Gram-pozitif bakteriyel büyümenin küçük moleküllü bir inhibitörü olan masarimisinin sentezi

Masarimisin, bakteriyel hücre büyümesini durduran bakteriyel otolizinlerin birkaç inhibitöründen biridir. Otolizinlerin kimyasal ve genetik inaktivasyonu arasındaki farkları araştırmak için kullanılabilir ve bakteriyel fizyolojiyi incelemek için genetiğe ortogonal bir yaklaşım sağlar. Masarimisin sentezi göz korkutucu görünebilir.

Gösterilen adımları yakından takip edin. Bir reaksiyon adımının işe yarayıp yaramadığı konusunda şüphe duyduğunuzda, ince tabaka kromatografisi ve RF değerlerindeki değişiklikleri onaylayın. Başlamak için, metanol içinde 0.1 molar bir sikloheksilamin, sikloheksil karboksaldehit, orto-iyodobenzoik asit ve sikloheksil izosiyanür çözeltisi hazırlayın.

Manyetik karıştırma çubuğu ekleyin, ardından beş mililitre sikloheksilamin ve beş mililitre sikloheksil karboksaldehiti kapaklı yuvarlak tabanlı bir şişede karıştırın ve şişeyi 40 santigrat derecede 30 dakika boyunca sıcak plaka karıştırıcı üzerinde bir kum banyosuna yerleştirin. Kum yüzeyinin yaklaşık bir santimetre altına yerleştirilmiş bir termometre kullanarak sıcaklığı izleyin. 30 dakika sonra, çözeltiye beş mililitre sikloheksil izosiyanür ekleyin ve 50 santigrat derecede 20 dakika daha karıştırın.

Daha sonra, reaksiyon karışımına beş mililitre orto-iyodobenzoik asit ekleyin ve üç ila beş saat boyunca 55 santigrat derecede karıştırmaya devam edin. Üç saatlik karıştırmadan sonra, reaksiyonun ilerlemesini periyodik olarak ince tabaka kromatografisi veya TLC ile yaklaşık bir saatlik aralıklarla izleyin. TLC plakasında 0,3'e eşit tutma faktörüne sahip yalnızca bir nokta göründüğünde reaksiyonun tamamlandığını düşünün.

Çözücüyü döner evaporatörde düşük basınç altında çıkarın. Tüm metanol buharlaştırıldıktan sonra, kurutulmuş ham ürünü 30 mililitre etil asetat içinde çözün ve bir ayırma hunisine aktarın. Etil asetat tek molar hidroklorik asit, su, doymuş sodyum bikarbonat çözeltisi, tekrar su ve doymuş sodyum klorür çözeltisi ile sırayla ekstrakte edin ve her ekstraksiyonda sulu tabakaları atın.

Ardından, etil asetat tabakasını ayırıcı huniden çıkarın ve bir Erlenmeyer şişesinde toplayın. Etil asetattan kalan suyu gidermek için susuz sodyum sülfatla dolu bir spatula ekleyin. Sodyum sülfatı çıkarmak için kurutulmuş etil asetat çözeltisini bir numaralı filtre kağıdından süzün.

Ardından, filtre kağıdını az miktarda etil asetat ile yıkayın. Filtrelenmiş etil asetat çözeltisi, tüm etil asetat çıkarıldıktan sonra yağ olarak masarimisin elde etmek için düşük basınç altında döner bir evaporatör üzerinde kuruluğa buharlaştırıldı. Masarimisin yağını bir ila iki mililitre 9: 1 hekzandan izopropanol çözeltisine çözün ve tüm bileşik çözülene kadar manyetik bir karıştırma plakası üzerinde karıştırın.

Çözünmüş masarimycin'i saflaştırmak için, 12 gramlık, normal fazlı, silika flaş sütunu ile flaş kromatografisi yapın. Flaş kolonunu 10 sütun hacmi mobil faz ile dengeleyin, cihazlar dakikada 15 mililitre akış hızına ayarlanmıştır. Denge tamamlandıktan sonra, çözünmüş masarimycin'i beş mililitrelik bir şırınga kullanarak çekin.

