Name: Bakteriyel Glikoziltransferazların Bakteriyel Motilitedeki Rolünü Aydınlatmak için Boş Mutantların Üretilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-11T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Keşfedin bakteriyel glikoziltransferazların motilitedeki rolünü, Aeromonas boş mutantları ve hareketlilik testleri kullanarak. Bu yöntem patojenik bakterilerde glikan biyosentezi ve virülans mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Kanada Ulusal Araştırma Konseyi tarafından, Plan Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, İspanya) ve Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia) için desteklenmiştir.

<ol><li>Schäffer, C., Messner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+facets+of+prokaryotic+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Review%22%5BJournal%5D)">Emerging facets of prokaryotic glycosylation.</a> FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).</li>
<li>De Maayer, P., Cowan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flashy+flagella%3A+flagellin+modification+is+relatively+common+and+highly+versatile+among+the+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae.</a> BMC Genomics. 17, 377(2016).</li>
<li>Nothaft, H., Szymanski, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+glycosylation+in+bacteria%3A+sweeter+than+ever%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever.</a> Nature Review Microbiology. 8 (11), 765-778 (2010).</li>
<li>Benz, I., Schmidt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Never+say+never+again%3A+protein+glycosylation+in+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria.</a> Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).</li>
<li>Guerry, P., Szymanski, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Campylobacter+sugars+sticking+out%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Campylobacter sugars sticking out.</a> Trends in Microbiology. 16 (9), 428-435 (2008).</li>
<li>Hug, I., Feldman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analogies+and+homologies+in+lipopolysaccharide+and+glycoprotein+biosynthesis+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria.</a> Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).</li>
<li>Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pour+some+sugar+on+it%3A+the+expanding+world+of+bacterial+protein+O-linked+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation.</a> Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).</li>
<li>Szymanski, C. M., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+glycosylation+in+bacterial+mucosal+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens.</a> Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).</li>
<li>Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar+coating%3A+bacterial+protein+glycosylation+and+host-microbe+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochemistry+Sciences%22%5BJournal%5D)">Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions.</a> Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).</li>
<li>Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosyltransferases%3A+structures%2C+functions%2C+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms.</a> Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).</li>
<li>Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carbohydrate-active+enzymes+database+%28CAZy%29+in+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013.</a> Nucleic Acids Research. 42, Database Issue 490-495 (2014).</li>
<li>Weerapana, E., Imperiali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asparagine-linked+protein+glycosylation%3A+from+eukaryotic+to+prokaryotic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems.</a> Glycobiology. 16 (6), 91(2006).</li>
<li>Faridmoayer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+substrate+promiscuity+of+the+Neisseria+oligosaccharyl+transferase+involved+in+protein+O-glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).</li>
<li>Wacker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+of+bacterial+oligosaccharyltransferase+suggests+a+common+transfer+mechanism+for+the+bacterial+and+eukaryotic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).</li>
<li>Scott, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+glycosylation+in+Burkholderia+pseudomallei+and+Burkholderia+thailandensis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).</li>
<li>Thibault, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+carbohydrate+moieties+and+glycosylation+motifs+in+Campylobacter+jejuni+flagellin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).</li>
<li>Schirm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural%2C+genetic+and+functional+characterization+of+the+flagellin+glycosylation+process+in+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori.</a> Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).</li>
