Name: Acinetobacter baumannii O-bağlantılı Glikopeptitlerlerin Tanımlanması için Açık Arama Tabanlı Yaklaşımların Uygulanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Keşfedin bakteri glikopeptitlerinin açık arama tabanlı tanımlanması yöntemini. Acinetobacter baumannii kullanarak yeni glikozilasyon olaylarını ve suşlar arası farklılıkları inceleyin. Bu protokol glikosilasyon uzmanı olmayan araştırmacılar için erişilebilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

N.E.S, Avustralya Araştırma Konseyi Gelecek Bursu (FT200100270) ve ARC Keşif Projesi Bursu (DP210100362) tarafından desteklenmektedir. MS enstrümantasyonuna erişim için Bio21 Moleküler Bilim ve Biyoteknoloji Enstitüsü'nün Melbourne Kütle Spektrometresi ve Proteomik Tesisi'ne teşekkür ederiz.

NOT: Bakteriyel glikopeptid numunelerinin hazırlanması ve analizi dört bölüme ayrılabilir (Şekil 1). Bu çalışmada üç sıralı A. baumannii suşunun glikozilasyonu değerlendirilmiştir (Tablo 1). Bu suşların her birinin Proteome FASTA veritabanlarına Uniprot üzerinden erişilebilir. Bu protokolde kullanılan arabelleklerin bileşimi için Tablo 2'ye bakın.
1. Proteomik analiz için protein numunelerinin hazırlanması
<ol><li>İlgilenilen proteom örneklerinin izolasyonu<ol>
<li>Bütün hücreleri kullanıyorsanız, ortamda bulunan potansiyel protein kirleticilerini gidermek için hücrelerin fosfat tamponlu bir salin çözeltisi (PBS) ile yıkandığından emin olun. Yıkadıktan sonra tüm hücreleri çıtçıtlayın ve gerekene kadar -80 ° C'de saklayın.</li>
		<li>Fraksiyone numuneler kullanılıyorsa (membran preparatları gibi), kullanılan reaktiflerin çıkış yönündeki sıvı kromatografisi MS (LC-MS) analizine müdahale etmeyeceğinden emin olun50.</li>
		<li>Sodyum dodesil sülfat (SDS), Triton X-100, NP-40 veya lauroylsarcosine gibi deterjanlar kullanılmışsa, bu deterjanları aseton çökeltme, SP3 numune hazırlama yöntemleri51 veya S-tuzakları52 gibi ticari proteomik temizleme sütunları kullanarak çıkarın. Alternatif olarak, uyumsuz deterjanları sodyum deoksikolat (SDC) veya oktil glukopiranosid gibi MS uyumlu veya çıkarılabilir bir deterjanla değiştirin.</li>
		<li>Numune hazırlamada kullanılacak tüm plastik eşya ve cam eşyaların otoklavlanmadığından emin olun. Otoklavlanmış cam eşyalar ve plastikler tipik olarak, MS içinde kolayca tespit edilen polimerler gibi küçük moleküler ağırlıklı bileşiklerle ağır şekilde kirlenir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüm hücre örneklerinin çözündürülmesi<ol>
<li>200 μL taze hazırlanmış sodyum deoksikolat lizis tamponunda ~10 mg yıkanmış, çıtçıtla dondurulmuş hücreleri yeniden askıya alın (SDC lizis tamponu: 100 mM Tris'te %4 SDC, pH 8.5). NOT: Protein yıkımını sınırlamak için SDC lizis tamponuna proteaz inhibitörleri eklenebilir.</li>
		<li>Numuneleri sallayarak 95 ° C'de 10 dakika kaynatın (bir termomikserde 2000 rpm) ve ardından 10 dakika buz üzerinde bırakın. Numunelerin verimli bir şekilde parçalanmasını ve çözünmesini sağlamak için bu işlemi iki kez tekrarlayın. NOT: Numuneler bu noktada -80 °C'de uzun süreli olarak saklanabilir. Depolanırsa, daha fazla işlemden önce 95 ° C'de ısıtılarak çözünür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bisinkoninik asit (BCA) protein testi53 kullanarak numune protein konsantrasyonlarını sayısallaştırın. Protein bozulmasını sınırlamak için nicelleştirme yaparken numuneleri buz üzerinde saklayın. NOT: Toplam proteom analizi için, 20-100 μg protein, analiz başına tipik olarak 2 μg'dan az protein sindirimi gerektiren nano LC-MS için fazlasıyla yeterlidir. Fazla peptidin hazırlanması, derin proteomik kapsama alanı gerekiyorsa replikasyon analizine veya daha fazla fraksiyonasyona izin verir. Hidrofilik etkileşim kromatografisi (HILIC) kullanılarak glikopeptid zenginleştirme bazlı analiz için 100-500 μg protein gereklidir.</li>
	<li>Örnekleri azaltın ve alkilat alın.<ol>
<li>1x'lik son konsantrasyon için numunelere 10x indirgeme/alkilasyon tamponunun hacminin 1/10'da 10'unu (100 mM Tris 2-karboksiletil fosfin hidroklorür; 1 M Tris'te 400 mM 2-kloroasetamid, pH 8,5) ekleyin ve numuneleri karanlıkta 45 °C'de 30 dakika boyunca 1.500 rpm'de çalkalayarak inkübe edin. NOT: Daha düşük bir pH, SDC'nin çökelmesine neden olacağından, numunelere eklemeden önce yaklaşık 7,0-8,0 pH değerini sağlamak için 10x indirgeme/alkilasyon tamponunun pH'ını kontrol edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Numuneleri kısaca döndürün ve 1:100'lük son proteaz:protein oranı için proteazlar Tripsin/Lys-C'yi (~10 μL, 100 mM Tris, pH 8.5'te yeniden askıya alınmış) ekleyin. Sindirimi gece boyunca 37 ° C'de 1.500 rpm'de (18 saate kadar) çalkalayarak inkübe edin. Tam protein sindirimini sağlamak için, 1:50 ila 1:200 arasında bir Tripsin / Lys-C proteaz: protein oranı kullanın.</li>
	<li>Numunelere 1.25 hacim %100 izopropanol ekleyerek sindirimi söndürün. Numuneleri karıştırmak ve kısaca döndürmek için 1 dakika boyunca vorteks yapın. NOT: Numuneler daha sonra işlenmek üzere -20 °C'de saklanabilir.</li>
	<li>0.115 hacimde% 10 trifloroasetik asit (TFA; ~% 1 TFA'nın son konsantrasyonu) ekleyerek numuneleri asitleştirin, numuneleri vorteksleyin ve kısaca aşağı doğru döndürün.</li>
</ol>2. Proteom numunelerinin işlenmesi
<ol><li>Proteom örneklerinin peptit temizliği<ol>
<li>Daha önce açıklandığı gibi her numune için bir stirendivinilbenzen-ters fazlı sülfonat (SDB-RPS) Dur-kalk ekstraksiyonu (Aşama) Ucu hazırlayın54.<ol>
