangi Bir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maker Sharpie</td><td>Herhangi Bir Maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Spatula</td><td>Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril H2O</td><td>PCR karışımı için</td><td>Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Polimeraz</td><td>NEB</td><td>M0203</td><td>gRNA Sentezi</td></tr><tr><td>Bant</td><td>Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBE (Tris-Borat-EDTA) 10x</td><td>Jel elektroforezi için</td><td>Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td></tr><tr><td>Çay Lekeleyici</td><td>Amazon</td><td>IMU-71133W</td><td>Balık malzemeleri</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Owl 12 Dişli Tarak, 1.0/1.5 mm Kalınlık, B2 için Çift Taraflı</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B2-12</td><td>Jel elektroforezi için</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; Owl EasyCast B2 Mini Jel Elektroforez Sistemleri</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>09-528-110B</td><td>Jel elektroforezi için</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Any Maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Any Maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transilluminator</td><td>Any Maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV lambası</td><td>UVP</td><td>Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201)</td> <td>IVF</td></tr><tr><td>UV güvenlik gözlükleri</td> için<td>Tüp</td>Bebek Yıkama Şişesi İçin <td>Herhangi Bir Yapıcı</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>S39015</td><td>Balık malzemeleri</td></tr><tr><td>Zebra balığı çiftleşme kutuları</td><td>Aqua Schwarz</td><td>SpawningBox1</td><td>Balık malzemeleri</td></tr><tr><td>1.5ml Eppendorf Tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-11</td><td></td></tr><tr><td>10 Molar dNTP</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>100 BP merdiven</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15628019</td><td></td></tr><tr><td>%100 RNAse içermeyen etanol</td><td>herhangi bir yapıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5m Amonyum Accetate</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>%70 Etanol</td><td></td><td></td><td>70ml etanol ve 30 ml nükleaz içermeyen su</td></tr><tr><td>Yatay Jel Kutusu için Aksesuarlar</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>0.625 mm</td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>herhangi bir yapıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2, dihidrat</td><td>Sigma</td><td>10035-04-8</td><td>E3 Orta Kılcal</td></tr><tr><td>Boru</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-03010-68</td><td>enjeksiyon iğneleri için</td></tr><tr><td>Cas9 Protein</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A36496</td><td></td></tr><tr><td>ChopChop</td><td>https://chopchop.cbu.uib.no/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Bilgisayar</td><td>herhangi bir yapımcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon Forcepts</td><td>herhangi bir maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon Mikroskobu</td><td>herhangi bir maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon Makası</td><td>herhangi bir maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA Temiz & Yoğunlaştırıcı -5</td><td>Zymo Research</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>DNA Jel Yükleme Boyası (6X)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>EconoTaq DNA Polimeraz</td><td>Lucigen</td><td>30032-1</td><td></td></tr><tr><td>Ensemble</td><td>https://useast.ensembl.org/index.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader Pipet Uçları</td><td>Fischer Scientific</td><td>10289651</td><td>20 mikrolitre</td></tr><tr><td>Etanol (200 geçirmez, nükleaz içermez)</td> <td>herhangi bir yapımcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etidyum Bromür</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>Balık Ağı</td><td>herhangi bir yapımcı</td><td></td><td>ince örgü</td></tr><tr><td>Dondurulmuş Salamura Karides</td><td>LiveAquaria</td><td>CD-12018</td><td>balık yemi</td></tr><tr><td>Jel Tarak (0.625mm)</td> <td>herhangi bir yapımcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jel Elektroferez Sistemi</td><td>herhangi bir yapımcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen Spesifik Oligonükleotid</td><td>Entegre DNA Teknolojileri (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam Kapiller İğne</td><td>Grainger</td><td>21TZ99</td><td>https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s& s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!! g!438976 780705!& gucid=N:N:PS:Ödenen :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231& gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB& gclsrc=aw.ds</td></tr><tr><td>Cam Tabaklar</td><td>herhangi bir yapıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eldiven</td><td>herhangi bir yapımcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hank'in Son Çalışma Çözümü</td><td></td><td></td><td>9.9 ml Hank's Premix'i 0.1 ml HS Stock #6 ile birleştirin</td></tr><tr><td>Hank's Premix</td><td></td><td></td><td>aşağıdakileri sırayla birleştirin: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Tüm HS Solosyonlarını 4C'de saklayın</td></tr><tr><td>Hanks Çözümü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hank'in Çözümü</td><td></td><td></td><td>https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization</td></tr><tr><td>Hank'in Stok Çözümü #1</td><td></td><td></td><td>8.0 g NaCl, 0.4 g KCl 100 ml ddH2O</td></tr><tr><td>içinde Hank'in Stok Çözümü #2</td><td></td><td></td><td>0.358 g Na2HPO4 susuz; 0.60 g K2H2PO4 içinde 100 ml ddH2O</td></tr><tr><td>Hank'in Stok Çözeltisi #4</td><td></td><td></td><td>0.72 g CaCl2 içinde 50 ml ddH2O</td></tr><tr><td>Hank'in Stok Çözeltisi #5</td><td></td><td></td><td>1.23 g MgSO47H2O 50 ml ddH20</td></tr><tr><td>içinde Hank'in Stok Çözümü #6</td><td></td><td></td><td>10.0 ml ddH20 içinde 0.35g NaHCO3; taze bir gün kullanın</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Buz Kovası</td><td>herhangi