<li>McNally, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+metabolomics+analysis+of+Campylobacter+coli+VC167+reveals+legionaminic+acid+derivatives+as+novel+flagellar+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).</li>
<li>Logan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+carbohydrate+modifications+on+Campylobacter+jejuni+11168+flagellin+using+metabolomics-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches.</a> FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).</li>
<li>Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+glycosylation+of+polar+and+lateral+flagellins+in+Aeromonas+hydrophila+AH-3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).</li>
<li>Canals, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-structural+flagella+genes+affecting+both+polar+and+lateral+flagella-mediated+motility+in+Aeromonas+hydrophila%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila.</a> Microbiology. 153, Pt 4 1165-1175 (2007).</li>
<li>Howard, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Campylobacter+jejuni+glycosylation+island+important+in+cell+charge%2C+legionaminic+acid+biosynthesis%2C+and+colonization+of+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens.</a> Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).</li>
<li>Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+specific+amino+acids+in+the+N-terminus+of+Pseudomonas+aeruginosa+flagellin+and+of+flagellin+glycosylation+in+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response.</a> Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).</li>
<li>Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aeromonas%3A+the+multifaceted+middleman+in+the+One+Health+world%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world.</a> Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).</li>
<li>Gavín, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+flagella+of+Aeromonas+species+are+essential+for+epithelial+cell+adherence+and+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation.</a> Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).</li>
<li>Altschul, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gapped+BLAST+and+PSI-BLAST%3A+a+new+generation+of+protein+database+search+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.</a> Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).</li>
<li>Forn-Cuní, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+flagella+glycosylation+in+Aeromonas%3A+Genomic+characterization+and+Involvement+of+a+specific+glycosyltransferase+%28Fgi-1%29+in+heterogeneous+flagella+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 595697(2021).</li>
<li>Milton, D. L., O'Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellin+A+is+essential+for+the+virulence+of+Vibrio+anguillarum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriol.ogy%22%5BJournal%5D)">Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum.</a> Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).</li>
<li>Kovács, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Pseudomonas+pyocyanea+by+the+oxidase+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction.</a> Nature. 178 (4535), 703(1956).</li>
<li>Fulton, K. M., Mendoza-Barberá, E., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+glycosylated+and+lateral+non-glycosylated+flagella+from+Aeromonas+hydrophila+strain+AH-1+%28Serotype+O11%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11).</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).</li>
<li>Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alternative+sigma+factor+RpoQ+regulates+colony+morphology%2C+biofilm+formation+and+motility+in+the+fish+pathogen+Aliivibrio+salmonicida%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida.</a> BMC Microbiology. 18 (1), 116(2018).</li>
<li>Pawar, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+genetic+tools+to+tackle+c-di-GMP-dependent+signalling+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).</li>
<li>Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomic+analysis+of+Burkholderia+pseuomallei+Bsa+Type+III+secretion+system+effectors+using+hypersecreting+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Society+for+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants.</a> The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Bu yöntemin kritik erken adımı, flagella ve varsayılan GT'lerin glikozilasyonunda yer alan bölgelerin tanımlanmasıdır, çünkü bu enzimler yüksek homoloji gösterir ve birçok süreçte yer alır. Aeromonas genomlarının halka açık veri tabanlarındaki biyoinformatik analizi, bu bölgenin birçok suşta flagellin genlerini içeren ve pseudaminik asit27'nin biyosentezinde rol oynayan genleri içeren polar flagella bölgesi 2'ye bitişik olduğunu göstermektedir. Bu, Aeromonas'taki flagella glikozi...

