Name: Parakrin Kanonik Olmayan Wnt Sinyalizasyonunun In Vitro Olarak Modellenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Öğrenin parakrin kanonik olmayan Wnt sinyalizasyonunu in vitro modellemeyi C2C12 ve O9-1 hücreleri kullanarak. Bu yöntem Wnt/PCP yolak bileşenlerinin fonksiyonel ve moleküler değerlendirmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen NIH ödülleri F30HL154324 tarafından O.T. ve K08HL121191 ve R03HL154301 S.R.K. tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, bu makaledeki Şekil 1'deki şemanın biorender.com ile oluşturulduğunu kabul etmek istemektedir.

<ol><li>Ho, H. Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a-Ror-Dishevelled+signaling+constitutes+a+core+developmental+pathway+that+controls+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).</li>
<li>Čapek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+Frizzled7+reveals+a+permissive+role+of+noncanonical+wnt+signaling+in+mesendoderm+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration.</a> Elife. (8), 42093(2019).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+signaling+regulates+polarized+second+heart+field+morphogenesis+to+promote+both+arterial+and+venous+pole+septation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation.</a> Development. 146 (20), 181719(2019).</li>
<li>Lutze, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+WNT-signaling+controls+differentiation+of+lymphatics+and+extension+lymphangiogenesis+via+RAC+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4739(2019).</li>
<li>Buttler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maldevelopment+of+dermal+lymphatics+in+Wnt5a-knockout-mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice.</a> Developmental Biology. 381 (2), 365-376 (2013).</li>
<li>Betterman, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+cadherin+FAT4+orchestrates+lymphatic+endothelial+cell+polarity+in+response+to+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).</li>
<li>Descamps, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled+4+regulates+arterial+network+organization+through+noncanonical+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling.</a> Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).</li>
<li>Weeraratna, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+signaling+directly+affects+cell+motility+and+invasion+of+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma.</a> Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).</li>
<li>Henry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+novel+Wnt+receptor+ROR2+is+increased+in+breast+cancer+and+may+regulate+both+%CE%B2-catenin+dependent+and+independent+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Research+and+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).</li>
<li>Anastas, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+complex+of+SCRIB%2C+NOS1AP+and+VANGL1+regulates+cell+polarity+and+migration%2C+and+is+associated+with+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression.</a> Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).</li>
<li>Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+world+of+WNT+receptor+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The complex world of WNT receptor signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).</li>
<li>Dong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+redundancy+of+frizzled+3+and+frizzled+6+in+planar+cell+polarity+control+of+mouse+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles.</a> Development. 145 (19), (2018).</li>
<li>Bernascone, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sfrp3+modulates+stromal-epithelial+crosstalk+during+mammary+gland+development+by+regulating+Wnt+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 2481(2019).</li>
<li>Hendrickx, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNT16+requires+G%CE%B1+subunits+as+intracellular+partners+for+both+its+canonical+and+noncanonical+WNT+signalling+activity+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts.</a> Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).</li>
<li>Avgustinova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+cell-derived+Wnt7a+recruits+and+activates+fibroblasts+to+promote+tumour+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness.</a> Nature Communications. (7), 10305(2016).</li>
<li>Tseng, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAPE+suppresses+migration+and+invasion+of+prostate+cancer+cells+via+activation+of+noncanonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling.</a> Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Wnt%2FCa2%2B+signaling+in+actin+cytoskeleton+remodeling+and+cell+motility+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer.</a> PLoS One. 5 (5), 10456(2010).</li>
<li>Gibbs, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prickle1+mutation+causes+planar+cell+polarity+and+directional+cell+migration+defects+associated+with+cardiac+outflow+tract+anomalies+and+other+structural+birth+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects.</a> Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).</li>
<li>Cui, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+PCP+protein+required+for+ciliogenesis%2C+regulates+directional+cell+migration+and+cell+polarity+by+direct+modulation+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton.</a> PLoS Biology. 11 (11), 1001720(2013).</li>
<li>Gombos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formin+DAAM+functions+as+molecular+effector+of+the+planar+cell+polarity+pathway+during+axonal+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).</li>
<li>Toubat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Crest+Cell-derived+Wnt5a+Regulates+Planar+Cell+Polarity+in+Cranial+Second+Heart+Field+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells.</a> Circulation. 142, Suppl_3 12540(2020).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+cell+cohesion+by+Wnt5a+during+second+heart+field+progenitor+deployment%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment.</a> Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).</li>
<li>Sinha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Wnt5a+disrupts+second+heart+field+cell+deployment+and+may+contribute+to+OFT+malformations+in+DiGeorge+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).</li>
<li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+instruction+to+output%3A+Wnt%2FPCP+signaling+in+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer.</a> Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).</li>
<li>Shi, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+Dishevelled-Mediated+Wnt+Signaling+in+Vertebrate+Early+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370(2020).</li>
<li>Butler, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity in development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).</li>
<li>Bradshaw, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+for+neural+crest+cells+during+outflow+tract+septation+in+the+neural+crest-deficient+mutant+Splotch2H%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H.</a> Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).</li>
<li>Kodo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Sema3c+and+the+interaction+between+cardiac+neural+crest+and+second+heart+field+during+outflow+tract+development%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6771(2017).</li>
<li>Waldo, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neural+crest+is+necessary+for+normal+addition+of+the+myocardium+to+the+arterial+pole+from+the+secondary+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field.</a> Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).</li>
<li>Schleiffarth, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+is+required+for+cardiac+outflow+tract+septation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice.</a> Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).</li>
<li>Nguyen, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+Manipulation+of+O9-1+Neural+Crest+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58346(2018).</li>
<li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).</li>
<li>Martinotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratch+wound+healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Scratch wound healing assay.</a> Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).</li>
</ol>

Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan etmektedir.

Kanonik olmayan Wnt/düzlemsel hücre polaritesi (PCP) sinyal yolu, çoklu gelişimsel 24,25 vehastalık süreçleri 24,26'da rol oynayan kritik öneme sahip bir hücresel sinyal yoludur. Embriyonik gelişim sırasında, kanonik olmayan Wnt sinyali, sinyal gönderen hücrelerden gelen ve sonuçta morfolojide, asimetrik organizasyonda ve sinyal alan hücrelerde yönlü göçte değişikliklere neden olan geniş bir mole...

Kanonik olmayan Wnt sinyalizasyonu, hücresel filament organizasyonunu ve yönlü göçü düzenleyen evrimsel olarak korunmuş bir yoldur. Bu yolak, embriyonik doku morfogenezi 1,2,3, lenfatik ve vasküler anjiyogenez 4,5,6,7 ve kanser büyümesi ve metastazı 8,9,10 dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçte rol oynamıştır. . Hücresel düzeyde, kanonik olmayan Wnt sinyali, sinyal gönderen ve sinyal alan hücreler arasındaki koordineli parakrin etkileşimler yoluyla gerçekleştirilir. Bu etkileşimler sıklıkla farklı soylardan veya tiplerden hücreler arasında meydana gelir ve 19 ligand'a kadar ve çoklu reseptörler, ko-reseptörler ve aşağı akış sinyal iletim efektörleri11'i içeren çeşitli bir moleküler ağı içerir. Bu sinyalleme sürecini daha da karmaşıklaştıran önceki çalışmalar, ligand-reseptör kombinasyonlarının bağlam ve dokuya bağımlı bir şekilde değişebileceğini göstermiştir 12,13 ve sinyal alan hücrelerde kanonik olmayan Wnt sinyalini yönlendiren aynı kaynak ligandları, çoklu sinyal gönderen hücre tipleri tarafından üretilebilir 14,15 . Kanonik olmayan Wnt sinyalizasyonu ile ilişkili hücresel ve moleküler karmaşıklık göz önüne alındığında, in vivo olarak bireysel ve klinik olarak ilgili mekanizmaları inceleme yeteneği sınırlı kalmıştır.
In vitro hücre kültürü tekniklerini kullanarak kanonik olmayan Wnt sinyallemesini incelemek için girişimlerde bulunulmuştur. Örneğin, hücresel monokatmanlarda yapılan yara iyileştirici testler, hücreselyönlü göçü 4,16,17,18,19 olarak işlevsel olarak değerlendirmek için kullanılmıştır. İmmünoboyama teknikleri, hücresel morfoloji 7,10, mimari ve asimetrik polarizasyondaki kanonik olmayan Wnt kaynaklı değişiklikleri değerlendirmek için yüzey protein ekspresyonunun mekansal analizlerini yapmak için kullanılmıştır18,19,20. Bu yaklaşımlar, sinyal alan hücrelerde Wnt ile ilişkili fenotipleri karakterize etmek için önemli araçlar sağlamış olsa da, bu protokollerde sinyal gönderen bileşenlerin eksikliği, in vivo olarak gözlemlenen parakrin sinyal mekanizmalarını doğru bir şekilde modelleme yeteneklerini sınırlar. Sonuç olarak, kanonik olmayan Wnt yolunun sinyal gönderen ve alan hücreleri, özellikle de farklı hücre tiplerindeki hücreler arasındaki parakrin sinyal etkileşimlerinin sağlam ve tekrarlanabilir bir şekilde değerlendirilmesine izin veren in vitro sistemlerin geliştirilmesine kritik bir ihtiyaç vardır.
Bu amaçla, bu çalışmanın temel amacı, parakrin kanonik olmayan Wnt sinyal etkileşimlerini in vitro olarak modellemek için bir protokol oluşturmaktır. Bu etkileşimlerin sinyal gönderme ve sinyal alma bileşenlerini özetleyen ve kanonik olmayan Wnt yolundaki spesifik ligand-reseptör mekanizmalarını bağımsız olarak incelemek için standart moleküler, genetik veya farmakolojik yaklaşımların kullanılmasına izin veren temassız bir kokültür sistemi geliştirdik. NCC aracılı Wnt sinyalizasyonunun mekanizmaları, yerleşik murin hücre hatları kullanılarak miyoblastlarda incelendi. İlkenin kanıtı olarak, bu model, Wnt5a-ROR2 eksenini, NCC'ler 21 ve SHF kardiyomiyoblast progenitörleri 3,22,23 arasındaki ilgili kanonik olmayan Wnt sinyal yolu olarak ima eden farelerde yapılan önceki in vivo çalışmaların bulgularını doğrulamak için kullanılmıştır.

