Name: Geçici İfade Sistemi Kullanarak Memeli Hücrelerinde Tam Boy İnsan Huntingtin Varyantlarının Verimli ve Ölçeklenebilir Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Keşfedin tam boy Huntingtin protein varyantlarının HEK293 hücrelerinde üretim yöntemini. Bu protokol, Huntington hastalığı araştırmaları için yüksek saflıkta protein sağlar ve güvenilir sonuçlar elde edilmesini destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

HTT'nin MS analizini yaptıkları için Buffalo'daki New York Eyalet Üniversitesi Farmasötik Bilimler Bölümü'ne teşekkür ederiz. Bu çalışma, CHDI Vakfı ile işbirliğine dayalı bir çabaydı. Elizabeth M. Doherty'ye özellikle teşekkür ederiz; Ignacio Munoz-Sanjuan; Douglas Macdonald, CHDI Vakfı; ve Rory Curtis, Curia, bu el yazmasının hazırlanması sırasındaki paha biçilmez katkıları için. Michele Luche, Mithra Mahmoudi ve Stephanie Fox'a da bu araştırma çabasına verdikleri destek için minnettarız.

<ol><li>Walker, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease.</a> Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).</li>
<li>McColgan, P., Tabrizi, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+a+clinical+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: a clinical review.</a> European Journal of Neurology. 25 (1), 24-34 (2018).</li>
<li>Duyao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trinucleotide+repeat+length+instability+and+age+of+onset+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Trinucleotide repeat length instability and age of onset in Huntington's disease.</a> Nature Genetics. 4 (4), 387-392 (1993).</li>
<li>MacDonald, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington%27s+disease+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li>
<li>Nasir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+Huntington%27s+disease+gene+results+in+embryonic+lethality+and+behavioral+and+morphological+changes+in+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the Huntington's disease gene results in embryonic lethality and behavioral and morphological changes in heterozygotes.</a> Cell. 81 (5), 811-823 (1995).</li>
<li>Dragatsis, I., Levine, M. S., Zeitlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Hdh+in+the+brain+and+testis+results+in+progressive+neurodegeneration+and+sterility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Hdh in the brain and testis results in progressive neurodegeneration and sterility in mice.</a> Nature Genetics. 26 (3), 300-306 (2000).</li>
<li>Anne, S. L., Saudou, F., Humbert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+huntingtin+by+cyclin-dependent+kinase+5+is+induced+by+DNA+damage+and+regulates+wild-type+and+mutant+huntingtin+toxicity+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of huntingtin by cyclin-dependent kinase 5 is induced by DNA damage and regulates wild-type and mutant huntingtin toxicity in neurons.</a> Journal of Neuroscience. 27 (27), 7318-7328 (2007).</li>
<li>Dietrich, P., Johnson, I. M., Alli, S., Dragatsis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+huntingtin+in+the+adult+mouse+leads+to+progressive+behavioral+deficits%2C+bilateral+thalamic+calcification%2C+and+altered+brain+iron+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Elimination of huntingtin in the adult mouse leads to progressive behavioral deficits, bilateral thalamic calcification, and altered brain iron homeostasis.</a> PLoS Genetics. 13 (7), 1006846(2017).</li>
<li>Dragatsis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+early+embryonic+deletion+of+huntingtin+from+pyramidal+neurons+on+the+development+and+long-term+survival+of+neurons+in+cerebral+cortex+and+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Effect of early embryonic deletion of huntingtin from pyramidal neurons on the development and long-term survival of neurons in cerebral cortex and striatum.</a> Neurobiology of Disease. 111, 102-117 (2018).</li>
<li>Benn, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+modulates+transcription%2C+occupies+gene+promoters+in+vivo%2C+and+binds+directly+to+DNA+in+a+polyglutamine-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Huntingtin modulates transcription, occupies gene promoters in vivo, and binds directly to DNA in a polyglutamine-dependent manner.</a> Journal of Neuroscience. 28 (42), 10720-10733 (2008).</li>
<li>Saudou, F., Humbert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The biology of huntingtin.</a> Neuron. 89 (5), 910-926 (2016).</li>
<li>Davies, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+neuronal+intranuclear+inclusions+underlies+the+neurological+dysfunction+in+mice+transgenic+for+the+HD+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of neuronal intranuclear inclusions underlies the neurological dysfunction in mice transgenic for the HD mutation.</a> Cell. 90 (3), 537-548 (1997).</li>
<li>DiFiglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+huntingtin+in+neuronal+intranuclear+inclusions+and+dystrophic+neurites+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain.</a> Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).</li>
<li>Gutekunst, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+neuropil+aggregates+in+Huntington%27s+disease%3A+Relationship+to+neuropathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nuclear and neuropil aggregates in Huntington's disease: Relationship to neuropathology.</a> Journal of Neuroscience. 19 (7), 2522-2534 (1999).</li>
<li>Hodgson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+YAC+mouse+model+for+Huntington%27s+disease+with+full-length+mutant+huntingtin%2C+cytoplasmic+toxicity%2C+and+selective+striatal+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A YAC mouse model for Huntington's disease with full-length mutant huntingtin, cytoplasmic toxicity, and selective striatal neurodegeneration.</a> Neuron. 23 (1), 181-192 (1999).</li>
<li>Hoffner, G., Djian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+aggregation+in+Huntington+disease%3A+does+structure+determine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine aggregation in Huntington disease: does structure determine toxicity.</a> Molecular Neurobiology. 52 (3), 1297-1314 (2015).</li>
<li>Waldvogel, H. J., Kim, E. H., Tippett, L. J., Vonsattel, J. P. G., Faull, R. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropathology+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Behavioral+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The neuropathology of Huntington's disease.</a> Current Topics in Behavioral Neurosciences. 22, 33-80 (2014).</li>
<li>Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+conformation+of+polyglutamine+track+revealed+by+a+crystal+structure+of+huntingtin+N-terminal+region+with+insertion+of+three+histidine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Beta conformation of polyglutamine track revealed by a crystal structure of huntingtin N-terminal region with insertion of three histidine residues.</a> Prion. 7 (3), 221-228 (2013).</li>