Protein glikozilasyonu hem Gram-pozitif hem de Gram-negatif bakterilerde tanımlanmıştır ve bir glikan'ın bir amino asit yan zincirine kovalent bağlanmasından oluşur 1,2. Prokaryotlarda, bu süreç genellikle iki ana enzimatik mekanizma ile gerçekleşir: O- ve N-glikozilasyon 3. O-glikozilasyonda, glikan bir serin (Ser) veya treonin (Thr) kalıntısının hidroksil grubuna bağlanır. N-glikozilasyonda, glikan, X'in prolin hariç herhangi bir amino asit olabileceği Tripeptit dizileri Asn-X-Ser / Thr içindeki bir asparagin (Asn) kalıntısının yan zincir amid azotuna bağlanır.
Glikanlar doğrusal veya dallanmış yapıları benimseyebilir ve glikosidik bağlarla kovalent olarak bağlanmış monosakkaritlerden veya polisakkaritlerden oluşur. Prokaryotlarda, glikanlar genellikle ökaryotik glikanlara kıyasla şeker bileşiminde ve yapısında çeşitlilik gösterir4. Ayrıca, glikanın nasıl monte edildiği ve alıcı proteine nasıl aktarıldığı konusunda farklılık gösteren iki farklı bakteriyel glikozilasyon yolu tanımlanmıştır: sıralı ve en blok glikozilasyon 5,6. Sıralı glikozilasyon için, kompleks glikan, monosakaritlerin art arda eklenmesiyle doğrudan protein üzerinde oluşturulur. En blok glikozilasyonda, önceden monte edilmiş bir glikan, özel bir oligosakkariltransferaz (OTaz) tarafından lipite bağlı bir oligosakkaritten proteine aktarılır. Her iki yolun da N- ve O-glikozilasyon işlemlerinde rol oynadığı gösterilmiştir7.
Protein glikozilasyonu, proteinlerin fizikokimyasal ve biyolojik özelliklerinin modüle edilmesinde rol oynar. Bir glikanın varlığı, proteinin biyolojik aktivitesini etkileyen proteinin ligandı ile nasıl etkileşime girdiğini etkileyebilir, ancak protein stabilitesini, çözünürlüğünü, proteolize duyarlılığını, immünojenitesini ve mikrop-konakçı etkileşimlerini de etkileyebilir 8,9. Bununla birlikte, glikan sayısı, glikan bileşimi, pozisyon ve bağlanma mekanizması gibi çeşitli glikozilasyon parametreleri de protein fonksiyonunu ve yapısını etkileyebilir.
Glikoziltransferazlar (GT'ler), kompleks glikanların ve glikokonjugatların biyosentezinde anahtar enzimlerdir. Bu enzimler, aktive edilmiş bir donör molekülünden gelen bir şeker parçası ile spesifik bir substrat alıcısı arasındaki glikosidik bağ oluşumunu katalize eder. GT'ler hem nükleotitleri hem de nükleotit olmayanları donör moleküller olarak kullanabilir ve proteinler, sakaritler, nükleik asitler ve lipitler gibi farklı substrat alıcılarını hedefleyebilir10. Bu nedenle, GT'leri moleküler düzeyde anlamak, etki mekanizmalarını ve özgüllüklerini tanımlamak için önemlidir ve ayrıca ilgili molekülleri değiştiren glikanların şeker bileşiminin patojenite ile nasıl ilişkili olduğunu anlamayı sağlar. Karbonhidrat Aktif enzim veritabanı (CAZy)11, GT'leri dizi homolojilerine göre sınıflandırır, bu da GT ailelerinin çoğunda yapısal kıvrım ve etki mekanizmaları değişmez olduğu için öngörücü bir araç sağlar. Bununla birlikte, dört neden birçok GT'nin substrat özgüllüğünü tahmin etmeyi zorlaştırmaktadır: 1) prokaryotlarda substrat özgüllüğünü belirleyen net bir dizi motifi belirlenmemiştir 12, 2) birçok GT ve OTaz, substrat karışıklığı göstermektedir13,14, 3) fonksiyonel GT'lerin rekombinant formda yüksek verimde üretilmesi zordur ve 4) hem donör hem de alıcı substratların tanımlanması karmaşıktır. Buna rağmen, son mutagenez çalışmaları, katalitik mekanizmaların anlaşılmasında ve GT'lerin bağlanmasının çıkarılmasında önemli ilerlemeler elde etmeyi mümkün kılmıştır.