<table><tbody><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1200-10</td><td>ile Antifade montaj ortamı</td><td>4 ° C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-2323</td><td>4 ° C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>C2C12 murin miyoblast hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü şişeleri, 75 cm2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Hazneli Kızak Sistemi, 4 kuyulu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>154526</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta (DMEM), yüksek glikoz (4.5 g / L), L-glutamin (2 mM)</td> <td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td>4 ° C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Falcon konik santrifüj tüpleri, 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon, 0.4 ve mikro ile 24 oyuklu plaka için geçirgen destek; M şeffaf PET membran</td><td>Corning</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3381E</td><td>-20 ° C'de 50 mL alikotlarda saklanır; C</td></tr><tr><td>Jelatin çözeltisi,% 0.1</td> <td>ATCC</td><td>PCS-999-027</td><td>4 ° C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Dereceli ve steril pipet uçları, 10 & mikro; L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3810</td><td></td></tr><tr><td>Lösemi inhibitör faktörü (LIF), 106 birim / mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin 200 mM (100x)</td> <td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>MEM esansiyel olmayan amino asitler (MEM NEAA) 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Minimum esansiyel ortam (MEM)</td><td>Corning</td><td>10-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>Mitomisin C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>Yapışmaz otomatik cam lameller, 24 x 55 mm</td><td>Springside Scientific</td><td>HRTCG2455</td><td></td></tr><tr><td>O9-1 nöral krest hücre hattı</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCC049</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I, 1x</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit PBS'de çözüm,% 4</td> <td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-281692</td><td>4 & °C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin (10.000 U/mL penisilin ve 10.000 &mu; g / mL streptomisin)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>W3470H</td><td>-20 ° C'de 10 mL alikotlarda saklanır; C</td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab176753</td><td>-20 ° C'de saklanır; C, Işıktan uzak tutun</td></tr><tr><td>Fosfat tampon salin (PBS), 1x, kalsiyum ve magnezyum olmadan, pH 7.4</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>4 ° C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Rekombinant insan fibroblast büyüme faktörü-bazik (rhFGF-bazik)</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan/fare Wnt5a proteini</td><td>R& D Systems</td><td>645-WN-010</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat, 100 mM</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Izgaralı kare Petri kabı</td><td>Thomas Scientific</td><td>1219C98</td><td></td></tr><tr><td>STO murin fibroblast besleyici hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA,% 0.25</td> <td>Fisher Scientific</td><td>W3513C</td><td>4 &°C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Zeiss Apotome.2 floresan mikroskobu</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss ters çevrilmiş Axio Vert.A1 ışık mikroskobu</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen lite 2012 mikroskopi yazılımı</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>görüntüleme yazılımı</td></tr></tbody></table>