<li>Ampirik olarak, 50 μg peptidi bağlamak için, künt bir iğne (14 G) kullanarak 47mm2 SDB-RPS membranından üç SDB-RPS diskini çıkarın. Daha büyük peptit miktarları için, buna göre disk sayısını artırın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>SDB-RPS Aşama İpuçlarını kullanmadan önce, aşağıdaki tamponlardan en az on yatak hacmini sırayla ekleyerek ve tamponu santrifüjleme (25 °C, 3 dakika, 500 × g) ile kolon boyunca döndürerek veya bir şırınga kullanarak yavaşça basınç uygulayarak tamponu kolondan geçirerek uçları hazırlayın.<ol>
<li>Uçları 150 μL% 100 asetonitril ile ıslatın.</li>
			<li>Uçları 150 μL% 30 metanol,% 1 TFA ile 18.2 MΩ H2O'da yıkayın.</li>
			<li>Uçları 150 μL% 90 izopropanol,% 1 TFA ile dengeleyin 18.2 MΩ H2O ile dengeleyin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Numuneleri (%50 izopropanol, %1 TFA içeren) santrifüjleme (25 °C, 3 dk, 500 × g) veya bir şırınga kullanarak nazikçe basınç uygulayarak SDB-RPS Aşama Uçlarına yükleyin.</li>
		<li>SDB-RPS Aşama Uçlarını aşağıdaki tamponlarla santrifüjleme (25 °C, 3 dakika, 500 × g) veya bir şırınga kullanarak nazikçe basınç uygulayarak yıkayın. NOT: İzopropanol55 yerine etil asetat kullanımı gibi peptit olmayan kirleticileri gidermek için ek yıkamalar veya alternatif tamponlar kullanılabilir.<ol>
<li>Uçları 150 μL% 90 izopropanol,% 1 TFA ile yıkayın.</li>
			<li>Uçları 18.2 MΩ H2O'da 150 μL% 1 TFA ile yıkayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>SDB-RPS Aşama Uçlarından peptidleri, santrifüjleme yoluyla veya bir şırınga kullanarak nazikçe basınç uygulayarak %80 asetonitril içinde 150 μL %5 amonyum hidroksit ile süzün. Örnekleri tek tek tüplerde toplayın. NOT: Bir duman davlumbazında kullanmadan hemen önce plastik bir kapta %80 asetonitril içinde %5 amonyum hidroksit hazırlayın.</li>
		<li>Salınan peptitleri 25 °C'de vakum santrifüjleme ile kurutun. NOT: HILIC zenginleştirme işlemi gerçekleştiriliyorsa, peptid sızıntılarının% 1-10'u bu noktada çıkarılabilir, kurutulabilir ve toplam proteom giriş kontrolleri olarak kullanılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Glikopeptid örneklerinin zenginleştirilmesi<ol>
<li>Zwitterionic Hidrofilik Etkileşim Sıvı Kromatografisi (ZIC-HILIC) Aşama İpuçlarını daha önce açıklandığı gibi hazırlayın54,56.<ol>
<li>Kısaca, künt bir iğne (14 G) kullanarak 47 mm2 C 8 membrandan bir C8 diski çıkarın ve bir frit oluşturmak için diski bir P200 ucuna paketleyin. % 50 asetonitril,% 50 18.2 MΩ H2O içinde yeniden askıya alınmış yaklaşık 5 mm ZIC-HILIC malzemeyi, bir şırınga kullanarak hafifçe basınç uygulayarak frit üzerine ekleyin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>ZIC-HILIC Aşama Uçlarını kullanmadan önce, aşağıdaki tamponları sırayla ekleyerek ve bir şırınga kullanarak hafifçe basınç uygulayarak reçineyi şartlandırın. NOT: ZIC-HILIC reçinesinin yüzeyindeki sahte su tabakasının bütünlüğünü sağlamak için (glikopeptidleri zenginleştirmek için gereklidir), reçine daima ıslak kalmalıdır. Reçineyi yıkarken, reçinenin üzerinde her zaman ~10 μL çözücü bırakın ve yıkamaların/numunelerin doğrudan bu artık çözücüye pipetlendiğinden emin olun.<ol>
<li>Reçineyi 20 yatak hacmi (200 μL) ZIC-HILIC elüsyon tamponu (18.2 MΩ H2O'da %0.1 TFA) ile dengeleyin.</li>
			<li>Reçineyi 20 yatak hacmi (200 μL) ZIC-HILIC preparat tamponu (18.2 MΩ H2O'da% 95 asetonitril) ile yıkayın.</li>
			<li>Reçineyi 20 yatak hacmi (200 μL) ZIC-HILIC yükleme/yıkama tamponu ile yıkayın (%80 asetonitril, %1 TFA 18,2 MΩ H2O ile dengelenmiştir).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kurutulmuş sindirilmiş numuneleri (adım 2.1.6'dan itibaren) ZIC-HILIC yükleme/yıkama tamponunda 4 μg/μL'lik son konsantrasyona kadar yeniden askıya alın (örneğin, 200 μg peptid için, 50 μL ZIC-HILIC yükleme/yıkama tamponunda yeniden askıya alın). Numunelerin yeniden askıya alındığından emin olmak için 1 dakika boyunca kısaca vorteks yapın ve 25 ° C'de 2.000 × g'de 1 dakika aşağı doğru döndürün.</li>
		<li>Yeniden askıya alınmış peptit numunesini şartlandırılmış bir ZIC-HILIC kolonuna yükleyin.<ol>
<li>Bir şırınga kullanarak nazikçe basınç uygulayarak 20 yatak hacmi (200 μL) ZIC-HILIC yükleme/yıkama tamponu (toplam 60 yatak hacmi yıkaması için) ile üç kez yıkayın.</li>
			<li>20 yatak hacimli (200 μL) ZIC-HILIC elüsyon tamponuna sahip suute glikopeptidleri, bir şırınga kullanarak hafifçe basınç uygulayarak 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve ardından 25 ° C'de vakum santrifüjleme ile elüatı kurutun.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. Proteom/glikopeptid ile zenginleştirilmiş örneklerin LC-MS'si
<ol><li>Tampon A* (% 2 asetonitril, % 0.1 TFA) içindeki numuneleri 1 μg / μL'lik bir nihai konsantrasyona kadar yeniden askıya alın (örneğin, 50 μg peptid için, 50 μL Tampon A* içinde yeniden askıya alın).</li>
	<li>Glikopeptitlerlerin ayrılmasını ve tanımlanmasını sağlamak için numuneleri bir MS'e bağlı bir HPLC / UPLC üzerine yükleyin. NOT: İç çap, uzunluk, akış hızları, kromatografi reçinesinin tipi ve gerekli peptid enjeksiyon miktarları dahil olmak üzere sütun parametreleri, kullanılacak analitik kurulum ve gradyan uzunluğu için optimize edilmelidir; analitik kurulumların optimizasyonunun nasıl gerçekleştirileceğine dair bir örnek için bkz:57.</li>