Bakterilerde, O-glikozilasyon, N-glikozilasyondan daha yaygın görünmektedir. O-glikozilasyon bölgeleri bir konsensüs dizisi göstermez ve O-glikozile proteinlerin çoğu salgılanır veya flagellinler, pili veya ototransporterler gibi hücre yüzeyi proteinleri1. Flagellin glikozilasyonu, alıcı bölgelerin sayısında, glikan bileşiminde ve yapısında değişkenlik gösterir. Örneğin, Burkholderia spp flagellin'lerin yalnızca bir alıcı bölgesi varken, Campylobacter jejuni'de flagellinlerin 19 alıcı bölgesi15,16'ya kadar vardır. Ayrıca, bazı bakteriler için glikan tek bir monosakarittir, diğer bakteriler ise oligosakaritler oluşturmak için farklı monosakaritlerden ödün veren heterojen glikanlara sahiptir. Bu heterojenlik, aynı türün suşları arasında bile meydana gelir. Helicobacter flagellinleri sadece pseudaminic asit (PseAc)17 tarafından modifiye edilir ve Campylobacter flagellinler, pseudaminic asidin (PseAm) veya lejyonaminik asidin (LegAm) asetamidin formu olan PseAc ve asetil, N-asetilglukozamin veya propiyonik ikameler18,19 ile bu şekerlerden türetilen glikanlar tarafından modifiye edilebilir. Aeromonas'ta, flagellinler, bileşimi tek bir PseAc asit türevinden heteropolisakkarit20'ye kadar değişen glikanlar tarafından modifiye edilir ve glikanların flagellin monomerlerine bağlanması her zaman bir PseAc türevi aracılığıyladır.
Genel olarak, flagellinlerin glikozilasyonu, flagellar filament montajı, motilite, virülans ve konakçı özgüllüğü için gereklidir. Bununla birlikte, C. jejuni16, H. pylori17 ve Aeromonas sp. 21, protein monomerleri glikozile edilmedikçe, Pseudomonas spp. ve Burkholderia spp. olmadıkça filament halinde birleşemez. 15 flagella montajı için glikozilasyon gerektirmez. Ayrıca, bazı C. jejuni suşlarında, flagella glikanının şeker bileşimindeki değişiklikler bakteriyel-konakçı etkileşimini etkiler ve bazı bağışıklık tepkilerinden kaçınmada rol oynayabilir16. Otoaglütinasyon, flagellinlerle ilişkili glikanların bileşimindeki modifikasyonlardan etkilenen başka bir fenotipik özelliktir. Daha düşük bir otoaglütinasyon, mikrokoloniler ve biyofilm22 oluşturma yeteneğinde bir azalmaya yol açar. Bazı bakterilerde, flagella'nın pro-inflamatuar bir yanıtı tetikleme yeteneği, flagellin glikozilasyonu ile bağlantılıydı. Bu nedenle, P. aeruginosa'da, glikozile flagellin, glikozillenmiş olmayan23'ten daha yüksek bir pro-inflamatuar yanıtı indükler.
Aeromonas, çevrede her yerde bulunan Gram-negatif bakterilerdir, bu da tüm One Health bileşenlerinin arayüzünde olmalarını sağlar24. Mezofilik Aeromonas, yapısal olarak üretilen tek bir polar flagellum'a sahiptir. Klinik izolatların yarısından fazlası, yüksek viskoziteli ortamlarda veya plakalarda indüklenebilen lateral flagellin eksprese eder. Farklı çalışmalar her iki flagella tipini de bakteriyel patogenezin erken evreleri ile ilişkilendirmiştir25. Bugüne kadar bildirilen polar flagellinler, merkezi immünojenik alanlarının 5-8 Ser veya Thr kalıntılarında O-glikozile edilirken, lateral flagellinler tüm suşlarda O-glikozile edilmemiştir. Farklı suşlardan polar flagella glikanları, karbonhidrat bileşimlerinde ve zincir uzunluklarında20 çeşitlilik göstermesine rağmen, bağlantı şekerinin bir pseudaminik asit türevi olduğu gösterilmiştir.
Bu makalenin amacı, ilgili polisakkaritlerin biyosentezine ve bakteriyel patojeniteye katılımlarını ve glikan'ın kendisinin rolünü analiz etmek için belirli GT'lerde veya GT'leri içeren kromozomal bölgelerde boş mutantlar elde etmek için bir yöntemi tanımlamaktır. Örnek olarak, polar flagellin glikozilasyonuna katılımını belirlemek ve flagellin glikanının rolünü analiz etmek için Aeromonas'ın GT'lerini içeren kromozomal bir bölgeyi tanımlar ve sileriz. Bu glikan'ın biyosentezindeki işlevini ve modifiye glikan'ın rolünü belirlemek için belirli bir GT'nin nasıl silineceğini gösteriyoruz. Örnek olarak Aeromonas kullanılmasına rağmen, prensip diğer Gram-negatif bakterilerin flagella glikozilasyon adalarını tanımlamak ve incelemek ve O-antijen lipopolisakkarit gibi diğer glikanların biyosentezinde yer alan GT'lerin işlevini analiz etmek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>ABI PRISM Büyük Boya Sonlandırıcı v. 3.1 Döngü Dizileme Hazır Reaksiyon Kiti</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4337455</td><td>AccuPrime</td></tr><tr><td>Taq DNA Polimeraz, yüksek sadakat</td><td>Invitrogen</td><td>12346-086</td><td>AB, CD ve AD fragmanlarının amplifikasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Conda-Pronadise</td><td>8008</td><td>DNA elektroforezi için kullanılır</td></tr><tr><td>Alkalin fosfataz, baldır bağırsağı (CIAP)</td><td>Promega</td><td>M1821</td><td>5' ucundaki fosfatı çıkarmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>214010</td><td>Motilite analizi için kullanın</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>Promega</td><td>R6021</td><td>Endonükleaz kısıtlaması için kullanılır</td></tr><tr><td>BglII</td><td>Promega</td><td>R6081</td><td>Endonükleaz kısıtlaması için kullanılır</td></tr><tr><td>BioDoc-It Imagin System</td><td>UVP</td><td></td><td>Biyo-görüntüleme istasyonu DNA görselleştirme için kullanılır</td></tr><tr><td>Biotaq polimeraz</td><td>Bioline</td><td>BIO-21040</td><td>Koloni taraması için kullanılır</td></tr><tr><td>Sezyum klorür</td><td>Uygulaması</td><td>A1126,0100</td><td>Flagella saflaştırması için kullanılır</td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Uygulaması</td><td>A1806,0025</td><td>Üç ebeveynli çiftleşme için kullanılır</td></tr><tr><td>Cytiva illustra GFX PCR DNA ve Jel Bant Saflaştırma Kiti</td><td>Cytivia</td><td>28-9034-71</td><td>PCR amplikonlarının ve DNA fragmanlarının saflaştırılması için kullanılır.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>131026.1211</td><td>DNA elektroforezi için kullanılır</td></tr><tr><td>Elektroporasyon küvetleri 2 mm boşluk</td><td>VWR</td><td>732-1133</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum bromür</td><td>Aplikesi</td><td>A1152,0025</td><td>DNA görselleştirme için kullanın</td></tr><tr><td>HyperLadder 1 Kb işaretleyici</td><td>Bioline</td><td>BIO-33053</td><td>DNA işaretleyici</td></tr><tr><td>Invitrogen Easy-DNA gDNA Saflaştırma Kiti</td><td>Invitrojen</td><td>10750204</td><td>Bakteriyel kromozomal DNA saflaştırması için kullanılır</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) Miller agar</td><td>Condalab</td><td>996</td><td>Escherichia coli kültür</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) için kullanılır Değirmen suyu</td><td>Condalab</td><td>1551</td><td>Escherichia coli kültür için kullanılır</td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000</td><td>NanoDrop Teknolojileri A.Ş</td><td></td>. <td>Spektrofotometre DNA miktar tayini için kullanılır</td></tr><tr><td>Rifampisin</td><td>Applichem</td><td>A2220,0005</td><td>Üç ebeveynli çiftleşme için kullanılır</td></tr><tr><td>SOC Orta</td><td>Invitrogen</td><td>15544034</td><td>Elektroporasyon geri kazanımı için kullanılır</td></tr><tr><td>Spektinomisin</td><td>Uygulaması</td><td>A3834,0005</td><td>Üç ebeveynli çiftleşme için kullanılır</td></tr><tr><td>SW 41 Ti Sallanan Kova Rotoru</td><td>Beckman</td><td>331362</td><td>Flagella saflaştırması</td></tr> <tr>için kullanılır<td>T4 DNA ligaz</td><td>Invitrogen</td><td>15224017</td><td>Ligasyon reaksiyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Triptikazein soya agar</td><td>Condalab</td><td>1068</td><td>Aeromonas yetiştirilen</td></tr><tr><td>Triptikazin soya suyu</td> için kullanılır <td>Condalab</td><td>1224</td><td>Aeromonas için kullanılır</td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Condalab</td><td>1612</td><td>Motilite analizi için kullanın</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Applichem</td><td>A2264,0500</td><td>DNA elektroforezi ve flagella saflaştırması için kullanılır</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Applichem</td><td>A4975,0100</td><td>Bakteri lizisi için kullanılır</td></tr><tr><td>Ultra Clear tüpler (14 mm x 89 mm)</td><td>Beckman</td><td>344059</td><td>Flagella saflaştırması için kullanılır</td></tr><tr><td>Veriti 96 kuyusu Termal Döngüleyici</td><td>PCR reaksiyonları için kullanılan</td>Uygulamalı <td>Biyosistemler</td><td></td></tr><tr><td>Zyppy Plasmid Miniprep II Kiti</td><td>Zymmo araştırma</td><td>D4020</td><td>Plazmit DNA'nın izolasyonu için kullanılır</td></tr></tbody></table>