<li>Hoop, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+exon+1+fibrils+feature+an+interdigitated+%CE%B2-hairpin-based+polyglutamine+core%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Huntingtin exon 1 fibrils feature an interdigitated β-hairpin-based polyglutamine core.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1546-1551 (2016).</li>
<li>Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intein-based+strategy+for+the+production+of+tag-free+huntingtin+exon+1+proteins+enables+new+insights+into+the+polyglutamine+dependence+of+Httex1+aggregation+and+fibril+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An intein-based strategy for the production of tag-free huntingtin exon 1 proteins enables new insights into the polyglutamine dependence of Httex1 aggregation and fibril formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).</li>
<li>Seong, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+facilitates+polycomb+repressive+complex+2%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin facilitates polycomb repressive complex 2.</a> Human Molecular Genetics. 19 (4), 573-583 (2009).</li>
<li>Li, W., Serpell, L. C., Carter, W. J., Rubinsztein, D. C., Huntington, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+full-length+human+huntingtin%2C+an+elongated+HEAT+repeat+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of full-length human huntingtin, an elongated HEAT repeat protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (23), 15916-15922 (2006).</li>
<li>Vijayvargia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin%27s+spherical+solenoid+structure+enables+polyglutamine+tract-dependent+modulation+of+its+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Huntingtin's spherical solenoid structure enables polyglutamine tract-dependent modulation of its structure and function.</a> eLife. 5, 11184(2016).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+production+in+human+cells+and+biochemical+characterization+of+full-length+normal+and+mutant+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Scalable production in human cells and biochemical characterization of full-length normal and mutant huntingtin.</a> PLoS ONE. 10 (3), 0121055(2015).</li>
<li>Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cryo-electron+microscopy+structure+of+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The cryo-electron microscopy structure of huntingtin.</a> Nature. 555 (7694), 117-120 (2018).</li>
<li>Harding, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+characterization+of+mutant+and+wildtype+huntingtin+proteins+produced+from+a+toolkit+of+scalable+eukaryotic+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Design and characterization of mutant and wildtype huntingtin proteins produced from a toolkit of scalable eukaryotic expression systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (17), 6986-7001 (2019).</li>
<li>Harding, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAP40+orchestrates+huntingtin+structure+for+1+differential+interaction+with+polyglutamine+2+expanded+exon+1%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">HAP40 orchestrates huntingtin structure for 1 differential interaction with polyglutamine 2 expanded exon 1.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+polyQ+expansion+does+not+alter+the+conformation+of+the+Huntingtin-HAP40+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Pathological polyQ expansion does not alter the conformation of the Huntingtin-HAP40 complex.</a> Structure. 29 (8), 804-809 (2021).</li>
<li>Colin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+phosphorylation+acts+as+a+molecular+switch+for+anterograde%2Fretrograde+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Huntingtin phosphorylation acts as a molecular switch for anterograde/retrograde transport in neurons.</a> EMBO Journal. 27 (15), 2124-2134 (2008).</li>
<li>Thompson, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKK+phosphorylates+Huntingtin+and+targets+it+for+degradation+by+the+proteasome+and+lysosome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IKK phosphorylates Huntingtin and targets it for degradation by the proteasome and lysosome.</a> Journal of Cell Biology. 187 (7), 1083-1099 (2009).</li>
<li>Ratovitski, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+%28PTMs%29%2C+identified+on+endogenous+Huntingtin%2C+cluster+within+proteolytic+domains+between+HEAT+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications (PTMs), identified on endogenous Huntingtin, cluster within proteolytic domains between HEAT repeats.</a> Journal of Proteome Research. 16 (8), 2692-2708 (2017).</li>
<li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+western+blot+data%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A defined methodology for reliable quantification of western blot data.</a> Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).</li>
<li>Tarazona, M. P., Saiz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+SEC%2FMALS+experimental+procedures+and+theoretical+analysis+for+studying+the+solution+properties+of+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Combination of SEC/MALS experimental procedures and theoretical analysis for studying the solution properties of macromolecules.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 56 (1-3), 95-116 (2003).</li>
<li>Folta-Stogniew, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomeric+states+of+proteins+determined+by+size-exclusion+chromatography+coupled+with+light+scattering%2C+absorbance%2C+and+refractive+index+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors.</a> Methods in Molecular Biology. 328, Clifton, N.J. 97-112 (2006).</li>
<li>McMeekin, T. L., Wilensky, M., Groves, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractive+indices+of+proteins+in+relation+to+amino+acid+composition+and+specific+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Refractive indices of proteins in relation to amino acid composition and specific volume.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7 (2), 151-156 (1962).</li>
<li>Atwal, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+has+a+membrane+association+signal+that+can+modulate+huntingtin+aggregation%2C+nuclear+entry+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity.</a> Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).</li>
<li>Kegel-Gleason, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+interactions+with+membrane+phospholipids%3A+Strategic+targets+for+therapeutic+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Huntington%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Huntingtin interactions with membrane phospholipids: Strategic targets for therapeutic intervention.</a> Journal of Huntington's Disease. 2 (3), 239-250 (2013).</li>
<li>Michalek, M., Salnikov, E. S., Werten, S., Bechinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+interactions+of+the+amphipathic+amino+terminus+of+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane interactions of the amphipathic amino terminus of huntingtin.</a> Biochemistry. 52 (5), 847-858 (2013).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Nissley, D. A., O'Brien, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+co-translational+processing+plays+a+role+in+huntington%27s+pathogenesis-A+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Altered co-translational processing plays a role in huntington's pathogenesis-A hypothesis.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 54(2016).</li>