	<li>Elde edilen MS verilerinin toplanmasını izleyin ve verilerin istenen parametrelerle toplandığından emin olun. NOT: Kompozisyonel analiz için CID parçalanması yeterlidir. Glikopeptidlere glikanların eklenmesi nedeniyle, glikopeptid iyonları tipik olarak glikozillenmemiş peptitlerden daha yüksek m / z ve daha düşük yük yoğunluğu ile gözlenir. Bu iyonların gözlemlenebilir olmasını sağlamak için, 400 ila 2.000 m / z arasında bir MS1 kütle aralığına izin verin.</li>
	<li>CID kullanılarak seçilen iyonların fragmanı, glikanların karakterizasyonu için önemli olan oksonyum iyonlarını içeren düşük m / z fragman iyonlarının toplanmasını sağlar. NOT: CID kullanılarak glikopeptidlerin parçalanması, hem peptit hem de glikan dizilerinden ve ayrıca parçalanma sırasında uygulanan enerjiden etkilenir25,58,59. Bir dizi farklı çarpışma enerjisi kullanılabilirken, glikopeptidleri parçalamak için en uygun strateji, çoklu çarpışma enerjilerinin kullanımını birleştiren kademeli çarpışma enerjilerinin kullanılmasıdır25,59,60.</li>
	<li>Varsa, saha lokalizasyonu için ETD veya glikan bileşimlerinin belirlenmesine yardımcı olması için IT-CID gibi alternatif parçalanma yöntemleri kullanın. NOT: Bu parçalanma yaklaşımlarının hiçbiri bileşimsel analiz için gerekli değildir, ancak ilgilenilen glikopeptitlerlerin daha fazla sorgulanmasını sağlamak için toplanabilir.</li>
</ol>4. Proteom/glikopeptid ile zenginleştirilmiş numunelerin analizi
<ol><li>FragPipe'da aramayı etkinleştirmek için veri dosyalarını önceden filtreleme<ol>
<li>Veri kümeleri içinde ETD veya IT-CID taramaları alınmışsa, FragPipe ile arama yapmadan önce MSConvert61'i kullanarak bu tarama olaylarını veri dosyalarından filtreleyin. NOT: Aşağıda özetlenen açık arama parametreleri için yalnızca ışın tipi CID verileri gereklidir.</li>
	</ol></li>
	<li>FragPipe'da açık aramalar gerçekleştirme<ol>
<li>FragPipe'ı açın ve İş Akışı sekmesini tıklatın. İş akışı açılır menüsünde, Aramayı aç seçeneğini belirleyin ve aranacak veri dosyalarını FragPipe'a içe aktarmak için Dosya ekle'yi tıklatın (Şekil 2A).</li>
		<li>Veritabanı sekmesini tıklatın ve İndir'i tıklatarak indirme yöneticisini başlatın. Bu, proteom veritabanlarının bir Uniprot Proteome ID kullanılarak Uniprot'tan indirilmesine izin verir. Tuzakları ve kirletici proteinleri veritabanlarına dahil etmek için indirme yöneticisindeki Tuzakları ve kirleticileri ekle seçeneğini tıklatın.</li>
		<li>Daha katı FDR eşikleri için Doğrulama sekmesini tıklatın ve Filtre ve rapor değerini 0,01'den gerekli FDR'ye değiştirin. NOT: Varsayılan FragPipe ayarları, protein seviyesinde% 1'lik bir FDR sağlayacaktır.</li>
		<li>MSfragger sekmesini tıklatın. Tepe eşleştirme kutusunda, büyük değişikliklerin tanımlanmasına izin vermek için Öncü kütle toleransını varsayılan 500 Da'dan 2.000 Da'ya yükseltin (Şekil 2A).</li>
		<li>Çalıştır sekmesine tıklayın ve FragPipe çıktılarının konumunu tanımlayın. Aramaya başlamak için Çalıştır düğmesini tıklatın.</li>
	</ol></li>
	<li>Veri kümeleri arasında tanımlanan PSM'leri kullanarak (FragPipe'ın psm.tsv çıktılarında bulunur), veri kümeleri içinde gözlemlenen delta kütlelerinin sıklığını çizerek potansiyel glikanları tanımlayın (Şekil 3). PRIDE katılımı PXD027820 aracılığıyla erişilebilen R betiklerini kullanarak MSfragger çıktılarından delta kütle grafikleri oluşturun. NOT: Açık arama sonuçlarının en az sonradan işlenmesi bu komut dosyalarında gerçekleştirilir, çünkü bu komut dosyalarının temel amacı delta kütle profillerinin görselleştirilmesine yardımcı olmaktır. Önemli olarak, bol miktarda delta kütlesinin tek başına gözlemlenmesi, bir modifikasyonun potansiyel bir glikan olduğunun kanıtı değildir, çünkü delta kütlelerinin glikanlar olarak atanması, karşılık gelen MS2 olaylarının daha fazla analizini gerektirir.</li>
	<li>Numuneler içindeki glikopeptidlerin karakterizasyonunu sağlamak için, yüksek hiperskorlu atamalara karşılık gelen yüksek güvenilirlikli delta kütle tanımlamalarına odaklanın.<ol>
<li>Glikopeptid spektrumlarının değerlendirilmesine yardımcı olmak için, glikan ile ilişkili iyonların manuel olarak tanımlanmasına izin veren spektrumlar içinde peptid ile ilişkili iyonların atanmasını sağlayan İnteraktif Peptit Spektral Açıklamalı63 gibi peptid ek açıklama araçlarını kullanın (Şekil 4). NOT: Burada sunulan veri kümelerinde, >30'luk hiperskorlar, tanımlanan tüm glikopeptitlerlerin en üst% 50'sindeki puanlara karşılık geldiğinden, yüksek puanlama olarak kabul edilir (Şekil 5).</li>
	</ol></li>
	<li>Yüksek güvenilirliğe sahip glikopeptidler atandığında, glikopeptidlerin tanımlanmasını iyileştirmek için yaygın olarak gözlenen glikan ile ilişkili iyonları tanımlayın (Şekil 4). NOT: Glikan odaklı aramalar olarak bilinen aramalara glikan ile ilişkili iyonları dahil ederek, glikopeptid atamalarının kalitesi artırılabilir.<ol>
<li>FragPipe'ın MSfragger sekmesini tıklatın, gözlemlenen glikanların belirlenen delta kütlelerini Değişken modifikasyonlar ve Kütle Ofsetleri bölümlerine ekleyin. Değişken modifikasyonları ve Kütle Ofsetleri bölümlerine değerleri / ile ayrılmış ayrı ayrı kütlelerle yazarak bu kütleleri ekleyin. Bu glikanların glikanla ilişkili fragman kütlelerini MSFragger'ın Gliko/Labil modları bölümüne ekleyin. NOT: Şekil 2B, A. baumannii suşu AB307-0294'ün glikan odaklı bir araştırması için gereken temel bilgileri özetlemektedir.</li>
	</ol></li>
	<li>Proteomik çalışmalarla ilişkili tüm MS verilerini PRIDE veya MASSIVE depoları gibi merkezi Proteomik depolara yükleyin. NOT: Bu çalışmayla ilişkili tüm veriler PRIDE proteomik deposuna yatırılmıştır ve PRIDE katılımı aracılığıyla erişilebilir: PXD027820.</li>
</ol>