bir yapıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anında Okyanus tuzu</td>, <td>balık suyu için</td><td>herhangi bir üretici</td><td></td></tr>, <tr><td>In-Vitro Transkripsiyon Kiti, Mega Kısa Senaryo</td>, <td>Thermo Fischer, Scientific</td><td>AM1354</td><td></td></tr>, <tr><td>Invitrojen ve ticaret; UltraPure ve ticaret; DNase / RNaz İçermeyen Damıtılmış Su</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>7447-40-7</td><td>E3 Orta</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Erkek ve Dişi Zebra Balığı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mega Kısa Senaryo T7 İletim Kiti</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>metilen mavisi</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC414240250</td><td>E3 Orta</td></tr><tr><td>MgSO2-7H2O</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>Mikromikromanipülatör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon plastik kalıp</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>Z-Kalıpları</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjektör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroiğne Slayt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetleyici (1-10) uçlu</td><td>herhangi bir üreticinin</td><td></td><td>filtrelenmiş p10 uçlara ihtiyacı vardır</td></tr><tr><td>Mikropipetleyici (20-200) uçlu</td><td>herhangi bir yapıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropippetter (100-1000) uçlu</td><td>herhangi bir yapıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroplastik kaydırak</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrodalga</td><td>herhangi bir yapıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiliQ Su</td><td>herhangi bir Maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mineral yağ</td><td>sigma-aldrich</td><td>m5904-5ml</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaHC02</td><td>Sigma</td><td>223441</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>Dar Spatula</td><td>herhangi bir yapıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İğne Çektirme</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Kağıt Havlu</td><td>herhangi bir yapıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pastro Pipetler</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>PCR astar yan kılavuz sitesi</td><td>Entegre DNA Teknolojileri (IDT)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>PCR primerleri yan kılavuz RNA kesim bölgesi</td><td>Entegre DNA Teknolojileri (IDT)</td><td></td> <td>Standart tuzdan arındırılmış</td></tr><tr><td>PCR Şerit Tüpleri</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AB0771W</td><td></td></tr><tr><td>Petri Kapları</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td>10 cm çap 100mm x 15mm</td></tr><tr><td>Fenol Red</td><td>Fisher Science</td><td>S25464</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464</td></tr><tr><td>Pipet Uçları</td><td>Herhangi bir yapımcı</td><td></td><td>10ul, 200ul ve 1000ul uçlar</td></tr><tr><td>Plastik Haşereler</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-141-364</td><td></td></tr><tr><td>Plastik Kaşık</td><td>herhangi bir yapıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Astar Kılavuzu Site</td><td>Entegre DNA Teknolojileri (IDT)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Tıraş Bıçağı</td><td>Uline</td><td>H-595B</td><td></td></tr><tr><td>RNA jel</td><td>Megashort script kitinde Boya Yükleme (in vitro transciption kiti)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAse</td><td>away Fisher</td><td>21-402-178</td><td></td></tr><tr><td>RNAse içermeyen polipropilen mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400 RNAse içermeyen su</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>Herhangi</td><td>bir yapıcıyı</td><td></td><td></td>ölçeklendirin</tr><tr><td>Sharpie</td><td>herhangi bir yapıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat (hücre kültür test edildi)</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>balık suyu</td></tr><tr><td>Sodyum Bromür Solotion</td><td>Sigma</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Sanger dizileme yazılımı Analiz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril H2O</td><td>herhangi bir marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Polimeraz</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td>https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information</td></tr><tr><td>Herhangi</td><td>bir marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBE (Tris-Borat-EDTA) 10X</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B52</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52</td></tr><tr><td>Çay Lekeleyici</td><td>amazon</td><td>IMU-71133W</td><td>çoğu mutfak mağazasında mevcuttur</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipeti</td><td></td><td>Uline S-24320</td><td></td></tr><tr><td>Transilluminatör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trikain</td><td>fisher bilimsel</td><td>NC0872873</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl 7.5</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Evrensel Primer</td><td>Entegre DNA Teknolojileri (IDT)</td><td></td><td>AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC</td></tr><tr><td>UV lambası</td><td>UVP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV güvenlik gözlükleri</td><td>herhangi bir yapımcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yıkama Şişesi</td><td>fisher scientific</td><td>S39015</td><td></td></tr><tr><td>Zebra balığı çiftleşme kutuları</td><td>herhangi bir yapımcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Tampon Tarifi</td><td>171.12 mL steril H20 ekleyin; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616 mL 1M MgCl2; 2.618 mL, 1M, Tris-HCl (pH 8.4), 13.092mL, 1M KCl; 0.262 mL %1 Jelatin. 20 dakika otoklavlayın, ardından soloyu buz üzerinde soğutun. Daha sonra 3.468 mL 100mg / mL BSA ekleyin; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM); &nbsp; 0.262 mL dTTP (100 mL). Alliquote steril eppendorf tüplerine</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