bakteriyel glikoziltransferazların bakteriyel motilitedeki rolünü aydınlatmak için boş mutantların Üretilmesi

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

Prokaryotlarda glikozilasyon çalışması hızla büyüyen bir alandır. Bakteriler, yüzeylerinde glikanları suşa özgü bir barkod oluşturan farklı glikozile yapılar barındırır. İlişkili glikanlar, şeker bileşiminde ve yapısında ökaryotlarınkinden daha yüksek çeşitlilik gösterir ve bakteriyel-konakçı tanıma süreçlerinde ve çevre ile etkileşimde önemlidir. Patojenik bakterilerde, glikoproteinler enfeksiyöz sürecin farklı aşamalarında yer almıştır ve glikan modifikasyonları glikoproteinlerin spesifik fonksiyonlarına müdahale edebilir. Bununla birlikte, glikan bileşiminin, yapısının ve biyosentez yolaklarının anlaşılmasında kaydedilen ilerlemelere rağmen, glikoproteinlerin patojenite veya çevre ile etkileşimdeki rolünün anlaşılması çok sınırlı kalmaktadır. Ayrıca, bazı bakterilerde, protein glikozilasyonu için gerekli enzimler, lipopolisakkarit ve kapsül biyosentetik yollar gibi diğer polisakkarit biyosentetik yollarla paylaşılır. Glikozilasyonun fonksiyonel önemi, glikozilasyon sürecine dahil olduğu düşünülen spesifik genlerin mutasyonu ve hedef glikoprotein ve modifiye edici glikan'ın ekspresyonu üzerindeki etkisinin incelenmesi yoluyla birçok bakteride açıklığa kavuşturulmuştur. Mezofilik Aeromonas tek ve O-glikozile polar flagelluma sahiptir. Flagellar glikanlar, karbonhidrat bileşiminde ve Aeromonas suşları arasındaki zincir uzunluğunda çeşitlilik gösterir. Bununla birlikte, bugüne kadar analiz edilen tüm suşlar, serin veya treonin kalıntılarını değiştiren bağlantı şekeri olarak bir pseudaminik asit türevi göstermektedir. Pseudaminik asit türevi polar flagella montajı için gereklidir ve kaybının yapışma, biyofilm oluşumu ve kolonizasyon üzerinde etkisi vardır. Bu makalede ayrıntılı olarak açıklanan protokol, null mutantların yapımının, bir flagellar glikan'ın biyosentezinde varsayılan glikoziltransferazlar içeren genlerin veya genom bölgelerinin katılımını anlamak için nasıl kullanılabileceğini açıklamaktadır. Bu, ilgili glikoziltransferazların işlevini ve glikan'ın rolünü anlama potansiyelini içerir. Bu, glikan eksikliği olan mutantı vahşi tip suşla karşılaştırarak elde edilecektir.