<li>Kumar, N., Gammell, P., Clynes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+control+strategies+to+improve+productivity+and+survival+during+CHO+based+production+culture%3A+A+summary+of+recent+methods+employed+and+the+effects+of+proliferation+control+in+product+secreting+CHO+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Proliferation control strategies to improve productivity and survival during CHO based production culture: A summary of recent methods employed and the effects of proliferation control in product secreting CHO cell lines.</a> Cytotechnology. 53 (1-3), 33-46 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar bu makalenin içeriği ile çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Burada, immünoassay ve MS tahlili gelişimi, batı leke analizi kontrolleri ve yapı-fonksiyon çalışmaları için standartlar olarak kullanılmak üzere uygun saflık ve homojenliğe sahip çoklu FL HTT protein yapıları üretmek için geçici bir transfeksiyon, ekspresyon ve saflaştırma yöntemi tanımlamaktayız. Bu geçici ifade yöntemi ölçeklenebilir ve çok yönlüdür ve kullanıcının daha önce21,22,23,24 açıklanan kararlı hücre hatları veya virüs tabanlı yöntemler kullanmaktan daha verimli bir şekilde düşük miligramlık FL HTT varyantları üretmesini sağlar. Rutin olarak, plazmid oluşturulduktan sonra geçici ekspresyon yöntemi kullanılarak bir haftadan kısa sürede çalıştırılan 2 L ölçekli bir protein üretiminden 2-5 mg yüksek saflaştırılmış FL HTT üretilebilir ve hücre kültürünün litresi başına tipik 1-2.5 mg FL HTT verimi elde edilebilir.
Burada açıklanan geçici ekspresyon yöntemi, hücre hatlarını oluşturmak için gereken uzun süre ve kararlı hücre hatlarının depolanması ve korunmasındaki zorluklar gibi kararlı hücre hattı ekspresyonundaki birçok engelin üstesinden gelir. PEI ayrıca piyasadaki diğer transfeksiyon reaktiflerine kıyasla nispeten ucuzdur ve bu da büyük ölçekli transfeksiyonu ekonomik olarak uygulanabilir kılar. Protokolde sınırlamalar da vardır: transfeksiyon verimliliği büyük ölçüde plazmidlerin kalitesine, optimal hücre büyümesine ve PEI'nin ne kadar iyi depolandığına ve hazırlandığına bağlıdır. Operatörlerin, protein veriminde ciddi bir düşüşü önlemek için bu kritik adımlarda özel dikkat göstermeleri ve kalite kontrolleri yapmaları gerekir. Protokolde kullanılan Anti-FLAG reçinesi de nispeten pahalıdır ve birkaç saflaştırma ve rejenerasyondan sonra FL HTT'nin daha az yakalandığını gösterir. Bazı araştırmacılar, afinite reçinesinin daha sağlam bir şekilde yenilenmesini sağlamak için farklı bir etikete geçmeyi daha pratik bulabilirler.
FL HTT ekspresyon seviyelerini optimize etmek için çeşitli hücre çizgileri ve ekspresyon koşulları test edildi. HEK293 hücreleri, proteinin yüksek ekspresyonu ve süspansiyon kültürü formatında kullanım kolaylığı nedeniyle FL HTT ekspresyonu için seçildi ve bu da yöntemi çalkalayıcılarda veya biyoreaktörlerde büyük ölçekli ekspresyon için uygun hale getirdi. Daha yüksek bir FL HTT protein ekspresyon seviyesi, 37 ° C'lik geleneksel sıcaklık yerine 32 ° C gibi daha düşük kültür sıcaklıklarında elde edilebilir. Düşük sıcaklığın protein sentezini yavaşlatması ve FL HTT40'ın doğru katlanmasını teşvik etmesi mümkündür. Bununla birlikte, bu fenomen FL HTT'ye veya test edilen hücre hatlarına özgü değildir. İndirgenmiş posttransfeksiyon sıcaklığı, CHO hücrelerinde farmasötik protein ekspresyonunda yaygın olarak kullanılmaktadır. Mekanizma tam olarak anlaşılamamış olsa da, düşük sıcaklıkların G1 fazındaki hücre döngüsünü durdurduğu ve hücresel enerjiyi protein üretimine yönlendirdiği düşünülmektedir41.
Memeli hücrelerinden saflaştırılan tam uzunlukta HTT, şaperon Hsp7024 ile birlikte süzülür ve Mg-ATP yıkama adımları Hsp70 proteinini kaldırabilir. İlginç bir şekilde, birlikte salınan Hsp70, bir böcek hücre ekspresyon sistemi21,22,23'ten saflaştırılmış FL HTT'de gözlenmez. Bu, FL HTT'nin PTM'lerindeki bir farkı veya memeli ve böcek hücrelerinde FL HTT'nin aşırı ekspresyonuna ısı şoku proteini tepkilerini yansıtabilir. Rekombinant protein Hsp70'ten sıyrıldıktan sonra, FL HTT'nin monomerik formunu stabilize etmek için CHAPS veya DDM gibi iyonik olmayan deterjanlar gereklidir.
FL HTT varyantlarının oligomerizasyon durumları Blue Native PAGE ve SEC-MALS kullanılarak analiz edildi. Dimerik ve yüksek dereceli oligomerik HTT'nin küçük bir kısmı, Blue Native PAGE veya SEC-MALS tarafından analiz edildiğinde mevcuttu. Not olarak, FL HTT tarafından oluşturulan daha yüksek dereceli oligomerlerin poliQ uzunluğu ile ilişkili görünmediği görülmektedir ve Exon1 silme mutantı bile benzer bir oligomer-dimer-monomer oranı göstermektedir. Bu yapılar arasındaki oligomer içeriğindeki gerçek farklılıklar muhtemelen her partinin üretimi ve işlenmesindeki küçük farklılıklardan kaynaklanmaktadır. HTT Exon140,41 tarafından oluşturulan agregaların ve fibrillerin aksine, FL HTT'nin daha yüksek dereceli oligomerleri çözünür kaldı ve SEC ve Native PAGE tarafından analiz edilebildi.
Saflaştırılmış monomerik FL HTT sadece nispeten kararlıdır. 4 ° C'de uzun süreli depolama, oda sıcaklığında kısa inkübasyonlar veya 1 mg / mL'> konsantrasyonlar, monomerik FL HTT'yi, bu koşullar altında gözlemlenen görünür bir yağış olmamasına rağmen, dimerik ve daha yüksek dereceli oligomerik formlara dönüştürecektir. ≤1 mg / mL'de tutulan saflaştırılmış monomerik FL HTT, daha önce tarif edildiği gibi depolama tamponunda (50 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl,% 5 v / v gliserol,% 0.5 w / v CHAPS ve 5 mM DTT) -80 ° C'de nispeten sabit kalmıştır24. Bu şekilde hazırlanan ve depolanan FL HTT'nin 6 adede kadar donma-çözülme döngüsü, proteinin gözle görülür bir şekilde çökelmesine neden olmadı, ancak SEC-MALS tarafından daha yüksek oligomerik duruma hafif bir kayma gözlendi (Ek Şekil S2). Örnekler ayrıca tekrarlanan donma-çözülme döngülerini takiben SDS PAGE ile analiz edildi. Görünür çökelti gözlenmedi; SDS-PAGE tarafından agrega veya ek bozunma ürünü görülmemiştir (Ek Şekil S3). Saflaştırılmış FL HTT'nin uzun vadeli stabilitesi hala araştırılmaktadır. Kesin uzun vadeli verilerin yokluğunda, saflaştırılmış FL HTT'yi -80 ° C'de 6 aydan fazla olmamak üzere saklamanızı öneririz.
Yüksek kaliteli, rekombinant FL HTT protein varyantları ve bunları üretme yöntemleri, HD araştırma topluluğu tarafından yüksek talep görmektedir. Bu proteinler immünoassay ve MS analitik standartları olarak, yapısal çalışmalarda ve yeni FL HTT-spesifik testlerin geliştirilmesi için kullanılmaktadır. Burada açıklanan büyük ölçekli geçici ekspresyon yöntemleri, HTT çalışmaları için gerekli araçları sağlayan% >95 saflıkta FL HTT varyantlarının miligram miktarlarını tutarlı bir şekilde üretmiştir. HD araştırmalarını desteklemek için onlarca miligram yüksek saflığa sahip FL HTT polyQ varyantlarının ve diğer mutantların üretimi rutin hale gelmiştir.