maternal crispantlarla erken gelişimde annelik İfade edilen genlerin rolünün belirlenmesi

Determining the Role of Maternally-Expressed Genes in Early Development with Maternal Crispants

Erken gelişim, zigotik genom aktivasyonuna kadar gelişim için gerekli tüm hücresel fonksiyonları yerine getiren oogenez sırasında matür oosite dahil edilen maternal faktörlerin bir havuzuna bağlıdır. Tipik olarak, bu maternal faktörlerin genetik olarak hedeflenmesi, annelik etkisi fenotiplerini tanımlamak için ek bir nesil gerektirir ve bu da gelişim sırasında maternal olarak eksprese edilen genlerin rolünü belirleme yeteneğini engeller. CRISPR-Cas9'un bialelik düzenleme yeteneklerinin keşfi, enjekte edilen embriyoların veya "gevreklerin" somatik dokularındaki embriyonik fenotiplerin taranmasına izin vererek, zigotik olarak eksprese edilen genlerin gelişim programlarında oynadığı rolün anlaşılmasını arttırmıştır. Bu makalede, crispant yönteminin bir uzantısı olan bir protokol açıklanır. Bu yöntemde, germ hücrelerinin bialelik düzenlenmesi, tek bir nesilde veya "maternal gevrekler" de maternal etkili bir fenotipin izolasyonuna izin verir. RNA'ları tek bir hedefe multipleks etmek, maternal gevreklerin verimli üretimini teşvik ederken, maternal gevrek haploidlerin sekans analizi, maternal etkili bir fenotip üreten genetik lezyonları doğrulamak için basit bir yöntem sağlar. Maternal gevreklerin kullanımı, annelik tarafından ifade edilen temel genlerin hızlı bir şekilde tanımlanmasını destekler, böylece erken gelişimin anlaşılmasını kolaylaştırır.

Bu protokolde açıklanan deneysel yaklaşım, maternal etki fenotiplerinin hızlı, kaynak verimli bir şekilde tanımlanmasını sağlar (Şekil 1).
Maternal gevrekliklerin üretilmesi: Dört kılavuz RNA'yı tek bir aday anne-etki genini hedefleyecek şekilde tasarlarken, kılavuz RNA'ların DNA'ya bağlanacağı yere özel dikkat gösterilmelidir. Genel olarak, hepsi ilk tahmin edilen protein alanının başlangıcında kılavuz RNA'lar arasında en az örtüşen bölgeler v...