Bu metodoloji, Aeromonas'ın genlerinde veya kromozomal bölgelerinde flagella glikozilasyonunu ve flagella filamentinin rolünü etkileyebilecek null mutantlar üretmek için etkili bir sistem sağlar (Şekil 1).
Protokol, varsayılan FGI'ların ve GT'leri kodlayan genlerin bu bölgede bulunan biyoinformatik tanımlanması ile başlar. Aeromonas'ta, FGI'ların kromozomal yerleşimi üç tip genin tespitine dayanır: pseudaminik asidin (pseI ve pseC) biyos...

Burada, Aeromonas'ın boş mutantlarının spesifik glikoziltransferazlarda veya glikoziltransferazlar içeren bölgelerde yapımını, motilitesi testlerini ve flagella saflaştırmasını, kodlanmış enzimlerinin bir glikanın biyosentezindeki katılımını ve işlevini ve bu glikanın bakteriyel patogenezdeki rolünü tanımlamaktayız.

Bakteriyel Glikoziltransferazların Bakteriyel Motilitedeki Rolünü Aydınlatmak için Boş Mutantların Üretilmesi

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Bu nedenle nörminik asit türevi sadece patojenik bakterilerde bulunur, aminiglikozile flagella bu şekeri içerir. Genlerde bulunan bölgenin çerçeve delesyonu, flagella glikozilasyon kümelerinin bulunmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, aralarında yüksek homolojiye sahip olan ve farklı süreçlerde yer alan glikoziltransferazlar gibi en son spesifik bölge veya genleri ve flagella glikozilasyon sürecine katılımını analiz eder.Bu teknik aynı zamanda patojenik bakterilerde ilgili polisakkaritlerin biyosentezinde rol oynayan glikoziltransferazların rolünü ve ayrıca flagella oluşumunda rol oynayan gen kodlayan proteinlerin rolünü bulmaya yardımcı olabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımın teknisyeni Maite Polo olacak. DNA bölgelerini, silinecek seçilen gen veya bölgenin yukarı ve aşağı akışını yükselten iki çift primer tasarlayın.Primer A ve D'nin beş asal uçta, pDM4'te klonlamaya izin veren bir endonükleaz için bir kısıtlama bölgesi içermesi gerekir. B ve C primerlerinin silinecek genin içinde veya silinecek bölgenin ilk ve son geninin içinde olduğundan emin olun. Her iki primerin de çerçeve içinde olduğundan ve genin içinde beş ila altı kodon arasında bulunduğundan emin olun.Her iki p

generation-null-mutants-to-elucidate-role-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Sistematik, büyük ölçekli sentetik gen (bir gen ya da gen-epistasis) etkileşim ekranlar genetik ve fazlalık yolu çapraz konuşma keşfetmek için kullanılabilir. Burada, yüksek-throughput kantitatif sentetik genetik dizi tarama teknolojisi tarif eSGA biz epistatik ilişkileri durulaştırmada ve genetik etkileşim ağları keşfetmek için geliştirilen...

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Kaynak: Tomás, J. M. ve diğerleri. Bakteriyel Glikosiltransferazların Bakteriyel Hareketlilikteki Rolünü Aydınlatmak için Boş Mutantların Üretimi. J. Vis. Uzm. (2022).Bu video, E. coli'de  bir intihar plazmitinin başlatıcıya bağlı amplifikasyonunu göstermektedir.Bir antibiyotik direnç geni taşıyan plazmit, yalnızca konakçı tarafından kodlanan bir başlatıcı proteinin varlığında çoğalır. Elektroporasyon ve geri kazanım ortamında inkübasyondan sonra, karışım antibiyotik içeren agar üzerine...

Bir Bakteriyel Konakçıda İntihar Plazmidinin Amplifikasyonu

Enterobacter sp. YSU glukoz az tuz ortamında büyür. Oksotroflan rastgele bir konakçı genom içine kendisini ekleyen bir transposome ile dönüştürülmesiyle oluşturulur. Mutantlar minimal orta karmaşık ortamdan replika plaka tarafından bulundu. Kesilen gen, kurtarma ve dizileme ile tespit edilir.