Huntington hastalığı (HD), esas olarak kararsız ve istemsiz motor hareketin yanı sıra kişilik değişiklikleri ve ilgisizlik gibi bilişsel ve psikiyatrik değişikliklerle karakterize nadir görülen bir nörodejeneratif hastalıktır 1,2. HD, huntingtin geninin (HTT) ekzon 1'inde bulunan CAG tekrarlama yolunun 35'ten fazla tekrara genişlemesi ile ilişkilidir ve hastalığın daha erken bir başlangıcı ile ilişkili daha fazla sayıda CAG tekrarı 3,4'tür. HTT'nin translasyonel ürünü olan huntingtin proteini (HTT), nöronal canlılık ve beyin gelişimi 5,6,7,8,9 ile ilişkilidir.
HTT, çok çeşitli hücresel süreçlere, vezikül transportuna, hücre bölünmesine, siliyogeneze ve otofajiye katıldığı bildirilen bir iskele proteinidir10,11. Bununla birlikte, HD'nin moleküler patogenezi tam olarak açık değildir ve poliQ-genleşmiş mHTT'nin patolojik etkisine aracılık eden anahtar protein ara aktörlerinin tanımlanması eksiktir. Bazı araştırmalar, genişlemiş HTT proteininin oligomerizasyon eğilimi tarafından yönlendirilen mHTT'den toksik fonksiyon kazanımını önermektedir, çünkü HTT agregaları HD hastalarında nöronlarda ve glialarda ve hastalığın hayvan modellerinde tanımlanmıştır 12,13,14,15,16,17 . FL HTT ve mHTT varyantlarının fonksiyon ve yapısının araştırılmasını hızlandırmak ve araştırmacılara tahlil geliştirme için yüksek kaliteli protein standartları sağlamak için, sağlam ve ölçeklenebilir bir homojen rekombinant protein tedarikine ihtiyaç vardır.
Büyüklüğü (aa 1-3.144, poliQ uzunluğu Q23'e göre numaralandırma), proteolitik instabilite ve agrega eğilimi nedeniyle, FL HTT'nin çözünür bir protein olarak ifade edilmesinin ve izole edilmesinin zor olduğu kanıtlanmıştır. Daha önce, HTT'nin ekzon 1 bölgesi (aa 2-90), Escherichia coli 18,19,20'deki proteinin çözünürlüğünü artırabilen çeşitli etiketler kullanılarak büyük ölçekte ifade edilmiş ve saflaştırılmıştır. FL HTT ilk olarak bakülovirüs 21,22 kullanılarak bir böcek hücresi ekspresyon sisteminde eksprese edildi ve saflaştırıldı ve kimyasal olarak çapraz bağlı FL Q23-HTT ve Q78-HTT'nin düşük çözünürlüklü 30 şelektron mikroskobu (EM) yapıları23 rapor edildi. HTT yapısının araştırılması, kararlı hücre hatları veya adenovirüs ekspresyonsistemleri 24 kullanılarak insan hücrelerinde doğal posttranslasyonel modifikasyonlar (PTM'ler) ile FL Q17, Q46 ve Q128-HTT üretimi elde edildiğinde daha da ilerlemiştir. Bu çalışmalar, saflaştırılmış HTT'nin esas olarak monomerik durumda bulunmasına rağmen, aynı zamanda yüksek dereceli oligomerler ve agregalar oluşturma eğiliminde olduğunu göstermektedir.
FL Q128-HTT'nin oldukça genişlemiş bir poliQ bölgesi ile analitik ultrasantrifüjlenmesi, genişlememiş poliQ bölgesi24'e sahip proteinden daha fazla oligomerik ve agrega fraksiyonu sağladı. Kararlı bir hücre hattı kullanılarak, etkileşim ortağı HAP40 ile birlikte ekspresyon yoluyla FL HTT'yi stabilize etmek için bir strateji başarıyla uyarlanmıştır. FL HTT ve HAP40 kompleksinin kriyo-EM yapısı, saflaştırılmış protein kompleksi (PDB: 6EZ8)25 kullanılarak ortalama 4 şçözünürlükte çözülmüştür. Bu birlikte ekspresyon stratejisi bir bakülovirüs sistemine başarıyla uyarlanmıştır ve farklı poliQ uzunluklarına sahip bir dizi yüksek kaliteli HTT varyantı böcek hücrelerinden eksprese edilmiş ve saflaştırılmıştır26. O zamandan beri, HTT kompleksinin değişken poliQ uzunluklarına ve HAP40 ve daha yüksek çözünürlüklü yapılara sahip daha fazla kriyo-EM yapısı çözüldü ve Protein Veri Tabanı27,28'de (PDB: 7DXK, 7DXH, 6X9O) biriktirildi.
FL HTT'nin hızlı geçici ekspresyonu için HEK293 hücrelerinde polietilenimin (PEI) kullanarak bir transfeksiyon ve ekspresyon yöntemini optimize ettik. Bir prensip kanıtı olarak, 23 glutamin (FL Q23-HTT) içeren FL HTT varyantları ilk önce saflaştırıldı ve daha önce tarif edilen bir saflaştırma yönteminin modifikasyonu kullanılarak karakterize edildi24. Bu geçici transfeksiyon yöntemi kullanışlı, yüksek verimli ve ölçeklenebilirdir; 1-2 mg / L verim ile saflaştırılmış HTT üretebilir,24 bildirilen kararlı hücre hattı yöntemiyle karşılaştırılabilir. Protein bir insan hücre hattında üretildiğinden, üretilen HTT'nin kütle spektrometrisi proteomik analizine tabi tutulduğunda yerli insan PTM'lerine sahip olma olasılığı daha yüksektir 11,29,30,31. FL HTT'nin FL Q48-HTT, FL Q73-HTT ve ekzon1-silinmiş (ΔExon1-HTT) varyantlarının miligram miktarları üretildi ve geçici ekspresyon yönteminin, üretim için kararlı hücre hatları oluşturmak için gereken zaman alıcı çabaya bağlı kalmadan HTT'nin alternatif varyantlarının hızla üretilmesinde özellikle yararlı olduğunu gösterdi.
Aşağıdaki protokol, bu yazarların laboratuvarında hücre kültürü, transfeksiyon, protein saflaştırma ve 2 L hücre kültüründen FL Q23-HTT üretmek için saflaştırma sonrası protein karakterizasyonu için kullanılan standart yöntemi örneklemektedir. Protokol daha büyük kültürlere ölçeklendirilebilir veya diğer HTT varyantlarını saflaştırmak için uyarlanabilir. FL HTT'nin 10 L'ye kadar hücre kültürü ve HTT ve HTT homologlarının çeşitli bölge veya kesme mutasyonları aynı protokol kullanılarak laboratuvarda başarıyla gerçekleştirilmiştir. Saflaştırılmış FL HTT, dimerler ve daha yüksek dereceli oligomerlerle birlikte yüksek oranda monomer içerir. Aynı toplama profili, üretilen değişkenler arasında da gözlenir (Q23, Q48, Q73 ve silinmiş Exon1). Uygun bakım yapılmadığında agregasyon meydana gelebileceğinden, protein kullanımı için en iyi koşulları belirlemek için bir formülasyon ve donma-çözülme stabilitesi çalışması yapılmıştır. Blue Native PAGE ve SEC/MALS-RI gibi yöntemler, HTT oligomer içeriğini kalite kontrol sürecinin bir parçası olarak analiz etmek için de açıklanmaktadır. HD araştırma topluluğuna fayda sağlamak için, bu çalışmada açıklanan plazmidler ve HTT proteinleri de Coriell Enstitüsü'ndeki HD Topluluk Deposunda (www.coriell.org/1/CHDI) biriktirilmiştir.