parakrin kanonik olmayan wnt sinyalizasyonunun in vitro olarak modellenmesi

Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro

Kanonik olmayan Wnt sinyalizasyonu, embriyogenez sırasında hücre içi aktin filament organizasyonunu ve progenitör hücrelerin polarize göçünü düzenler. Bu süreç, sinyal gönderen ve sinyal alan hücreler arasında karmaşık ve koordineli parakrin etkileşimler gerektirir. Bu etkileşimlerin farklı soylardan çeşitli hücre tipleri arasında meydana gelebileceği göz önüne alındığında, hücreye özgü kusurların in vivo değerlendirilmesi zor olabilir. Bu çalışmada in vitro parakrin kanonik olmayan Wnt sinyallemesini değerlendirmek için oldukça tekrarlanabilir bir yöntem tanımlanmıştır. Bu protokol, (1) ilgilenilen herhangi iki hücre tipi arasında kanonik olmayan Wnt sinyallemesinin fonksiyonel ve moleküler değerlendirmelerini yapma yeteneği ile tasarlanmıştır; (2) kanonik olmayan Wnt sinyal yolundaki sinyal gönderen ve sinyal alan moleküllerin rolünü incelemek; ve (3) standart moleküler veya farmakolojik yaklaşımlarla fenotipik kurtarma deneyleri yapmak.
Bu protokol, miyoblastlarda nöral krest hücresi (NCC) aracılı kanonik olmayan Wnt sinyallemesini değerlendirmek için kullanıldı. NCC'lerin varlığı, miyoblastlarda artan sayıda faloidin-pozitif sitoplazmik filopodi ve lamellipodi ve yara iyileştirici bir tahlilde miyoblast göçünün artmasıyla ilişkilidir. Wnt5a-ROR2 ekseni, NCC ve ikinci kalp alanı (SHF) kardiyomiyoblast progenitörleri arasında çok önemli bir kanonik olmayan Wnt sinyal yolu olarak tanımlandı. Sonuç olarak, bu parakrin kanonik olmayan Wnt sinyal mekanizmalarını in vitro olarak incelemek için oldukça uzun süreli bir protokoldür.

NCC'lerin murin miyoblastlarının göç kapasitesi üzerine etkileri Bu tahlil ilk olarak NCC'lerin miyoblastların göç kapasitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için uygulanmıştır. Şekil 1 , tahlilin şematik modelini özetlemektedir. Bu etkiyi test etmek için, çizik testleri, eklerin varlığında yetiştirilenlere kıyasla, izolasyonda (NCC ekleri olmadan) yetiştirilen miyoblastlarla gerçekleştirildi. Pozitif kontrol olarak, NCC uçları ile hazne kuyularına 500 ng/mL rekombinan...

Bu çalışma, in vitro parakrin kanonik olmayan Wnt sinyal olaylarını incelemek için oldukça tekrarlanabilir ve izlenebilir bir yöntemi özetlemektedir. Bu protokol, parakrin Wnt5a sinyallemesinin murin nöral krest hücrelerinde ve miyoblastlarda etkisini değerlendirmek için uygulandı.

