İn Vitro Histon Chaperonlarının Analitik, Pull-Down ve Chaperoning Testleri Kullanılarak Karakterizasyonu
December 29th, 2021
Bu protokol, histon şaperon oligomerizasyonu ve stabilitesini incelemek için analitik boyut dışlama kromatografisini, histon şaperon-histon etkileşimlerini çözmek için aşağı çekme testini, protein komplekslerinin stokiyometrisini analiz etmek için AUC'yi ve in vitro varsayılan bir histon şaperonu işlevsel olarak karakterize etmek için histon chaperoning testini içeren bir dizi yöntemi tanımlamaktadır.
Protokolümüz, bir proteinin histon şaperon olup olmadığını doğrulamak için pull-down tahlilleri analitik boyut dışlama kromatografisi, analitik ultra santrifüjleme ve histon chaperoning testi gibi tekniklerin nasıl kullanılabileceğini açıklamaktadır. Burada ele alınan teknikler, tandem kullanıldığında, varsayılan bir şaperonu karakterize etmek için doğrudan uygulanabilir. yapısal biyoloji tekniği ile birlikte gidebilirdi.
Teknikler kromatin araştırması alanına uygulanabilir. Bununla birlikte, bireysel yöntemler, gerektiği gibi, ilgilenilen diğer proteinlere uygulanabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan doktora öğrencisi olan Bay Surajit Gandhi, karmaşık pull-down testi için; Bayan olacak.
Doktora öğrencisi Archana Samal, analitik ultra santrifüjleme deneyi için Bay Ruchir C.Bobde ile birlikte; Doktora öğrencisi Bay Somanath Baral; plazmid süper sarmal testi için Bay Ketul Saharan ile birlikte İlk olarak, beş mikromolar histon şaperonları 300 mikrolitre denge tamponunda 20 mikromolar H2A / H2B dimerlerle karıştırın. Herhangi bir çökeltiyi gidermek için histon şaperon H2A / H2B kompleksini santrifüj edin.
Numuneyi, denge arabelleği ile önceden dengelenmiş spin sütununa yükleyin. Fazla H2A/H2B dimerini gidermek için kolonu 100 kolon hacmi veya dört mililitre yıkama tamponu ile yıkayın. Daha sonra, histon şaperon H2A / H2B kompleksini 20 ila 60 mikromolar H3 / H4 tetramer ile karıştırın.
Kolonu 100 kolon hacmi veya dört mililitre yıkama tamponu ile yeniden yıkayarak bağlanmamış H3/H4 tetramerini çıkarın, ardından numuneleri elüsyon tamponu ile süzün. Salınan örnekleri %18 SDS-PAGE'e tabi tutun. Ardından, Coomassie parlak mavi R250 ile lekeleyin ve jeli görselleştirin.
Histon şaperondaki H2A/H2B dimer, H3/H4 tetramerini analitik boyut dışlama kromatografisini kullanarak diyaliz tamponu ile ayrı ayrı saflaştırın. Daha sonra daha fazla seyreltme hazırlamak ve AUC hücresinde referans olarak kullanmak için arabelleği çalıştırmadan kaydedin. AUC numuneleri için, saflaştırılmış şaperonları ayrı tüplerde dimer veya tetramer ile karıştırarak kaydedilen diyaliz tamponunu kullanarak 0,3 ila 0,6 OD280'e ulaşmak için 450 mikrolitrelik son hacme kadar karıştırın.
Hücreyi, absorbans dedektörlü analitik bir ultra santrifüj ile donatılmış çift sektörlü bir merkez parçası ve kuvars pencerelerle birleştirin. Sırasıyla 400 mikrolitre numune çözeltisini ve 420 mikrolitre diyaliz tamponunu hücrenin referans ve numune sektörlerine doldurun. Hücreleri tartın ve doğru şekilde dengeleyin ve dört delikli titanyum rotora yükleyin.
Hücrelerin ve rotorun altındaki işaretleri kullanarak hücreleri hizalayın. Rotoru santrifüje yükleyin, kapağı kapatın ve bir vakumun gelişmesine ve sıcaklığın dengelenmesine izin veren çalıştırmayı başlatın. Veri analizi için, SEDNTERP programını kullanarak proteinin tampon bileşenlerinin yoğunluğunu ve viskozitesini ve proteinin amino asit bileşimine dayanan kısmi spesifik hacmi hesaplayın.
Verileri AUC makinesinden SEDFIT programına yükleyin. Menisküs, kırmızı çizgi, hücre altı, mavi çizgi ve veri analizi sınırları yeşil çizgileri tanımlayın. Model olarak Sürekli CS dağıtımı'nı seçin.