<table><tbody><tr><td>100 kDa yoğunlaştırıcı-Amicon</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td>Protokolü Bölüm Numarası-6.2.4</td></tr><tr><td>20x mavi yerel PAGE çalışan arabellek</td><td>Invitrogen</td><td>BN2001</td><td>Protokolü Bölüm Numarası-8.1</td></tr><tr><td>20x TBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI28358</td><td>Protokolü Bölüm Numarası-5.1</td></tr><tr><td>4x mavi yerel PAGE örnek tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>BN2003</td><td>Protokolü Bölüm Numarası-8.3</td></tr><tr><td>4x LDS yükleme tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td>Protokol Bölüm Numarası-5.3</td></tr><tr><td>5 L Erlenmeyer şişeleri</td><td>Corning</td><td>431685</td><td>Protokolü Bölüm Numarası-4.2</td></tr><tr><td>Agaroz jel ekstraksiyon kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Protokol Bölüm Numarası-2.2</td></tr><tr><td>Topaklanma önleyici ajan</td><td>Thermo Fisher</td><td>0010057AE</td><td>Protokol Bölüm Numarası-4.8</td></tr><tr><td>anti-FLAG M2 afinitesi jel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td>Protokolü Bölüm No.1.1</td></tr><tr><td>anti-FLAG M2</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td>Protokolü Bölüm No-5.7</td></tr><tr><td>Anti köpük-Excell anti köpük</td><td>Sigma</td><td>59920C-1B</td><td>Protokolü Bölüm No-4.8</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A6419</td><td>Protokolü Bölüm No-6.1.4.4</td></tr><tr><td>BEH 450 SEC</td><td>Sular</td><td>186006851</td><td>2.5 ve mikro; m x 4,6 mm x 150 mm Protokol Bölüm Numarası-7.3</td></tr><tr><td>mavi yerel SAYFA %5 G-250 numune katkı maddesi</td><td>Invitrogen</td><td>BN2004</td><td>Protokolü Bölüm No-8.3</td></tr><tr><td>karbenisilin</td><td>Thermo Fisher</td><td>10177012</td><td>Protokolü Bölüm No-2.5</td></tr><tr><td>santrifüj - Sorvall Lynx 6000</td><td>Thermo Fisher</td><td>75006590</td><td>Protokolü Bölüm No: 6.1.3</td></tr><tr><td>Hücre Sayacı - ViCELL</td><td>BECKMAN COULTER</td><td></td><td>Protokol Bölüm No.-4.3</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Anatrace</td><td>C316S</td><td>Protokol Bölüm No.-6.1.4.6</td></tr><tr><td>Yetkili E. coli hücreleri-TOP10</td><td>İnvitrojen</td><td>C404010</td><td>Protokol Bölüm No-2.4</td></tr><tr><td>digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Protokol Bölüm No-5.1</td></tr><tr><td>Diferansiyel Kırılma İndeksi Dedektörü</td><td>Wyatt</td><td></td><td>Protokolü Bölüm No-7.1</td></tr><tr><td>DYKDDDDK peptit</td><td>Genscript</td><td></td><td>Peptit sentez hizmeti Protokol Bölüm No-6.1.4.6</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS</td><td>Protokolü Bölüm No-5.1</td></tr><tr><td>EndoFree Plazmid Giga Kiti</td><td>Qiagen</td><td>12391</td><td>Protokol Bölüm No-3.3</td></tr><tr><td>Endotoksin içermeyen su</td><td>Cytiva</td><td>SH30529.03</td><td>Protokol Bölüm No-4.1</td></tr><tr><td>endotoksin kantifikasyon kiti-CRL Endosafe Nexgen-PTS tespit sistemi</td><td>Charles River</td><td>PTS150K</td><td>Protokol Bölüm No-3.4</td></tr><tr><td>sabit açılı rotor A23-6x100 rotor</td><td>Thermo Fisher</td><td>75003006</td><td>Protokol Bölüm No-6.1.3</td></tr><tr><td>FPLC yazılımı- Unicorn 6.2</td><td>Cytiva</td><td></td><td>Protokolü Bölüm No-6.1.4</td></tr><tr><td>Gen sentezi</td><td>Genscript</td><td></td><td>Gen sentezi hizmeti Protokol Bölüm Numarası-1.2</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher Scientific Gliserol (Sertifikalı ACS)</td><td>G33-4</td><td>Protokol Bölüm Numarası-5.6</td></tr><tr><td>Büyüme Ortamı-Expi293 ekspresyon ortamı</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1435102</td><td>Protokolü Bölüm Numarası-4.2</td></tr><tr><td>HEK293 hücreleri</td><td>Thermo Fisher</td><td>R79007</td><td>Protokolü Bölüm Numarası-4</td></tr><tr><td>yüksek kesme homojenizatör-Mikroakışkanlaştırıcı</td><td>MicroFluidics</td><td>LM10</td><td>Protokolü Bölüm Numarası-6.1.3</td></tr><tr><td>HPLC - 1260 infinity II Bio-Insert HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td>Protokolü Bölüm Numarası-7.1</td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LiCor</td><td></td><td>Görüntü analiz yazılımı Protokolü Bölüm No-5.1</td></tr><tr><td>MAB2166</td><td>Sigma</td><td>MAB2166</td><td>Protokolü Bölüm Numarası-5.7</td></tr><tr><td>MAB2168</td><td>EMD</td><td>MAB2168</td><td>Protokolü Bölüm No-5.7</td></tr><tr><td>MAB3E10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47757</td><td>Protokol Bölüm No-5.7</td></tr><tr><td>MAB4E10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-7757</td><td>Protokol Bölüm No-5.7</td></tr><tr><td>MAB5490</td><td>Sigma</td><td>MAB5490</td><td>Protokolü Bölüm No-5.7</td></tr><tr><td>MAB5492</td><td>Sigma</td><td>MAB5492</td><td>Protokolü Bölüm No-5.7</td></tr><tr><td>MAB8A4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47759</td><td>Protokol Bölüm Numarası-5.7</td></tr><tr><td>Çok Açılı Işık Saçılma Dedektörü</td><td>Wyatt</td><td></td><td>Protokolü Bölüm Numarası-7.1</td></tr><tr><td>NativeMark Boyanmamış Protein Standardı</td><td>Invitrogen</td><td>LC0725</td><td>Protokolü Bölüm Numarası-8.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>Protokol Bölüm Numarası-5.6</td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolab</td><td>R0131S</td><td>Hi-Fi versiyonu mevcuttur Protokol Bölüm Numarası-2.2</td></tr><tr><td>NuPAGE 3&ndash; % 8 Tris asetat jelleri</td><td>Invitrogen</td><td>EA0375PK2</td><td>Protokolü Bölüm Numarası-5.4</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Asetat SDS Çalışan tampon</td><td>Invitrogen</td><td>LA0041</td><td>Protokolü Bölüm Numarası-5.4</td></tr><tr><td>PEI 25K</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td>Protokol Bölüm Numarası-4.1</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Thermo Fisher</td><td>15070063</td><td>Protokolü Bölüm No-4.2</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.02</td><td>Protokol Bölüm Numarası-4.5</td></tr><tr><td>Plazmid Miniprep Kiti</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Protokol Bölüm Numarası-2.6</td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England Biolab</td><td>R0560S</td><td>Protokol Bölüm Numarası-2.2</td></tr><tr><td>prekast Bis-tris jel- %3-12 NativePAGE Novex Bis-Tris Jel</td><td>İnvitrojen</td><td>BN1003BOX</td><td>Protokolü Bölüm Numarası-8.4</td></tr><tr><td>proteaz inhibitör kokteyli</td><td>GoldBio</td><td>GB-331-1</td><td>Protokol Bölüm Numarası-5.1</td></tr><tr><td>SEC-MALS analiz yazılımı - Astra 7</td><td>Wyatt Teknolojisi</td><td></td><td>Protokol Bölüm Numarası-7.6</td></tr><tr><td>ikincil antikor -IRdye 800 CW keçi anti-fare IgG</td><td>LiCor</td><td>926-32210</td><td>Protokol Bölüm Numarası-5.9</td></tr><tr><td>Superose 6 pg XK 16/70</td><td>Cytiva</td><td>90100042</td><td>Protokolü Bölüm Numarası-6.2</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td>Protokolü Bölüm No: 5.6</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher</td><td>AAJ20605AP</td><td>Protokolü Bölüm No: 6.1.1</td></tr><tr><td>UV spektrometresi - Nanodrop 8000</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-8000-GL</td><td>Protokol Kısım No: 2.2</td></tr><tr><td>XK26/100</td><td>Cytiva</td><td>28988951</td><td>Protokolü Kısım No: 6.1.1</td></tr></tbody></table>