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Açık arama, bilinmeyen değişikliklerin tanımlanması için etkili ve sistematik bir yöntemdir. Bakteriyel proteom numuneleri içinde bilinmeyen glikanların tanımlanması geleneksel olarak zaman alıcı ve teknik olarak uzmanlaşmış bir girişim olsa da, MSfragger 21,41 ve Byonic 31,38 gibi araçların son gelişmeleri, peptitlere bağlı potansiyel glikanlar olarak daha fazla karakterizasyon için delta kütlelerinin hı...

Karbonhidratların protein moleküllerine bağlanma işlemi olan protein glikozilasyonu, doğada en yaygın post-translasyonel modifikasyonlardan (PTM'ler) biridir 1,2. Yaşamın tüm alanlarında, sayısız hücresel fonksiyonu etkileyen glikoproteinlerin üretimine adanmış bir dizi karmaşık makine gelişmiştir 1,3,4,5. Protein glikozilasyonubir dizi amino asit 6,7 üzerinde meydana gelirken, N'ye bağlı ve O'ya bağlı glikozilasyon olayları doğada gözlenen iki baskın formdur. N'ye bağlı glikozilasyon, glikanların asparagin (Asn) kalıntılarının bir azot atomuna bağlanmasını içerirken, O'ya bağlı glikozilasyonda, glikanlar serin (Ser), treonin (Thr) veya tirozin (Tyr) kalıntılarının bir oksijen atomuna bağlanır7. Glikozilasyon sistemleri tarafından hedeflenen kalıntılardaki benzerliklere rağmen, proteinlere bağlı glikanlar içindeki farklılıklar, glikozilasyonun doğada bulunan PTM'lerin kimyasal olarak en çeşitli sınıfı olmasına neden olur.
Ökaryotik glikozilasyon sistemleri glikan çeşitliliğine sahipken, bu sistemler tipik olarak kullanılan benzersiz karbonhidrat sayısında sınırlıdır. Ortaya çıkan çeşitlilik, bu karbonhidratlarınglikanlara nasıl düzenlendiğinden kaynaklanmaktadır 8,9,10,11,12. Buna karşılık, bakteri ve arkeal türler, bu sistemlerde üretilen benzersiz şekerlerin çok çeşitliolması nedeniyle neredeyse sınırsız glikan çeşitliliğine sahiptir 2,10,13,14,15,16,17. Yaşam alanları arasında gözlenen glikan çeşitliliğindeki bu farklılıklar, glikozilasyon olaylarının karakterizasyonu ve tanımlanması için önemli bir analitik zorluğu temsil etmektedir. Ökaryotik glikozilasyon için, glikan bileşimlerini tahmin etme yeteneği, glikobiyolojiye artan ilgiyi kolaylaştırmıştır; Bununla birlikte, aynı şey, hala büyük ölçüde uzmanlaşmış laboratuvarlar tarafından çalışılmakla sınırlı olan bakteriyel glikozilasyon için geçerli değildir. Biyobilimlerde kütle spektrometresi (MS) enstrümantasyonunun erişilebilirliği arttıkça, MS tabanlı yaklaşımlar artık glikoproteomik analiz için birincil yöntemdir.
MS, glikozilasyonun karakterizasyonu için mükemmel bir araç olarak ortaya çıkmıştır ve hem yukarıdan aşağıya hem de aşağıdan yukarıya yaklaşımlar şimdi glikoproteinleri karakterize etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır6. Yukarıdan aşağıya proteomikler, spesifik proteinlerin18,19 küresel glikozilasyon paternlerini değerlendirmek için kullanılırken, aşağıdan yukarıya yaklaşımlar, glikopeptidlerin glikana özgü karakterizasyonunu sağlamak için, karmaşık karışımlardan bile6,20,21,22,23 kullanılır. Glikopeptidlerin analizi için, bilgilendirici parçalanma bilgisinin üretilmesi, glikozilasyon olaylarının karakterizasyonu için gereklidir24,25. Rezonans iyon tuzağına dayalı çarpışma kaynaklı ayrışma (IT-CID), ışın tipi çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) ve elektron transferi ayrışması (ETD) dahil olmak üzere bir dizi parçalanma yaklaşımına artık aletler üzerinde rutin olarak erişilebilir. Her yaklaşım, glikopeptid analizi 25,26 için farklı güçlü ve zayıf yönlere sahiptir ve son on yılda bu parçalanma yaklaşımlarının glikozilasyonu analiz etmek için uygulanmasında önemli ilerlemeler kaydedilmiştir 6,20. Bununla birlikte, bakteriyel glikozilasyon analizi için kritik sınırlama, glikopeptidleri parçalama yeteneği değil, numuneler içindeki potansiyel glikan bileşimlerini tahmin edememe olmuştur. Bu sistemlerde, çeşitli bakteriyel glikanların bilinmeyen doğası, O-Pair27, GlycopeptideGraphMS28 ve GlycReSoft29 gibi ökaryotik glikopeptidlerin analizi için artık yaygın olan glikozilasyon odaklı arama araçlarıyla bile, glikopeptidlerin tanımlanmasını sınırlar. Bu sorunun üstesinden gelmek için, bakteriyel glikozilasyon çalışması için güçlü bir yaklaşım olarak ortaya çıkan açık arama araçlarının kullanımı ile alternatif bir arama yöntemi gereklidir30.
Kör veya joker karakter arama olarak da bilinen açık arama, bilinmeyen veya beklenmeyen PTM'lere sahip peptitlerin tanımlanmasına izin verir 21,30,31,32. Açık aramalar, seçilmiş değişiklik aramaları, çok adımlı veritabanı aramaları veya geniş kütle toleranslı arama33,34,35,36,37 dahil olmak üzere çeşitli hesaplama tekniklerini kullanır. Açık arama büyük bir potansiyele sahip olmasına rağmen, kullanımı tipik olarak, analiz sürelerindeki önemli artış ve sınırlı aramalara kıyasla değiştirilmemiş peptitlerin tespitindeki hassasiyet kaybı nedeniyle engellenmiştir31,32. Modifiye edilmemiş peptid-spektral eşleşmelerin (PSM'ler) tespitindeki azalma, istenen yanlış keşif oranlarını (FDR'ler) korumak için artan sıkı filtreleme gerektiren bu tekniklerle ilişkili artan yanlış pozitif PSM oranlarının bir sonucudur 33,34,35,36,37 . Son zamanlarda, Byonic 31,38, Open-pFind39, ANN-SoLo 40 ve MSFragger21,41 dahil olmak üzere açık aramanın erişilebilirliğini önemli ölçüde artıran çeşitli araçlar kullanıma sunulmuştur. Bu araçlar, analiz sürelerini önemli ölçüde azaltarak ve heterojen glikan bileşimlerini işlemek için yaklaşımlar uygulayarak glikozilasyon olaylarının sağlam bir şekilde tanımlanmasını sağlar.
Bu makalede, Gram-negatif nozokomiyal patojen Acinetobacter baumannii'yi model olarak kullanarak, bakteriyel glikopeptidlerin açık arama yoluyla tanımlanması için kolaylaştırılmış bir yöntem sunulmaktadır. A. baumannii, PglL protein glikozilasyon sistemi42,43,44 olarak bilinen çoklu protein substratlarının modifikasyonundan sorumlu korunmuş bir O-bağlantılı glikozilasyon sistemine sahiptir. Benzer proteinler suşlar arasında glikozilasyon için hedeflenirken, PglL glikozilasyon sistemi, kapsül lokusundan (K-lokus olarak bilinir) türetilen protein glikozilasyonu için kullanılan glikanın biyosentezi nedeniyle oldukça değişkendir4,45,46. Bu, tek veya sınırlı polimerize K-birimlerinden türetilen çeşitli glikanların (K-birimi olarak da bilinir) protein substratlarına 30,44,46 eklenmesiyle sonuçlanır. Bu çalışmada, FragPipe yazılımı içindeki açık arama aracı MSfragger'ın kullanımı, A. baumannii suşları arasındaki glikanları tanımlamak için kullanılmıştır. Açık arama ve manuel kürasyonu birleştirerek, bakteriyel glikopeptidlerin tanımlanmasını daha da iyileştirmek için "glikan odaklı aramalar" yapılabilir. Birlikte, bu çok adımlı tanımlama yaklaşımı, yeni glikozilasyon olaylarının karakterizasyonunda geniş deneyime sahip olmadan glikopeptidlerin tanımlanmasını sağlar.