Erken gelişim, maternal kalıtsal ürünlere bağlıdır ve bu ürünlerin çoğunun rolü şu anda bilinmemektedir. Burada, tek bir nesilde anne-etki fenotiplerini tanımlamak için CRISPR-Cas9 kullanan bir protokol tanımladık.

Maternal Crispantlarla Erken Gelişimde Annelik İfade Edilen Genlerin Rolünün Belirlenmesi

Early development depends on a pool of maternal factors incorporated into the mature oocyte during oogenesis that perform all cellular functions necessary ...

Erken gelişim sırasında annelik tarafından eksprese edilen birçok genin rolü şu anda bilinmemektedir. Bu maternal CRISPR tekniği, maternal etki genlerinin ve gelişimdeki rollerinin hızlı bir şekilde tanımlanmasını sağlar. RNA'ları tek bir gene multipleks yönlendirmek, araştırmacıların tek bir nesilde yeni maternal etki fenotiplerini tanımlamalarını sağlar.Bu araştırma, erken embriyogenez için gerekli olan gametlerdeki mRNA transkriptlerinin işlevini anlamak için faydalıdır. Bu tekniğin anahtarı, embriyoları bir hücre aşamasının başlarında mikro enjekte etmek ve kılavuz RNA'ların çoğunluğunun enjekte edilen embriyolarda somatik mutasyonlar yapabileceğini kontrol etmektir. Her gen spesifik oligonükleotid için bir kılavuz RNA şablonu oluşturmak için, sabit oligonükleotidi analitleyin ve çıkıntıları T4 DNA polimeraz ile doldurun.Dört kılavuz RNA şablonu bir araya getirildikten sonra, bir DNA temizleme ve yoğunlaştırıcı kiti kullanarak bunları saflaştırın ve konsantre edin. Bir in-vitro T7 transkripsiyon kiti kullanarak havuzlanmış adam RNA şablonundan sgRNA karışımını sentezleyin ve makalede açıklandığı gibi in vitro transkripsiyonu gerçekleştirin. SgRNA'nın bütünlüğünü doğrulamak için, mililitre başına% 1 agaroz 0.5 mikrogram, ethidyum bromür Tris-Borate-EDTA jeli dökün.Katılaştırılmış jeli Tris-Borate-EDTA çalışma tamponuna yerleştirin. Bir mikrolitre sgRNA karışımını ve bir mikrolitre RNA jel yükleme tamponunu karıştırın. Bu numuneyi jele yükleyin ve jeli beş dakika boyunca 100 voltta çalıştırın.Ultraviyole ışık kullanarak bantları görselleştirin. Vahşi tip haçlar ve zebra balığı çiftleşme kutuları kurun. Erkek ve dişi balıkları aynı tankta tutun, ancak bir çiftleşme kutusu bölücüsü kullanarak veya burada gösterildiği gibi, dişi bir yumurtlama ekinin içine yerleştirerek ayırın.Enjeksiyon kokteyli monte edildikten sonra, çiftleşme kutusu bölücüsünü çıkararak veya burada gösterildiği gibi, erkeği dişi ile aynı yumurtlama ekine yerleştirerek erkek ve dişinin çiftleşmesine izin verin. Embriyoları senkronize etmek için, plastik bir süzgeç kullanarak 10 dakika sonra toplayın ve 1XE3 ortamı kullanarak bir Petri kabında durulayın. 