geçici İfade sistemi kullanarak memeli hücrelerinde tam boy İnsan huntingtin varyantlarının verimli ve Ölçeklenebilir Üretimi

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Tam uzunlukta huntingtin (FL HTT), yaklaşık 350 kDa'lık bir kütleye sahip, her yerde eksprese edilen, poliglutamin (poliQ) içeren büyük (aa 1-3,144) bir proteindir. FL HTT'nin hücresel fonksiyonu tam olarak anlaşılmamış olsa da, ~ 36 tekrarın üzerindeki poliQ yolunun mutant bir genişlemesi, Huntington hastalığı (HD) ile ilişkilidir ve poliQ uzunluğu kabaca başlangıç yaşı ile ilişkilidir. Yapının mutant HTT'nin (mHTT) işlevi üzerindeki etkisini daha iyi anlamak için, büyük miktarlarda protein gereklidir. Memeli hücrelerinde FL HTT'nin miligram altı üretimi, doksisiklin ile indüklenebilir stabil hücre hattı ekspresyonu kullanılarak elde edildi. Bununla birlikte, kararlı hücre hatlarından protein üretimi, geçici transfeksiyon yöntemleriyle üstesinden gelinebilecek sınırlamalara sahiptir. 
Bu yazıda, FL HTT'nin düşük miligramlık miktarda üretimi ve kodon ile optimize edilmiş plazmidlerden polietilenimin (PEI) kullanılarak geçici transfeksiyon yoluyla varyantları için sağlam bir yöntem sunulmaktadır. Yöntem ölçeklenebilir (>10 mg) ve sürekli olarak yüksek saflaştırılmış FL HTT'nin 1-2 mg / L hücre kültürünü verir. Önceki raporlarla tutarlı olarak, FL HTT'nin saflaştırılmış çözelti durumunun oldukça dinamik olduğu bulunmuştur; proteinin dimerler ve yüksek dereceli oligomerler oluşturma eğilimi vardır. Oligomer oluşumunu yavaşlatmanın bir anahtarı, boyut dışlama kromatografisi sırasında monomerik fraksiyonları dimerik ve yüksek dereceli oligomerik fraksiyonlardan izole etmek için hızlı bir şekilde çalışmaktır. 
Saflaştırılmış HTT'nin dimer ve daha yüksek dereceli oligomerik içeriğini analiz etmek için çok açılı ışık saçılımlı (SEC-MALS) boyut dışlama kromatografisi kullanıldı. FL HTT poliQ uzunluğu (Q23, Q48 ve Q73) ile oligomer içeriği arasında korelasyon gözlenmedi. Ekzon1-silinmiş yapı (aa 91-3,144), FL HTT (aa 1-3,144) ile karşılaştırılabilir oligomerizasyon eğilimi gösterdi. SEC/MALS-kırılma indisi (RI), sodyum dodesilsülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), western blot, Native PAGE ve Blue Native PAGE ile üretim, saflaştırma ve karakterizasyon yöntemleri burada açıklanmıştır.

HEK293 hücrelerinde yapı tasarımı, geçici transfeksiyon ve tam uzunlukta insan huntingtin protein varyantlarının ekspresyonu ve saflaştırılmasını kapsayan ölçeklenebilir protokoller sunuyoruz.

Geçici İfade Sistemi Kullanarak Memeli Hücrelerinde Tam Boy İnsan Huntingtin Varyantlarının Verimli ve Ölçeklenebilir Üretimi