<table><tbody><tr><td>14 G Kel-F Hub noktası stili 3</td><td>Hamilton şirketi</td><td>hanc90514</td><td></td></tr><tr><td>2-Kloroasetamid</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>C0267-100G</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>34851-4L</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum hidroksit (% 28)</td> <td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>338818-100ML</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Test Reaktifi</td><td>A Pierce</td><td>23228</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Tahlil Reaktifi B</td><td>Pierce</td><td>23224</td><td></td></tr><tr><td>C8 Empore SPE</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>66882-U</td><td>C8 malzemesi için alternatif bir satıcı Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)</td></tr> <tr><td>Formik asit</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>5.33002</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>650447-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>M/4058/17</td><td></td></tr><tr><td>SDB-RPS Empore SPE (Ters Fazlı Sülfonat)</td> <td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>66886-U</td><td>SDB-RPS için alternatif bir satıcı Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)</td></tr> <tr><td>Sodyum Deoksikolat</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>2232000083</td><td></td></tr><tr><td>trifloroasetik asit</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>302031-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris 2-karboksietil fosfin hidroklorür</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>Tris (hidroksimetil) aminometan</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>252859-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin / Lys-C proteaz karışımı</td><td>Promega</td><td>V5073</td><td></td></tr><tr><td>Vakum yoğunlaştırıcı</td><td>Labconco</td><td>7810040</td><td></td></tr><tr><td>ZIC-HILIC malzeme</td><td>Tek</td><td></td><td>kullanımlık SPE kolonlarında kullanım için Merck 1504580001 Reçinesi, daha büyük bir form kolonunun boşaltılması ve serbest reçinenin kullanılmasıyla elde edilebilir</td></tr></tbody></table>

acinetobacter baumannii o-bağlantılı glikopeptitlerlerin tanımlanması için açık arama tabanlı yaklaşımların uygulanması