10 ila 15 embriyoyu çıkarın ve enjekte edilmemiş kontroller olarak tutulmak üzere ayrı bir Petri kabına yerleştirin.Kalan embriyoları enjeksiyon plakası kuyucuklarına aktarın. Bir nanolitre protein sgRNA çözeltisini, bir hücreli embriyonun gelişmekte olan blasto diskine enjekte edin. Tıkanmış iğnenin ucunu kırmak için forseps kullanın ve bir nanolitrelik bolusu çıkarmak için iğneyi yeniden kalibre edin.Enjeksiyondan sonraki ertesi gün, enjekte edilmemiş plakadan altı sağlıklı enjeksiyonlu embriyo ve iki kontrol embriyosu toplayın. Her embriyoyu ayrı ayrı bir PCR şerit tüpünün tek bir kuyucuğuna yerleştirin ve tüplerin üstünü etiketleyin. CRISPR-Cas9 hedef bölgesini içeren 100 ila 110 baz eşleştirilmiş DNA parçasını yükseltmek için her kılavuz bölge için benzersiz tarama primerleri tasarlayın.Mümkünse, hedef siteyi güçlendirilmiş parçanın ortasına yerleştirin ve daha büyük silmelerin tanımlanmasına izin verin. Dört kılavuz hedef bölgenin her biri için, hazırlanan tek embriyogenomik DNA'nın beş mikrolitresini ve PCR karışımının 20 mikrolitresini kullanarak sekiz adet 25 mikrolitre PCR reaksiyonu ayarlayın ve hedef bölgedeki somatik mutasyonları tanımlamak için spesifik tarama primer karışımını yönlendirin. Yaklaşık 0.625 santimetre genişliğinde kuyucuklar oluşturan tarakları kullanarak% 2.5 agaroz, mililitre ethidyum bromür başına 0.5 mikrogram Tris-Borate-EDTA jeli dökün.Daha sonra katılaşmış jeli Tris-Borate-EDTA çalışma tamponu içeren elektroforez odasına yerleştirin. PCR ürününe beş mikrolitre 6X yükleme boyası ekleyin. Bu karışımın 25 mikrolitresini jele yükleyerek enjekte edilen ve kontrol edilen numunelerin aynı jel sırası üzerinde çalıştığından emin olun.Tüm numuneler yüklendikten sonra, jel kutusunun pozitif ucuna bir litre Tris-Borate-EDTA çalışma tamponu başına beş mikrolitre ethidyum bromür ekleyin. DNA yasakları çözülene veya DNA şeridin sonuna yaklaşana kadar jeli 120 voltta çalıştırın. Maternal etki fenotiplerini ve maternal CRISPR'nin embriyolarını tanımlamak için, F0 enjekte edilen dişileri vahşi tip erkeklere karşı ayarlayın ve deneyden önceki öğleden sonra standart zebra balık çiftleşme kutularında vahşi tip haçları kontrol edin.Erkek ve dişi balıkları aynı tanka yerleştirin, ancak bir çiftleşme kutusu bölücüsü ile ayırın veya dişiyi bir yumurtlama ekinin içine yerleştirin. Deneyin sabahında, çiftleşme kutusu bölücüsünü çıkararak veya erkeği dişi ile aynı yumurtlama ekine yerleştirerek erkek ve dişinin çiftleşmeye başlamasına izin verin. Yumurtlama ekini taze sistem suyu içeren yeni bir çiftleşme tankı tabanına hareket ettirerek embriyoları her 10 dakikada bir toplayın ve tankı bireysel F0 dişisini tanımlayan bir etiketle etiketleyin.Eski çiftleşme tankını alın ve embriyoları 10 dakikalık bir debriyajdan toplamak için suyu bir T-süzgeçten dökün. Aşkın bir ışık kaynağına sahip diseksiyon mikroskobu altında, her saat, ilk altı ila sekiz saat boyunca ve sonraki beş gün boyunca günlük olarak gelişim gösteren embriyoları gözlemleyin. Potansiyel maternal CRISPR embriyolarını 1XE3 ortamı içeren bir Petri kabına taşıyın ve döllenmeden 24 saat sonra morfolojik fenotip için tahlil ve döllenmeden beş gün sonra yaşayabilirlik.Deneyden önceki öğleden sonra, vahşi tip erkekleri fiziksel olarak dişilerden ayrı tutarak, bir çiftleşme kutusu bölücü kullanarak veya dişi yumurtlama ekine yerleştirerek F0 dişi çiftlerini ayarlayın. Deneyin sabahında, çiftleşmeyi başlatmak için fiziksel bölümü çıkarın. Yumurtlamanın ilk belirtisinde, erkek ve F0 dişilerini ayırarak üremeyi kesin ve her bir ayrılmış F0 dişisini ayrı çiftleşme kutularında tutun.