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

Protokol, düşük miligram ölçeğinde tam uzunlukta avcılık varyantlarının üretimi için geliştirilmiştir. HD araştırmacıları için gerekli olan tutarlı yüksek kaliteli proteine izin verir. Prosedürü gösteren, Curia Laboratuvarı'ndan bir araştırma bilimcisi olan Michael Harris olacak.Bir litre endotoksin içermeyen suya bir gram polietilenimin 25 K ekleyerek başlayın ve iyice karıştırın. 100 milimolar hidroklorik asit kullanarak pH'ı 2.0'a ayarlayın ve tüm polietilenimin çözünene kadar karıştırın. Ardından, 100 milimolar sodyum hidroksit çözeltisi kullanarak pH'ı 7.0'a ayarlayın ve çözeltiyi 0.2 mikrometrelik bir filtreden geçirin.Filtrelenmiş çözeltinin alikotlarını yapın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. HEK293 hücrelerini, nemlendirilmiş bir çalkalayıcı inkübatörde penisilin streptomisin ile desteklenmiş büyüme ortamında, 37 santigrat derece, 90 RPM,% 5 karbondioksitte 18 ila 24 saat boyunca yayın. Transfeksiyondan bir gün önce, hücreleri beş litrelik bir Erlenmeyer şişesinde iki litre büyüme ortamında mililitre başına altıncı güç hücrelerine yaklaşık 1.2 x 10 yoğunlukta seyreltin ve 18 ila 24 saat boyunca inkübe edin.Kuluçkanın sonunda, üreticinin talimatlarını izleyerek bir otomatik hücre sayacı kullanarak hücre yoğunluğunu ve canlılığını ölçün. Transfeksiyon için gerekli polietilenimin ve plazmid miktarını hesapladıktan sonra, polietilenimin ve plazmidi ayrı ayrı 100 mililitre PBS içinde seyreltin ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Daha sonra, seyreltilmiş plazmid ve polietileneimini hafifçe döndürerek karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.Karışımı hücre kültürüne ekleyin ve yavaşça döndürerek karıştırın. Şimdi, hücrelerin 24 saat boyunca büyümesine izin verin. Ertesi gün, kültüre 1: 1.000 hacim oranında iki milimolar anti-kümelenme ve köpük önleyici maddenin son konsantrasyonuna sodyum bütirat çözeltisi ekleyin ve nemlendirilmiş çalkalayıcı inkübatördeki hücreleri 48 saat boyunca inkübe edin.Hücre canlılığını ve yoğunluğunu ölçtükten sonra, hücreleri 30 dakika boyunca 2.000 G'de santrifüjleme ile toplayın ve saflaştırmadan önce hücre peletini eksi 80 santigrat derecede saklayın. FPLC kullanarak anti-FLAG saflaştırma için, tampon A kullanarak dakikada dört mililitre akış hızında boş bir kolona 12 ila 25 mililitre anti-FLAG reçine paketleyin ve pistonun ucu ile reçine yatağı arasındaki boşluğu gidermek için pistonun yüksekliğini ayarlayın. Daha sonra, çözülmüş hücre peletini soğuk lizis tamponunda askıya alın ve hücre süspansiyonunu bir kez yüksek parçalayıcı homojenizatörden inç kare basınç başına 1.000 pound'da geçirin.Uyumlu bir sabit açılı rotorla donatılmış bir santrifüj kullanarak, lizatı bir saat boyunca 20.000 G'de netleştirin. FPLC'yi Yöntem penceresi altında programlayın, berraklaştırılmış lizatı numune pompası aracılığıyla yükleyin ve sütunu metin makalesinde açıklandığı gibi istenen A, B, C, D tamponu ve elüsyon tamponu hacimleriyle yıkayın. Çalıştırma bittiğinde, SDS-PAGE kullanarak tepe fraksiyonlarının 10 mikrolitresini analiz edin.Pik fraksiyonları istenen saflıkla birleştirin ve daha fazla SDS-PAGE analizi için kombine elüatların yaklaşık 50 mikrolitresini saklayın. FPLC'yi kullanarak SEC sütununu dengelemeye başlayın ve anti-FLAG elüatını 50 mililitrelik bir süper döngü ile yükleyin. SEC arabelleğini çalıştırdıktan sonra, SEC ayrımının gece boyunca dört santigrat derecede gerçekleşmesine izin verin.Monomer, dimer ve daha yüksek dereceli oligomerik pikleri ayırt etmek için elüsyon profilini standart HTT elüsyon profiliyle karşılaştırın. Monomerik HTT fraksiyonlarını SEC kolonunun elüsyon profiline göre toplayın ve istenirse, daha yüksek dereceli oligomerik ve dimerik HTT fraksiyonlarını ayrı ayrı bir havuzlayın. Havuzlanmış HTT proteinini, dört santigrat derecede 100 kilodaltonluk bir santrifüj yoğunlaştırıcı kullanarak konsantre edin.Protein konsantrasyonunu hesapladıktan sonra, kriyo-güvenli bir mikrosantrifüj tüpünde saflaştırılmış HTT proteininin 100 mikrolitresinden daha az aliquot. Sıvı azot kullanarak alikotları flaşla dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Tüm analitik SEC-MALS'leri HPLC sisteminde dört santigrat derecede gerçekleştirin, bir UV dedektörü, çok açılı bir ışık saçılma dedektörü, bir diferansiyel kırılma indisi dedektörü ile birlikte ve HTT için kırılma indisi artışı olarak 0,185 kullanın.Pompayı ve dedektörleri filtrelenmiş HPLC sınıfı suyla temizleyin ve UHPLC kolonunu sisteme bağlayın. Tüm dedektör sinyalleri taban çizgisine ulaşana kadar sütunu filtrelenmiş suyla ve ardından SEC-MALS tamponuyla dengeleyin. Enjeksiyon başına 15 dakika boyunca dakikada 0.3 mililitre akış hızında iki mikrolitre BSA çözeltisi enjekte edin.BSA profiline göre veri kalitesini inceleyin, normalleştirme, tepe hizalama ve bant genişletme düzeltmesi gerçekleştirin ve aşağıdaki HTT örnek çalıştırmaları için bir şablon oluşturun. FL Q23-HTT numunesinin bir şişesini şamandıra kullanarak oda sıcaklığında bir su banyosunda hızlı bir şekilde çözün. HTT'yi 0,1 mikrometrelik bir spin filtresinden süzün.HTT örneğinin iki ila dört mikrolitresini enjekte edin ve dakikada 0.3 mililitre akış hızında dört santigrat derecede 15 dakika boyunca çalıştırın. Beraberindeki yazılımı kullanarak kromatografik ve ışık saçılma verilerini analiz edin ve her tepe noktası için ağırlık ortalaması moleküler kütlesini belirlemek için bir Zimm grafiği oluşturun. Bu çalışmada, iki aşamalı bir kolon işlemi kullanılarak, HTT için% 95'ten daha fazla saflık elde edildi ve ana kirletici, anti-FLAG afinite saflaştırma adımı sırasında magnezyum klorür ve ATP ile kapsamlı yıkama ile elimine edilen şaperon Hsp70 idi. FL HTT'nin aşırı ekspresyonu proteinin parçalanmasına neden olabilir, ancak FL Q23-HTT, 350 kilodaltonluk doğru moleküler ağırlığa sahip tek bir bant olarak çözülen yöntemle üretilen FL Q23-HTT'nin hayır parçalanma.FL Q23-HTT ile antikorların reaksiyonundan sonra yapılan Western blot analizi, proteinin, fragmanla ilgili herhangi bir ek bant gözlenmediğinden, önemli tespit edilebilir kesilmeler olmadan izole edildiğini göstermiştir. FL HTT poli-Q uzunluk varyansı, Q23, Q48 ve Q73, Western lekesinde beklendiği gibi reaksiyona girdi ve artan Q uzunluğu ile ilişkili poli-Q yönelimli monoklonal antikor MW1 için giderek daha güçlü bir sinyal gösterdi. Test edilen HPLC sütunları arasında, SEC sütunu HTT monomeri ve dimer arasında yeterli çözünürlük gösterdi, böylece molar kütleler ayırt edilebildi.SEC'den saflaştırılmış FL HTT, oligomerizasyon durumlarına karşılık gelen çoklu bantlar gösterdi; bu, jel içindeki göç sırasında daha yüksek dereceli oligomerlerin oluşumuna katkıda bulunan birkaç hidrofobik yamanın varlığından kaynaklanıyor olabilir. Saflaştırılmış HTT, mavi yerli PAGE'de, sırasıyla HTT'nin monomerik, dimerik ve trimerik türlerini temsil eden tahmini moleküler ağırlığı 643, 927 ve 1.070 kilodalton olan üç ana bant gösterdi. Saflaştırılmış huntingtin'in uygun şekilde kullanılması, çözünür agregalarda yüksek dereceli oligomerlerin üretilmesini önlemek için esastır.Son kullanıcının, flaş dondurmadan önce numuneyi önceden soğutulmuş tüplere dağıtmak için hızlı bir şekilde çalışması zorunludur. Uzun süreli stabilite testi, eksi 80 santigrat derecede uzun sürelerde saklanan numuneler üzerinde gerçekleştirilebilir. Tekrarlanan HPLC SEC-MALS analizleri, numunenin monomerik içeriğinde herhangi bir değişiklik olup olmadığını doğrulayacaktır.