Üretilmesi Enterobacter Sp. YSU oksotroflan transpozon mutajenezi kullanarak,

Sürü hareketliliği fiziksel ve çevresel faktörlerden etkilenir. Sürü tahlili hazırlama ve veri toplama ile yaygın olarak ilişkilendirilen zorlukları aşmak için iki aşamalı bir protokol ve yönergeler açıklıyoruz. Mevcut analiz tekniklerinin sağlamadığı sürü davranışı hakkında ayrıntılı bilgi elde etmek için makroskopik bir görüntüleme tekniği kullanılmaktadır.

Bakteriyel Yüzey Motilite Tahliller hazırlanması, Görüntüleme ve miktarının belirlenmesi

Bu çalışmada, nano-mikroakışkan akış odası görselleştirmek ve işlevsel Xylella fastidiosa, dedikodu olarak Pierce hastalığa neden olan bir bakterinin seğirmesi motilitesini karakterize etmek kullanılmıştır.

Rolü seğirmesi Motilitesi görselleştirme ve Karakterizasyonu<em&gt; PilG</em&gt; &#39;de<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Streptococcus mutans çoğunlukla gen kesintiye üretimi için facile, hızlı ve nispeten ucuz bir yöntem tarif suşları; Bu teknik gen kesintiye suşların çeşitli tür üretimi için adapte olabilir.

Nesil bir gen kesintiye Streptococcus mutans çoğunlukla zorlanma olmadan Gen Klonlama

Birçok bakteri, çevrelerinde gezinmek ve hem bireysel hem de kolektif olarak elverişli çevreyi kolonileştirmek için flagella tahrikli hareketliliği kullanır. Burada, yüzmeye ve kaynayan hareketliliklere katkıda bulunan bileşenleri / yolları tanımlamak için hareketliliği bir seçim aracı olarak kullanan üç yerleşik yöntemin kullanılması gösterilmiştir.

Bir Seride Üç Yerleşik Teknik Uygulayarak Escherichia coli'de Flagella Odaklı Hareketliliği Araştırmak

Burada, aynı anda çoklu konsantrasyon tepkileri elde ederken bakteriyel kaynama hareketliliğini değerlendirmek için indükleyici gradyan plakalarının kullanımını açıklıyoruz.

İndükleyici Gradyan Plakaları Üzerindeki Bakteriyel Yüzey Kaynatma Motilitesinin Ölçülmesi

Burada, bir renk reaksiyonuna dayalı bakteriyel motiliteyi tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntemin temel avantajları, değerlendirilmesi kolay ve daha doğru olması ve özel ekipman gerektirmemesidir.

Bir renk reaksiyonuna dayalı bakteriyel hareketliliğin görselleştirilmesi

Bu protokol, geleneksel sıvı kültürlerden veya Petri kaplarından daha doğal yaşam alanlarına daha çok benzeyen karmaşık 3D gözenekli hidrojel matrislerinde hareketliliklerini ve büyümelerini incelemek için bakteri kolonilerinin üç boyutlu (3D) baskısı için bir prosedürü açıklar.

Karmaşık 3D Gözenekli Ortamlarda Hareketliliği ve Büyümeyi İncelemek için 3D Baskı Bakterileri

Bu protokol, Pseudomonas aeruginosa'da çeşitli motilite tiplerinde yer alan genetik faktörleri tanımlamak için hızlı ve etkili bir yöntem sunar.

Pseudomonas aeruginosa'da Motilite Fenotiplerini Gözlemlemek için Yüksek Verimli Yöntem

Keşfedin bakteriyel glikoziltransferazların motilitedeki rolünü, Aeromonas boş mutantları ve hareketlilik testleri kullanarak. Bu yöntem patojenik bakterilerde glikan biyosentezi ve virülans mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Bakteriyel Glikoziltransferazların Bakteriyel Motilitedeki Rolünü Aydınlatmak için Boş Mutantların Üretilmesi

Daha fazla video keşfet