The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides

Protein glikozilasyonu, bakteriyel organizmalar içinde yaygın bir modifikasyon olarak giderek daha fazla kabul görmekte ve prokaryotik fizyolojiye ve patojenik türlerin optimal enfektivitesine katkıda bulunmaktadır. Bu nedenle, bakteriyel glikozilasyonun karakterize edilmesine olan ilgi artmakta ve bu olayları tanımlamak için yüksek verimli analitik araçlara ihtiyaç duyulmaktadır. Aşağıdan yukarıya proteomikler, zengin glikopeptid verilerinin üretilmesini kolayca sağlasa da, prokaryotik türlerde gözlenen glikanların genişliği ve çeşitliliği, bakteriyel glikozilasyon olaylarının tanımlanmasını son derece zorlaştırmaktadır.
Geleneksel olarak, bakteriyel proteomik veri kümeleri içindeki glikan bileşimlerinin manuel olarak belirlenmesi, bunu alana özgü uzmanlarla sınırlı büyük ölçüde ısmarlama bir analiz haline getirmiştir. Son zamanlarda, açık arama tabanlı yaklaşımlar, bilinmeyen değişikliklerin tanımlanması için güçlü bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Peptit dizileri üzerinde gözlenen benzersiz modifikasyonların sıklığını analiz ederek, açık arama teknikleri, karmaşık numuneler içindeki peptitlere bağlı ortak glikanların tanımlanmasına izin verir. Bu makale, glikoproteomik verilerin yorumlanması ve analizi için kolaylaştırılmış bir iş akışı sunmakta ve glikan bileşimleri hakkında önceden bilgi sahibi olmadan bakteriyel glikopeptidleri tanımlamak için açık arama tekniklerinin nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Bu yaklaşımı kullanarak, glikozilasyon farklılıklarını anlamak için numunelerdeki glikopeptidler hızla tanımlanabilir. Acinetobacter baumannii'yi model olarak kullanan bu yaklaşımlar, suşlar arasındaki glikan bileşimlerinin karşılaştırılmasını ve yeni glikoproteinlerin tanımlanmasını sağlar. Birlikte ele alındığında, bu çalışma, bakteriyel glikozilasyonun tanımlanması için açık veritabanı arama tekniklerinin çok yönlülüğünü göstermekte ve bu çok çeşitli glikoproteomların karakterizasyonunu her zamankinden daha kolay hale getirmektedir.

Bakteriyel glikopeptid analizi için açık aramanın yararlılığını göstermek için, A. baumannii-AB307-0294, ACICI ve D1279779-'un üç suşu içindeki O'ya bağlı glikanların kimyasal çeşitliliği değerlendirildi. O-bağlı glikoproteomlar A. baumannii suşları arasında oldukça değişkendir, çünkü glikozilasyon için kullanılan glikanlar oldukça değişken kapsül lokus44,45,46'dan türetilir. Bu kimyasal çeşit...

Açık arama, daha önce bilinmeyen glikan bileşimleriyle süslenmiş glikopeptidlerin tanımlanmasını sağlar. Bu makalede, Acinetobacter baumannii'yi model olarak kullanan bakteriyel örnekler için açık arama ve müteakip glikan odaklı glikopeptid aramaları yapmak için kolaylaştırılmış bir yaklaşım sunulmuştur.

Acinetobacter baumannii O-bağlantılı Glikopeptitlerlerin Tanımlanması için Açık Arama Tabanlı Yaklaşımların Uygulanması

Protein glycosylation is increasingly recognized as a common modification within bacterial organisms, contributing to prokaryotic physiology and optimal ...