Şırıngayı doğrudan dengelenmiş flaş sütununun üstüne bağlayın ve çözeltiyi sütuna enjekte edin. Yüklenen sütunu flaş kromatografisi sistemine yeniden bağlayın ve gradyan elüsyonunu başlatın. Gradyan elüsyonu kullanarak kolondan masarimycin'i, 12 sütun hacmi üzerinde izopropanole 10:90 hekzan son mobil faz konsantrasyonuna kadar elute.

Masarimisin elüsyonunu 230 ve 254 nanometrede absorpsiyon yoluyla izleyin. Morfoloji çalışması için, LB agar plakalarında 37 santigrat derecede bacillus subtilis 11774 büyütün. Sonraki tüm deneylerde, 600 nanometredeki optik yoğunluk 1'e ulaşana kadar beş mililitre LB suyunda yetiştirilen ikinci geçiş hücrelerini kullanın.

Daha sonra, bir pipet kullanarak, 3.8 mikromollük bir son konsantrasyona muamele edilmiş etiketli kültür tüplerine masarimycin ekleyin. Kontrol etiketli kültür tüpleri için, eşdeğer bir DMSO hacmi ekleyin. Numuneleri 150 RPM'de çalkalayarak 90 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin.

90 dakika sonra, kültürleri 1:10'luk bir kültür ortamı karışımında ve tamponu gece boyunca dört santigrat derecede sabitleyerek kimyasal olarak sabitleyin. Ertesi gün, kimyasal olarak sabitlenmiş numunelerin 10 ila 20 mikrolitresini cam mikroskop slaytlarına uygulamak ve havayla kurumasını sağlamak için bir pipet kullanın. Ardından, bir Bunsen brülörü kullanarak cam slaytları ısıtarak hava ile kurutulmuş numuneleri ısıtın.

Isıl sabitlemeden sonra, numuneleri 100 mikrolitre% 0.1 metilen mavisi ile boyayın. Leke ile 10 dakikalık bir inkübasyondan sonra, fazla boyayı damıtılmış suyla yıkayın. Daha sonra, hücreleri ortak bir odak düzlemine getirmek için lekeli slaytları bir fırında 15 ila 20 dakika boyunca 60 santigrat dereceye kadar hafifçe ısıtın.

Lekeli numuneleri, lekeli hücrelerin üzerine mikroskop kapak kayması yerleştirerek kapatın. Ardından, mikroskop slayt çimentosu kullanarak kenarları kapatın. Kapalı mikroskop slaytını mikroskop aşamasına yerleştirin ve parlak alan mikroskobu kullanarak görüntüyü 100X büyütmede odaklayın.

Mikroskop slaytına bir damla daldırma yağı yerleştirin ve 1000X büyütme kullanarak görüş alanını odaklamaya getirin. Mikroskopa ve ilgili yazılıma bağlı bir kamera kullanarak mikrograflar edinin. Yazılımın otomatik beyaz dengesini ve diyafram ayarlarını kullanarak görüntüler elde edin.

Flaş kromatografisi, masarimisin yüksek saflıkta hızlı saflaştırılmasını sağlar. Burada S.pneumoniae'de ATPaz inhibitörü optochin ile sinerji veya antagonizmanın değerlendirilmesi sunulmuştur. Mavi renkle gösterilen bakteriyel büyümeyi inhibe etmek için bileşiğin en düşük konsantrasyonu, bir yardımcı ilacın varlığında minimum inhibitör konsantrasyon değeri olarak kabul edilir.

Buna karşılık, pembe renkli kuyular bakteri büyümesini gösterir. Minimum inhibitör konsantrasyonların 0.75 katında masarimycin kullanılarak yapılan fenotipik analizler, B.subtilis için sosis benzeri bir fenotip ve S.pneumoniae için kümelenen bir fenotip göstermiştir. Reaksiyonun sıcaklığına dikkat edin.

TLC ile izleyerek reaksiyonun tamamlandığından emin olun. Bu yöntem, mikroskopi ile hücre duvarındaki değişiklikleri araştırmak için floresan etiketli antibiyotiklerle birlikte kullanılabilir.