İn-vitro fertilizasyondan sonra, maternal CRISPR fenotipi gözlenene kadar haploid embriyoların gelişmesine izin verin ve bu embriyoları farklı bir Petri kabına yerleştirin. Maternal CRISPR haploid embriyoları tanımlandıktan sonra, döllenmeden sonra en az altı saat boyunca gelişmelerine izin verin. Genomik DNA'yı en az 10 maternal CRISPR haploid embriyosundan çıkarmak için, tek bir haploid embriyoyu bir PCR şerit tüpünün ayrı bir kuyucuğuna yerleştirin, fazla E3 ortamını kuyudan çıkarın ve 50 mikrolitre 50 milimolar sodyum hidroksit ekleyin.Embriyoları 95 santigrat derecede 20 dakika boyunca inkübe edin ve dört santigrat dereceye kadar soğutun. Daha sonra pH 7.5 ile bir molar Tris-hidroklorik asitten beş mikrolitre ekleyin ve beş ila 10 saniye boyunca vorteks yapın. Hangi kılavuz bölgelerinin indeller içerdiğini belirlemek için, dört CRISPR / Cas9 hedef bölgesinin tümünü içeren bir DNA parçasını yükseltmek için dizileme primerleri tasarlayın.Hazırlanan genomik DNA'nın beş mikrolitresini ve dizileme primerlerini kullanarak embriyo başına iki adet 25 mikrolitre PCR reaksiyonu ayarlayın. PCR bittikten sonra, bir DNA temizleme ve yoğunlaştırıcı kiti kullanarak iki numuneyi saflaştırın ve konsantre edin ve DNA fragmanını ileri ve geri dizileme primerlerini kullanarak Sanger dizilemesine gönderin. Kılavuz RNA'ların hepsi, maternal CRISPR'nin üretimi sırasında kılavuz RNA'lar arasında en az örtüşen bölgeler veya hiç örtüşmeyen bölgelerle birlikte kümelenmelidir.İndels oluşturulduysa, bir agaroz jeli üzerindeki enjekte edilen numunelerde bir smear gözlenmeli, ancak enjekte edilmemiş kontrolde gözlenmemelidir. Maternal CRISPR yöntemi, rengarenk, tmi ve aura gibi bilinen maternal etki mutasyonlarını fenotoskopik için kullanılabilir. Maternal CRISPR-fenotipine katkıda bulunan genetik lezyonları tanımlamak için, UV ile tedavi edilmiş sperm ve in vitro fertilizasyon, maternal CRISPR haploidleri oluşturmak için birleştirilir.Bir haploidin oluşturulması, Sanger'ın maternal alelin dizilimini ve maternal CRISPR indellerinin tanımlanmasını sağlar. Bir maternal olmayan etki fenotipini tanımlarken, birden fazla F0 dişisinde gözlemleyebilmeniz önemlidir, çünkü fenotipin hedef dışı veya spesifik olmayan etkilerden değil, fonksiyon kaybından kaynaklanma olasılığını arttırır. Bir maternal etki fenotipi tanımlandıktan sonra, maternal CRISPR embriyoları, sinüs iskeleti veya DNA ayrışması gibi erken embriyogenezin çeşitli yönleri üzerindeki etkileri incelemek için kullanılabilir.Bu, araştırmacıların fenotipin moleküler nedenini anlamalarını sağlar. Bu yöntem, bilinmeyen maternal olarak ifade edilen genlerin işlevini tek bir nesilde doğrudan test eder, süreçleri anlamamızı hızlandırır, erken embriyogenez sırasında hareket eder.