Parametreler bölümünde, çözünürlüğü en fazla 100'e kadar ayarlayın. Ardından, çökeltme katsayısını minimum sıfıra ve maksimum 10 ila 15'e ayarlayın. Sürtünme oranını başlangıçta 1,2 olarak ayarlayın ve oranın verilerden türetilmesi için kaydırmayı tercih edin.
Bir sigma düzenlileştirmesi için F oranını 0,68 olarak ayarlayın. SEDNTURP'tan elde edilen kısmi spesifik hacmi, tampon yoğunluğunu ve viskoziteyi ayarlayın. Yazılımın lam denklemini çözmesine izin vermek için Çalıştır'a basın.
Hassaslaştırmak için Sığdır'a basın. Moleküler kütleleri tahmin etmek için ana araç çubuğunun görüntüleme işlevinde CS'de Peak Mw'yi Göster'i seçin. İki mikromolar H3/H4 tetramer ve dört mikromolar H2A/H2B dimerini, bir ila altı mikromolar arasında değişen artan histon şaperon konsantrasyonları ile bir montaj tamponunda 50 mikrolitrelik son hacme kadar karıştırın.
Karışımı 30 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Aynı zamanda, negatif süper sarmal PUC-19 plazmidinin 500 nanogramını, montaj tamponunda bir mikrogram topoizomeraz I enzimi ile 50 mikrolitrede son bir hacimde ön işlemden geçirin. Daha sonra, tetramer, dimer ve histon şaperon içeren önceden karıştırılmış çözeltiyi gevşemiş plazma DNA'sı ile birleştirin.
100 mikrolitre 2X durdurma tamponu ekleyin ve plazmid DNA'sını deproteinize ederek montaj reaksiyonunu sonlandırmak için inkübe edin. Reaksiyon karışımını içeren tüpe eşit miktarda Tris doymuş fenol ekleyin ve reaksiyon karışımının içeriğini iyice karıştırın. Ardından, numuneyi santrifüj edin.
Plazmid DNA'sını içeren üst sulu fazı bir mikropipetle nazikçe toplayın ve eşit miktarda kloroform karıştırın. Karışımı vorteks. Daha sonra, üst sulu fazı toplayın, 1/10 hacimli üç molar sodyum asetat pH 5.5 ve 2.5 hacim buz gibi soğuk etanol ekleyin.
Tüpü üç ila dört kez ters çevirerek çözeltiyi iyice karıştırın. Numuneyi 10 dakika boyunca 16, 200 G'de santrifüj yapın ve süpernatanı yavaşça atın. Tüpleri, eser miktarda etanol buharlaşana kadar oda sıcaklığında açık tutun ve çökelmiş plazmid DNA'sını tüpte bırakın.
Analitik SEC sonuçları, Arabidopsis thaliana proteini FKBP53'ün rekombinant N-terminal nükleoplazman alanının, çözelti içinde 65 kilodaltonluk bir pentamer olduğunu ortaya koymuştur. Isıl işleme tabi tutulan nükleoplazmin örneği, alanın oldukça ısıl stabil olduğunu göstermiştir. Nükleoplazmin alanı, iki azı dişine kadar sodyum klorür tuz stabilitesi ve dört azı dişine kadar üre stabilitesi göstermiştir.
Bir pull-down testi, nükleoplazman alanının H2A / H2B dimer ile etkileşiminin 0.4-molar sodyum klorüre kadar stabil olduğunu, H3 / H4 ile ilişkinin ise 0.7 molara kadar stabil olduğunu ortaya koymuştur. Şaperon, H2A / H2B dimer ve H3 / H4 tetramerini, şaperona eklenme sırasına bakılmaksızın, oligomerler için ayrı etkileşim bölgeleri göstererek aynı anda bağlar. AUC-SV yoluyla tahmin edilen moleküler kütleler, histon oligomerleri ile nükleoplazmazmin alanının 1: 1 stokiyometrisini ortaya koymaktadır.
Plazmid süper sarmal testinde, rekombinant bitki histon şaperonları AtNRP1 ve AtNRP2, süper sarmal plazmid miktarını arttırdı, bu da nükleozomları oluşturmak için DNA üzerine histonlar biriktirebileceğini ve DNA süper sarmalına neden olabileceğini düşündürdü. Plazmid süper sarmal testi, histon DNA ve şaperon karakterizasyonu için özel dikkat ve olası optimizasyona ihtiyaç duyar. İzomerik karakterizasyon telemetrisi, bağlanma kararlılığını doğrulamak için analitik boyut dışlama deneylerinin bir takibi olarak kullanılabilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, histon şaperon özelliklerini, oligomerizasyonlarını ve histonlarla olan etkileşimlerini araştırmak için çeşitli yöntemler sunar. Bu proteinleri in vitro karakterize etmek için pull-down testleri ve analitik boyut dışlama kromatografisi gibi teknikler kullanılır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kromatin araştırması
- Protein etkileşimleri
- Histon şaperon işlevselliği
Arka Plan
- Histon şaperonları, kromatin dinamiğinde kritik bir rol oynar.