Bu protokol, bakteriyel glikop% eptidlerin tanımlanmasını kolaylaştırarak, araştırmacıların yeni glikozilasyon olaylarını ve ayrıca suşlar arasındaki glikozilasyon için kullanılan glikanlardaki farklılıkları tanımlamalarını sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, glikozilasyon dışı uzmanların bakteriyel proteom numunelerindeki potansiyel glikozilasyon olaylarını tanımlamalarını sağlamasıdır. Açık arama, sadece glikozilasyon değil, bir dizi modifikasyonun tanımlanması için kullanılabilecek ve herhangi bir proteom örneğine uygulanabilecek genel olarak uygulanabilir bir yaklaşımdır.STB-RPS dur-kalk ekstraksiyon uçlarını hazırlamak için, 50 mikrogram peptit bağlamak üzere 47 milimetrelik STB-RPS membranından üç STB-RPS diskini çıkarmak üzere 14 gauge künt iğne kullanın. Daha büyük peptit miktarları için, buna göre disk sayısını artırın. SDB-RPS aşama uçlarını kullanmadan önce, 150 mikrolitre %100 asetonitril ekleyerek ve tamponu santrifüjleme veya bir şırınga kullanarak nazikçe basınç uygulayarak döndürerek uçları yıkayın.Daha sonra, uçları% 1 TFA içeren 150 mikrolitre% 30 metanol ile yıkayın, ardından% 1 TFA içeren 150 mikrolitre% 90 izopropanol ile dengeleyin. Dengelemeden sonra, proteom numunelerini santrifüjleme veya bir şırınga kullanarak STB-RPS aşama uçlarına yükleyin. Daha sonra, uçları% 1 TFA içeren 150 mikrolitre% 90 izopropanol ve ardından 150 mikrolitre% 1 TFA ile yıkayın.Peptitleri STB-RPS aşama uçlarından çıkarmak için, tek bir uca ilave edilmiş 150 mikrolitre% 5 amonyum hidroksit ve% 80 asetonitril kullanın ve bir şırınga kullanarak yavaşça basınç uygulayarak salınan numuneleri ayrı tüplerde toplayın. Alternatif olarak, santrifüjleme yoluyla salınıyorsa, tüm aşama uçlarına eklenen% 80 asetonitril içinde% 5 amonyum hidroksitte 150 mikrolitre kullanın ve temiz bir plakada toplayın. Salınımlı peptitleri 25 santigrat derecede vakum santrifüjleme ile kurutun.Daha sonra, glikopeptid örneklerini zenginleştirmek için, bir zwitterionic hidrofilik etkileşim sıvı kromatografisi veya ZIC-HILIC, aşama uçları hazırlayın. 14 gauge künt iğne kullanarak 470 milimetre karelik bir C8 membrandan bir C8 diski çıkarın ve bir frit oluşturmak için diski bir P-200 ucuna paketleyin. Daha sonra,% 50 asetonitril içinde yeniden askıya alınmış yaklaşık beş milimetre ZIC-HILIC malzemesini, bir şırınga kullanarak hafifçe basınç uygulayarak frit üzerine ekleyin.Uçları kullanmadan önce, reçineyi 20 yatak hacimli ZIC-HILIC elüsyon tamponu ile dengeleyin ve reçinenin kurumamasını sağlamak için reçinenin üzerinde 10 mikrolitre hacim bırakın. Daha sonra, reçineyi sırayla 20 yatak hacimli ZIC-HILIC hazırlama tamponu ve ardından 20 yatak hacimli ZIC-HILIC yükleme veya yıkama tamponu ile yıkayın. Daha sonra, ZIC-HILIC yükleme tamponundaki sindirilmiş ve kurutulmuş peptitleri, mikrolitre başına dört mikrogramlık son bir konsantrasyona kadar askıya alın.Numunelerin yeniden askıya alındığından emin olmak için bir dakika boyunca kısaca vorteks yapın, ardından 2000 kez G ve 25 santigrat derecede bir dakika döndürün. Eğirdikten sonra, yeniden askıya alınmış peptit numunesini şartlandırılmış ZIC-HILIC kolonuna yükleyin, ardından bir şırınga kullanarak hafifçe basınç uygulayarak kolonu 20 yatak hacimli ZIC-HILIC yükleme tamponu ile üç kez yıkayın. Son olarak, glikopeptidleri 20 yatak hacimli ZIC-HILIC elüsyon tamponu ile 1.5 mililitrelik bir tüpe bir şırınga kullanarak hafifçe basınç uygulayarak süzün, ardından elüenti 25 santigrat derecede vakum santrifüjleme ile kurutun.LC-MS analizi için, Tampon A*'daki numuneleri mikrolitre başına bir mikrogramlık son konsantrasyona kadar yeniden askıya alın, ardından glikopeptitlerlerin ayrılmasını ve tanımlanmasını sağlamak için numuneleri bir MS'e bağlı bir HPLC-UPLC üzerine yükleyin. Elde edilen MS veri toplamayı izleyin ve verilerin istenen parametrelerle toplandığından emin olun. Proteom ve glikopeptid ile zenginleştirilmiş numuneleri analiz etmek için FragPipe'ı açın ve İş Akışı sekmesine tıklayın.İş akışı açılır menüsünden, Aramayı aç seçeneğini belirleyin ve aranacak veri dosyalarını FragPipe'a aktarmak için Dosya ekle'yi tıklatın. Ardından, bir UniProt katılım numarası kullanarak proteome veritabanlarını UniProt'tan indirmek üzere indirme yöneticisini başlatmak için Veritabanı sekmesine ve ardından İndir'e tıklayın. İndirme yöneticisinde, aldatıcı ve kirletici proteinleri bu veritabanına dahil etmek için Tuzaklar ve kirleticiler ekle seçeneğini tıklatın.Ardından, MSFragger sekmesini tıklatın, ardından Tepe Eşleştirme kutusunda, büyük değişiklikleri tanımlamak için Öncü kütle toleransını varsayılan 500 daltondan 2.000 daltona yükseltin. FragPipe çıktılarının konumunu tanımlamak için Çalıştır sekmesini tıklayın, ardından aramaya başlamak için Çalıştır düğmesine tıklayın. Yüksek güvenilirliğe sahip glikopeptidler atandığında, glikopeptidlerin tanımlanmasını iyileştirmek için yaygın olarak gözlenen glikan ile ilişkili iyonları tanımlayın.Ardından, MSFragger sekmesine tıklayın ve gözlemlenen glikanların belirlenen delta kütlelerini, tek tek kütleleri eğik çizgiyle ayrılmış Değişken modifikasyonlar ve Kütle ofsetleri bölümlerine ekleyin. Daha sonra, bu glikanların glikanla ilişkili fragman kütlelerini MSFragger'ın Gliko / Labil Modları bölümüne ekleyin. Son olarak, proteomik çalışmalarla ilişkili tüm MS verilerini PRIDE veya MassIVE depoları gibi merkezi proteomik depolara yükleyin.Acinetobacter baumannii suşu AB307-0294'ün açık araştırması, 648.25 ve 692.28 daltonlarına karşılık gelen iki baskın delta kütlesi ortaya çıkardı. ACICU kapsülünün, 843.31 daltonluk öngörülen bir kütleye karşılık gelen bir tetrasakkarit K biriminden oluştuğu bilinmektedir. Bu kapsül yapısı, ACICU içinde en sık gözlenen delta kütlesi ile tutarlıdır.D1279779 suşunun açık arama analizi, 203.08, 794.31 ve 1588.62 dalton ile tutarlı çoklu delta kütlelerinin varlığını ortaya koymuştur. İnteraktif peptid spektral annotatörü kullanılarak, üç A.baumannii suşunda tanımlanan glikopeptitler, potansiyel glikan ile ilişkili iyonları ortaya çıkararak değerlendirildi. Glikan odaklı aramalar, ACICU'da% 37'lik bir artışa, AB307-0294'te% 117'lik bir artışa ve D1279779'da% 363'lük bir artışa karşılık gelen üç A.baumannii suşunun hepsinde tanımlanan toplam glikopeptid / peptid spektral eşleşme sayısında kayda değer bir artışa yol açmıştır.Bireysel MS olayları için, glikan-spesifik bilgilerin dahil edilmesi tipik olarak gözlenen Hiperskoru arttırır, ancak bu artış yüksek oranda glikana bağımlıdır. ZIC-HILIC zenginleştirme işlemini gerçekleştirirken, reçinenin her zaman ıslak kalmasını sağlayın, çünkü çözücü kaybı glikopeptitlerlerin izolasyonunu tehlikeye atabilir. Glikozilasyondaki farklılıklarla ilgili veriler, mutagenez çalışmalarını bilgilendirmek veya glikan biyosentezinden sorumlu gen sınıflarını tanımlamak için kullanılabilir.Açık veritabanı aramasını kullanarak, bakteri cinsleri arasında glikan çeşitliliğini karakterize etmeye başladık. Bu, bakteriyel glikozilasyonun bir zamanlar düşündüğümüzden hem daha yaygın hem de çok daha çeşitli olduğunu göstermiştir.

the-application-open-searching-based-approaches-for-identification

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Biz son zamanlarda basit bir bakteriyel tespiti için floresan assay "mix-ve-okuma" kurmak için uygulanabilir Flourogenik DNAzyme probları üretmek için yeni bir yaklaşım bildirdin. Bu özel DNA sondaları böylece floresans sinyali kuşağa bakteriyel algılama çevirme belirli bakteri tarafından üretilen ham hücre dışı karışımı (CEM) varlığında, bir kromofor-değiştirilmiş-DNA RNA kimerik substratın bölünme katalize. Bu yazıda, "RFD-EC1" ifade belirli bir DNAzyme prob modeli bakterinin tespiti için...