determining-role-maternally-expressed-genes-early-development-with

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Tek bir embriyonik hücre kaderi, kalıtsal molekülleri ve / ya da hücrede gelen sinyalleri tarafından etkilenebilir. Klivaj dönemi Xenopus embriyosunun kaderi haritaları kullanarak, tek blastomer hücre-hücre etkileşimleri karşı kalıtsal molekül katkıları değerlendirmek için izole kültür için tespit edilebilir.

Blastomer Eksplantlarından Embriyonik gelişim sırasında Hücre Kader Taahhüt Test Etmek için

Xenopus laevis immatür oositlerini manipüle etme, oositlerin yumurtalara in vitro olgunlaşması ve intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu yöntemlerini açıklıyoruz. Bu protokol, bazı maternal proteinlerin bozulmasına ve döllenmede ilgilenilen genlerin aşırı ekspresyonuna izin verir ve bu nedenle erken embriyonik gelişimde spesifik faktörlerin rollerini incelemek için değerlidir.

Manipülasyon ve<em&gt; İn Vitro</emVe&gt; Olgunlaşma<em&gt; Xenopus laevis</emIntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu izledi&gt; oositler, Embriyonik Geliştirme Çalışması

Bu protokol Fare preimplantasyon embriyolar soy özellikleri çalışma protein ekspresyonu in situ analiz kantitatif, tek hücreli gerçekleştirmek için bir yöntem sunmaktadır. blastosist toplanması için gerekli işlemler, proteinlerin immunofluorescent algılama tüm montaj, bir konfokal mikroskop ve nükleer segmentasyon ve görüntü analizi örneklerin görüntüleme açıklanmıştır.

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

Anne gen ürünlerinin işlenmesi için kullanılan zebra balığı oositlerin in vitro olgunlaşması için optimize edilmiş bir protokol burada sunulmuştur.

Kullanılması Anne Gen Ürünlerinin Fonksiyonel Manipülasyonu<em&gt; İn Vitro</emZebra balığı&gt; Oosit Olgunlaştırma

Geleneksel işlev kaybı çalışmalar nakavt hayvanlar kullanarak genlerin kez pahalı ve zaman alıcı olmuştur. Somatik mutagenesis CRISPR-aracılı Elektroporasyon tabanlı gen içinde vivoişlevleri anlamak için güçlü bir araçtır. Burada, nakavt fenotipleri beyincik Proliferasyona hücrelerdeki analiz etmek için bir yöntem raporu.

CRISPR-aracılı kaybı serebellar granül işlev analizinin gen transferi Elektroporasyon tabanlı rahim içinde kullanarak hücreleri

Bu çalışma, embriyogenezin 80-100 C.'de eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesine olanak tanıyan yarı-yüksek iş letme protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için görüntü işleme ve görselleştirme araçları dahildir. Bu yöntemlerin özel muhabir suşları ile birleşimi embriyogenezin ayrıntılı olarak izlenmesini sağlar.

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

Erken fare embriyolarında mikroRNA'ların profilini çıkarmak için bir teknik tanımladık. Bu protokol, düşük hücre girişi ve küçük RNA zenginleştirme zorluğunun üstesinden gelebiliyor. Bu tsay erken fare embriyofarklı hücre soylarında zaman içinde miRNA ifade değişiklikleri analiz etmek için kullanılabilir.

Erken Fare Embriyolarından Sıralama için Küçük RNA Kütüphanelerinin Hazırlanması

Burada, immün yetmetik farelerin deri ve ağız boşluğundaki çeşitli genlerin işlevlerini aynı anda değerlendirmek için utero embriyonik lentiviral enjeksiyonlarda ultrason güdümlü ultrason güdümlü kullanarak hızlı ve doğrudan bir in vivo CRISPR / Cas9 tarama metodolojisini açıklıyoruz.

Fare Derisi ve Ağız Boşluğundaki Gen İşlevlerini Aynı Anda Değerlendirmek için Vivo CRISPR/Cas9 Taraması

Burada, fare plasentasındaki kritik gelişim yollarını in vivo olarak etkili bir şekilde manipüle etmek için zamana özgü bir yöntem açıklıyoruz. Bu, embriyonik gün 12.5'te CRISPR plazmidlerinin hamile barajların plasentalarına enjeksiyonu ve elektroporasyonu yoluyla gerçekleştirilir.

Fare In Vivo Plasental Hedefli CRISPR Manipülasyonu

Burada, sgRNA ekspresyon kasetlerinin Tol2 aracılı iletimi ile kararlı bir zpc:cas9 knock-in hattını birleştiren maternal mutant üretmek için bir protokol açıklıyoruz.

zpc:cas9 knock-in zebra balığı kullanılarak maternal mutantların üretilmesi

Makale, erken gebeliksel iltihabın nörogelişim üzerindeki etkilerini incelemek için kapsamlı bir protokol sunar; bu model, güvenilirlik ve tekrarlanabilirliği sağlamak için temel metrikleri içerir.

Nörogelişim üzerindeki prenatal iltihabı değerlendirmek için erken gebeliksel anne immün aktivasyon fare modelinin oluşturulması

Öğrenin maternal CRISPR tekniğiyle erken embriyonik gelişimde anne etkili genleri hızlıca belirlemeyi. Bu yöntem, tek nesilde yeni fenotipler keşfederek gelişim biyolojisi araştırmalarına katkı sağlar.

Maternal Crispantlarla Erken Gelişimde Annelik İfade Edilen Genlerin Rolünün Belirlenmesi

Daha fazla video keşfet