- Bu etkileşimleri anlamak, kromatin regülasyonunu açıklamak için esastır.
- Bu proteinleri incelemek için çeşitli biyokimyasal yöntemler kullanılabilir.
- Bu çalışma, bu tür analizler için kapsamlı bir protokol sağlamayı amaçlar.
Çalışmanın Amacı
- Tahmini histon şaperonlarının kimliğini doğrulamak.
- Histon şaperon etkileşimlerini ve stabilitesini karakterize etmek.
- Alandaki araştırmacılar için ayrıntılı bir metodoloji sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Analitik boyut dışlama kromatografisi
- Pull-down testleri
- Analitik ultra santrifüjlemesi (AUC)
- Histon şaperonlama testleri
Ana Sonuçlar
- Histon şaperon etkileşimlerinin başarılı bir şekilde tanımlanması.
- Protein kompleksi stokiyometrisinin karakterizasyonu.
- Histon şaperonlarının stabilitesi hakkında bilgiler.
- Protokolün diğer proteinler için uygulanabilirliğinin gösterimi.
Sonuçlar
- Açıklanan yöntemler, histon şaperonlarını incelemek için etkilidir.
- Bu teknikler diğer protein çalışmaları için uyarlanabilir.
- Dahası araştırmalar bu bulgulara dayanarak kromatin dinamiğini keşfetmeye devam edebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Characterizing histone chaperone function supports target validation in epigenetic drug discovery by confirming protein-histone interaction specificity and complex stability. This mechanistic de-risking enables predictive confidence in modulating chromatin dynamics for therapeutic intervention. The integrated assay approach provides quantitative, reproducible data essential for early-stage target triage and lead identification efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Confirms specific binding between putative chaperones and histone oligomers (H2A/H2B, H3/H4) to validate functional relevance in nucleosome assembly.
- Operational Value: Enables discrimination of chaperone selectivity and stoichiometry through orthogonal methods like pull-down and AUC.
- Predictive Value: Supports target confidence by demonstrating stable interaction under physiological salt and denaturant conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Histone chaperoning assay using super-coiled plasmid deposition provides functional readout of nucleosome assembly activity.
- Operational Value: Enables standardized, quantitative assessment of chaperone-mediated DNA super-coiling as a proxy for chromatin assembly.
- Reproducibility: Defined buffer conditions and incubation parameters support assay standardization across laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Characterizes chaperone stability (thermal, salt, urea) to predict behavior in complex cellular environments.
- Operational Value: AUC-derived sedimentation coefficients and molecular masses enable stoichiometric modeling of chaperone-histone complexes.
- Translational Continuity: Validated chaperone function bridges biochemical activity to nucleosome formation, supporting preclinical target validation.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow positions biochemical characterization early in the discovery continuum, informing target selection before phenotypic screening or lead optimization.
- Discovery Biology: Pull-down and AUC assays clarify interaction specificity and complex formation to de-risk mechanistic hypotheses.
- Screening: Histone chaperoning assay delivers functional, quantitative output for evaluating compound effects on chaperone activity.
- Analytics: SEC, AUC, and SDS-PAGE provide orthogonal validation of oligomerization, binding affinity, and complex stability.
- Translational Research: Demonstrated nucleosome deposition activity links target engagement to chromatin-level phenotypic outcomes.
- Enterprise Reuse: Modular assay design allows adaptation to other chromatin-associated proteins or epigenetic regulators.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of histone chaperone targets through validated interaction and functional data.
- Operational Value: Standardized, multi-parametric assay cascade improves reproducibility and reduces false positives in target validation.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions based on binding stability, stoichiometry, and nucleosome assembly capacity.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of epigenetic targets with validated chromatin-modulating potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, biochemical assay design, and biophysical analysis (AUC, SEC).
- Dependent on access to analytical ultracentrifuge, HPLC system for SEC, and electrophoresis equipment.
- Necessitates standardized histone oligomer preparation (H2A/H2B dimers, H3/H4 tetramers) for reproducible binding assays.
- Adaptation to non-histone chaperones may require optimization of buffer conditions and assay readouts.
- Plasmid super-coiling assay demands careful titration of chaperone, histone, and DNA concentrations to avoid aggregation or incomplete assembly.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:04
Competitive Pull-Down Assay
2:06
Analytical Ultracentrifugation-Sedimentation Velocity (AUC-SV) Experiments
4:29
Plasmid Supercoiling Assay to Confirm Histone Chaperoning Function
6:11
Results: Characterization of Histone Chaperones Using Analytical, Pull-Down, and Chaperoning Assays
7:41
Conclusion