efficient-scalable-production-full-length-human-huntingtin-variants

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Post-insan genomik dönemde, yerli konformasyonlar rekombinant protein durumu, yapısal, işlevsel ve tedavi araştırma ve geliştirme için çok önemlidir. Burada, bir test-ve rekombinant proteinlerin çeşitli üretmek için kullanılan insan embriyonik böbrek hücreleri 293T büyük ölçekli proteini ifade sistemi açıklamaktadır.

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Indüklenebilir ve ilgilenilen genin reversibl cDNA aşırı veya shRNA aracılı knock-down ile insan hücre hatları oluşturmak için bir hızlı ve kolay yolu. Bu yöntem geçici transfeksiyon yöntemleri veya konvansiyonel knockdown / nakavtla stratejileri değiştirmek zordur güvenilir ve son derece tekrarlanabilir işlemek hücre hatları için araştırmacılar sağlar.

Tetrasiklin-indüklenebilir (Tet-on) shRNA veya cDNA Expression Durağan İnsan Hücre Üretimi

Memeli sistemleri tarafından rekombinant proteinlerin ekspresyonu, yapısal biyoloji için protein kompleksleri üretmek için çekici bir yöntem haline geliyor. Burada, yapısal çalışmalar için protein komplekslerini saflaştırmak için süspansiyonda yetiştirilen memeli hücrelerini kullanan basit ama oldukça verimli bir ekspresyon sistemi sunuyoruz.

Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein

Burada, yüksek verimde saf, tamamen glikosile edilmiş ve enzimatik olarak aktif proteaz üreten HEK293T hücreleri kullanan uygun maliyetli bir granzim ekspresyon sistemini açıklıyoruz.

Memeli hücrelerinde İnsan Granzymes bir Yüksek Verimli ve Maliyet-etkin İfade Sistemi

Bu, salgılanan, glikosile edilmiş memeli proteinlerinin üretimi ve ardından X-ışını kristalografisi ve diğer biyofiziksel çalışmalar için yeterli homojen protein verimi ile tek aşamalı saflaştırma için hızlı, uygun maliyetli bir protokoldür.

Verimli memeli hücre ekspresyon ve Kristalizasyon için hücre dışı Glikoproteinlerin Tek aşamalı saflaştırma

Ökaryotik proteinlerin uygun translasyon sonrası modifikasyonla laboratuvar ölçeğinde üretimi önemli bir engel teşkil etmektedir. İşte bir memeli ekspresyon sistemi kullanarak protein ekspresyonu için hızlı kuruluş ve geri dönüşe sahip sağlam bir protokol. Bu sistem, seçici amino asidi, proteinlerin seçici etiketlenmesini ve glikan bileşiminin küçük molekül modülatörlerini destekler.

Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

bir heterolog ifade sistemi ile incelenmesi iyon kanalları biyomedikal araştırmalarda bir çekirdek tekniği haline gelmiştir. Bu yazıda, bir uyarılabilir promoterin kontrolü altında geçici transfeksiyon gerçekleştirerek sıkı bir şekilde kontrol iyon kanal ekspresyonunu elde etmek için bir zaman etkili bir yöntem sunmaktadır.

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Burada, yerli, etiket içermeyen monomerleri miktarlarda miligram ve liflerinde küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO) geçici fusion tabanlı exon1 Huntingtin protein (Httex1) üretimi için sağlam ve en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı mevcut.

Yerli, etiketsiz Huntingtin Exon1 Monomer ve SUMO Fusion strateji kullanarak liflerinde nesil

DNA epigenome temsil düzenleme güçlü bir tedavi yaklaşımı hedef. Bu iletişim kuralı üretim, arıtma ve toplama tüm-içinde-bir lentiviral vektörlerin İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC)'epigenome düzenleme uygulamaları için CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene yataklık açıklar-nöronlar türetilmiş.

Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen

Avi dizisi (BDNFAvi) içeren rekombinant BDNF, HEK293 hücrelerinde uygun maliyetli bir şekilde üretilir ve afinite kromatografisi ile saflaştırılır. BDNFavi daha sonra doğrudan mono-biyotinylated enzim BirA ile bir tüp içinde. BDNFavi ve mono-biyotinylated BDNFavi ticari olarak kullanılabilir BDNF ile karşılaştırıldığında kendi biyolojik aktivitelerini korumak.

Nöronlarda Hücresel İnsan Ticareti Çalışmaları Için Bir Tüpte Doğrudan Mono-Biyotinylate Rekombinant BDNF'yi Arındırmak ve Doğrudan Bir Protokol

Burada, bir süspansiyon HEK293 hücre tabanlı AAV üretim protokolü sunulmakta olup, ticari satıcılardan araştırma amacıyla temin edilebilen bileşenleri kullanarak vektör üretimi için gereken zaman ve işçiliğin azaltılmasına neden olmaktadır.

HEK293 Süspansiyon Hücreleri Kullanılarak Yüksek Verimli Adeno İlişkili Vektör Partilerinin Üretimi

Keşfedin tam boy Huntingtin protein varyantlarının HEK293 hücrelerinde üretim yöntemini. Bu protokol, Huntington hastalığı araştırmaları için yüksek saflıkta protein sağlar ve güvenilir sonuçlar elde edilmesini destekler.

Geçici İfade Sistemi Kullanarak Memeli Hücrelerinde Tam Boy İnsan Huntingtin Varyantlarının Verimli ve Ölçeklenebilir Üretimi

Daha fazla video keşfet