HEK293T Hücrelerinde Bağlanma ve Endositozu İzlemek için Kuantum Nokta Konjuge SARS-CoV-2 Spike Trimerlerinin Yüksek Verimli Konfokal Görüntülemesi

SARS COVID 2 için, Spike aracılı hücre tanıma ve hücresel viral enfeksiyonda ilk adım olarak giriş ile diğer virüslere uygulanabilecek bir platform teknolojisi oluşturduk. Kuantum noktaları parlak, kararlıdır ve yüzeyleri çeşitli hücresel uygulamalar için işlevselleştirilebilir. Bu yöntemi kullanarak, Spike'ın hücrelere içselleştirilmesini görselleştirebilir ve ölçebiliriz.

%0.1 BSA hazırlamak için. Karışım halinde 10 mililitre görüntüleme ortamına 130 mikrolitre %7,5 BSA ekleyin. 6.1 ila üç seri seyreltme ve üçlü için, en yüksek 20 nanomol konsantrasyonunu yapmak için% 0.1 BSA'nın 285.74 mikrolitresine 14.26 mikrolitre QD Spike ekleyin.

Ardından, 6.67 nanomol QD Spike'ın ikinci sanrısını yapmak için 200 mikrolitre% 0.1 BSA'ya 100 mikrolitre 20 nanomol veya QD Spike ekleyin. Harcanan tüm ortamları çok kanallı bir aspiratörle her bir kuyucuktan çıkarın, kuyucuk başına 100 mikrolitre görüntüleme ortamı içeren çok kanallı bir pipetle bir kez yıkayın, ardından görüntüleme ortamının 100 mikrolitresini aspire edin. Kuyu başına 50 mikrolitre QD Spike çözeltisi ekleyin ve plakayı% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir inkübatörde üç saat boyunca inkübe edin.

Koruyucu ekipman giyerek, steril bir biyo güvenlik kabini içinde %4 PFA ve %0,1 PSA görüntüleme ortamı hazırlayın, her bir kuyudan 50 mikrolitre QD Spike aspire edin ve kuyucukların kurumasını önlemek için otomatik çok kanallı pipetle kuyu başına 100 mikrolitre %4 PFA ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin, ardından PBS ile üç kez yıkayın, beş milimetrelik stok çözeltisini PBS'de bir ila 1000 arasında seyrelterek koyu kırmızı nükleer boyayı hazırlayın, PBS'yi aspire edin ve kuyucuk başına 50 mikrolitre seyreltilmiş nükleer boya ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin, ardından PBS ile üç kez yıkayın, plakayı görüntüleyin veya daha sonra görüntülemek için bir plaka kapatıcı kullanarak kapatın.

Tabağı dört santigrat derecede saklayın. Görüntüleme platformu için yazılımı başlatın. Görüntüleme platformuna giriş yaptıktan sonra, 96 duvar şeffaf alt görüntüleme plakası olarak plaka tipini seçerek yeni bir edinme protokolü oluşturun, optik modu seçin odak ve büyütme 40 kat suya daldırma olarak gidin, bir tane olarak bağlamayı seçin.

İyi tanımlanmış hücre gövdeleri üretmek için yüksek kontrast gibi dijital yüz kontrastları modunu seçin. Bu başlığın görüntü penceresinde görüldüğü gibi uygun olduğunu onaylamak için anlık görüntü alın, hücre içindeki ACE2 trafiğini görselleştirmek için ACE2-GFP hücre satırıyla kullanmak üzere uygun C kanalını seçin. Özel bir QD kanalı yapmak için, üçgen açılır menüyü seçin ve 608 nanometre aralığında emisyondaki 405 nanometre aralığında uyarımı seçin, maruz kalma süresini, lazer gücünü ve Z yükseklik konumunu ayarlamak için sağlam bir sitoplazmik QD sinyaline sahip bir kuyu seçin.

Varsayılan yüksekliğin istenen odak düzlemindeki hücrelerin görüntüsünü üretip üretmediğini kontrol edin. Endositoz punkta için Z pozisyonu, plazma zarı için Z pozisyonundan daha düşük olacaktır. Genellikle 100 ila 300 milisaniye arasında, arka plan sinyalinden en az üç kat daha büyük, gri seviyeli parlak bir görüntü üreten bir pozlama süresi seçin.

20 nanomolde gri seviyeler, 200 milisaniye maruz kalma süresi ve% 80 lazer gücü ile yaklaşık 6.000 atomik birim olmalıdır. Her kanaldaki anlık görüntü özelliğiyle üretilen görüntüye sağ tıklayıp yoğunluğu göster'i seçerek gri düzeyleri kontrol edin, ardından ilgilenilen nesneye veya arka plana sol tıklayarak o pikselin gri düzeyini görüntüleyin, ilgilenilen nesnelerin yoğunluğuna ince ayar yapmak için lazer gücünü ayarlayın. Edinme protokolünü kaydedin, denemeyi çalıştırmak için geçiş yapın ve plaka adını girin, denemeyi çalıştırın.

Hem QD'lerin hem de ACE2'nin translokasyonu, floresan mikroskopi ve bir ACE2-GFP eksprese eden hücre hattı kullanılarak görselleştirildi. Spot sayımı gibi ilgili parametreleri çıkarmak için görüntü segmentasyonu ve müteakip analizler yapıldı. İlk olarak, çekirdekler bir ROI popülasyonu oluşturmak için nükleer işaretleyici kanalından bölümlere ayrıldı.

Ardından, hücreyi ACE2-GFP kanalı kullanılarak bölümlere ayrılmış olarak özetleyen bir ROI bölgesi. Son olarak, QD 608 Spike noktaları hücre ROI bölgesinden bölümlere ayrıldı, içselleştirilmiş QD ve ACE2 sinyalleri güçlü birlikte lokalizasyon gösterdi. HEK 293T hücrelerinde altı farklı QD Spike konsantrasyonu ile bir konsantrasyon yanıtı deneyi gerçekleştirildi.

QD'nin optik konsantrasyonlarını belirleyen QDS, 2.22 nanomol kadar düşük kullanılabilir, ancak sağlam bir yanıt sağlamak için 10 nanomol veya daha yüksek konsantrasyonların kullanılması önerilir. QD protein agregasyonuna konjugasyon sırasında meydana gelebilir. Agregalar QD çözeltisinde parlak kümelenmiş çökeltiler ve HEK 293T hücreleri olarak tespit edildi, QD'ler hücrelere eklenmeden önce mikrolitre başına 30 mikrogramdan başlayan nötralize antikorlarla inkübe edildi, bu antikorlar bağlanma içselleştirmesini bloke etti ve sadece QD ile tedavi edilen hücrelere kıyasla nokta sayısında bir azalmaya neden oldu.

Bu makale aynı zamanda yüksek verimli tarama, blok viral girişine pun antiviralleri tanımlamak için nötralize edici antikorların kurşun değerlendirmesi ve yeni ortaya çıkan varyantları incelemek için uyarlanabilir.