Flourogenik DNAzymes kullanarak Bakterilerin Tespiti

Biz hızlı bakteri bulunması ve belirlenmesi için bir elektrokimyasal sensör test yöntem açıklanmaktadır. Tahlil, ribozomal RNA (rRNA) türe özgü dizileri için DNA oligonükleotid probları yakalama fonksiyonuna sahip bir sensör dizisi içerir. Yakalama prob ve yaban turpu peroksidaz bağlı DNA oligonükleotid dedektör prob ile hedef rRNA Sandwich melezleme ölçülebilir bir amperometrik akım üretir.

Elektrokimyasal Sensörler kullanarak Bakteriyel Algılama ve Tanıma

Matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon uçuş süresi kütle spektrometresi (MALDI-TOF MS) ve moleküler teknikler (16S rRNA gen dizilimi), rutin teşhiste nadir görülen bakteriyel patojenlerin tanımlanmasına izin verir. Bu protokolün amacı, daha doğru ve güvenilir verilere yol açan her iki tekniğin kombinasyonunda yatmaktadır.

16S rRNA gen Sıralama ve MALDI-TOF MS tarafından Nadir Bakteriyel patojenlerin tanımlanması

IDBac, bakteriyel kolonilerden kazınmış hücre malzemesinde toplanan, hem bozulmamış protein hem de özel metabolit spektrumlu verileri birleştiren açık kaynaklı Kütle Spektrometrisi bazlı Biyoinformatik boru hattıdır. Boru hattı araştırmacılar hızlı bir şekilde on binlerce bakteriyel koloniler Putatif taksonom gruplara düzenlemek için izin verir ve daha fazla özel metaboliti üretimi dayalı ayırt.

Mikrobiyal protein ve özel metabolit verilerinin analizi için açık kaynak MALDı TOF-MS ıdbac Pipeline kullanma

Gram-negatif bakteriler iki mekansal olarak ayrılmış membran üretirler. Dış zar bir periplazm ve peptidoglikan tabakası ile iç zardan bölümlenir. Bu mikropların çift iki katmanlı izole yeteneği fizyolojisi ve patogenezini anlamak için kritik olmuştur.

Gram-negatif Bakteriler için Hücre Zarfının İç ve Dış Membran Fraksiyonlarına Ayrılması Acinetobacter baumannii için Teknik Ayarlamalar

Bu protokol, gelişmiş özellik ekstraksiyonu ve biyoinformatik analiz yazılımı ile birlikte sıvı kromatografi kütle spektrometresi kullanılarak peptidoglikan bileşiminin ayrıntılı bir analizini kapsar.

Peptidoglikanın Sıvı Kromatografisi, Kütle Spektrometrisi ve Biyoinformatik ile Yarı Kantitatif Analizi

Burada, maldi-TOF-TOF tandem kütle spektrometresi ve yukarıdan aşağıya proteomik analiz kullanılarak genomik olarak sıralanmış patojenik bakteriler tarafından üretilen proteinlerin şirket içinde geliştirilen yazılımla hızlı tanımlanması için bir protokol sunuyoruz. Metastable protein iyonları, aspartik asit etkisi nedeniyle parçalanır ve bu özgüllük protein tanımlaması için yararlanılmıştır.

MALDI-TOF-TOF-MS/MS ve Yukarıdan Aşağıya Proteomik Analiz kullanılarak Escherichia coli'de Antibakteriyel Bağışıklık Proteinlerinin Tanımlanması

EUCAST, otomatik kan kültürleri için doğrudan bir antimikrobiyal duyarlılık testi (AST) protokolü geliştirmiştir. Bununla birlikte, kütle spektrometresi tabanlı mikrobiyal tanımlamaya bağımlılığı, otomatik bir mikrobiyal tanımlama sisteminde doğrudan bir aşı hazırlama protokolü kullanılarak ortadan kaldırılabilir. Bu yaklaşım, numune alındıktan sonraki 24 saat içinde AST raporları sağlayabilir.

Kütle Spektrometresi Olmadan EUCAST RAST Yöntemini Kolaylaştırmak için Otomatik Bir Mikrobiyal Tanımlama Sistemi Kullanarak Doğrudan Mikrobiyal Tanımlama

Acinetobacter baumannii'nin hızlı ve hassas tespitini kolaylaştırmak için, A. baumannii enfeksiyonlarını tanımlamak için LbaCas12a endonükleaz ile birlikte Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu (RPA) kullanan bir protokol sunuyoruz.

Rekombinaz polimeraz amplifikasyonu/Cas12a tabanlı bir sistem kullanılarak Acinetobacter baumannii enfeksiyonlarının hızlı ve spesifik tespiti

Yağ asitlerini saflaştırmaya gerek kalmadan tanımlamak için bir protokol öneriyoruz. Tutma süreleri hakkındaki bilgileri üç tip yağ asidi türevinin kütle spektrumları ile birleştirir: yağ asidi metil esterleri (FAME'ler), 4,4-dimetil oksazolin türevleri (DMOX) ve 3-piridilkarbinil esterler (pikolinil).

Yağ Asitlerinin Tanımlanması içinde<em&gt; Bacillus cereus</em

Keşfedin bakteri glikopeptitlerinin açık arama tabanlı tanımlanması yöntemini. Acinetobacter baumannii kullanarak yeni glikozilasyon olaylarını ve suşlar arası farklılıkları inceleyin. Bu protokol glikosilasyon uzmanı olmayan araştırmacılar için erişilebilir bir yaklaşım sunar.

Acinetobacter baumannii O-bağlantılı Glikopeptitlerlerin Tanımlanması için Açık Arama Tabanlı Yaklaşımların Uygulanması

Daha fazla video keşfet