Parakrin Kanonik Olmayan Wnt Sinyalizasyonunun In Vitro Olarak Modellenmesi

Noncanonical Wnt signaling regulates intracellular actin filament organization and polarized migration of progenitor cells during embryogenesis. This ...

Bu protokol, ilgilenilen herhangi bir hücre popülasyonunda parakrin kanonik olmayan Wnt sinyallemesini fonksiyonel ve moleküler olarak değerlendirmek için oldukça tekrarlanabilir bir yöntemi özetlemektedir. Fonksiyonel ve moleküler değerlendirmeler aynı hücre popülasyonunda gerçekleştirilir ve Wnt / PCP yolunun herhangi bir bileşenini incelemek için uygulanabilir. Başlamak için, daha önce peletlenmiş C2C12 hücresini 10 mililitre C2C12 ortamında yeniden askıya alın.Hücreleri 1:20 oranında seyreltmek için, 9,5 mililitre taze C2C12 ortamı içeren 15 mililitrelik bir tüpe 0,5 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin ve bir P1000 pipet kullanarak serolojik bir pipetle hafifçe karıştırın, seyreltilmiş hücre süspansiyonunun bir mililitresini yeni bir dört odacıklı kuyucuğun her bir kuyucuğuna ekleyin ve inkübatöre yerleştirin. O9-1 hücre eklerini kaplamak için, O9-1 hücre peletini 10 mililitre O9-1 büyüme ortamında yeniden askıya alın. Ve C2C12 hücre seyreltmesine benzer şekilde, O9-1 hücrelerini 1:20 oranında seyreltin.Daha sonra, bir mililitre O9-1 büyüme ortamı ile doldurulmuş yeni dört odacıklı kuyucuğun her bir kuyucuğunun içine tek bir geçirgen uç yerleştirin. Her bir kesici uca 300 mikrolitre seyreltilmiş O9-1 hücre süspansiyonu ekleyin ve kesici ucun tamamen suya batırıldığından emin olun. Sonra kuyuyu 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.O9-1 hücrelerinde siRNA nakavtı gerçekleştirmek için, siRNA ve transfeksiyon reaktifini, üreticinin tavsiyelerine göre indirgenmiş serum ortamında istenen konsantrasyonlarda seyreltin. Seyreltilmiş siRNA ve transfeksiyon reaktifini nazikçe karıştırın ve karışımı yedi dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 18 ila 24 saatlik hücre kaplamasından sonra, siRNA lipit komplekslerini O9-1 hücre eklerine ekleyin ve yaklaşık 34 ila 48 saat boyunca inkübe edin.Hücreler% 70 ila% 80 akıcılığa ulaştığında, ortamı C2C12 odasından iyice çıkarın ve hücreleri PBS ile bir kez yıkayın. PBS'yi çıkardıktan sonra, tek katmanlı hücrenin tüm uzunluğunu veya genişliğini kapsayacak şekilde steril bir P10 pipet ucunu sıkıca tek bir yönde geçirerek hücreleri çizmeye başlayın. Hücreler çizildikten sonra, hızlı bir şekilde bir mililitre PBS ekleyin.Ardından, bilgisayarı ve mikroskobu açın. Oda kızağını sahne alanına yerleştirin ve objektif kadranı 5X büyütmeye döndürün. Görüntüleme yazılımını açın.Kamera sekmesini tıklatın ve ardından AxioCam IC sekmesindeki hücreleri görselleştirmek için Canlı düğmesini tıklatın. Işığın kameraya ve bilgisayar ekranına geçmesine izin vermek için ışık filtresinin tamamen dışarı çekildiğinden emin olun, AxioCam IC sekmesindeki canlı görüntünün ortasındaki yara alanını konumlandırmak için hazne kızağını manuel olarak hareket ettirin veya döndürün. Görüntü çekmek için, görüntüyü içeren AxioCam IC sekmesinin yanında yeni bir sekme açmak üzere tuttur'u tıklatın.Bu durağan görüntüyü kaydetmek için dosyaya tıklayın, farklı kaydet'i seçin, dosyayı masaüstüne kaydetmek için soldaki çubukta masaüstünü seçin, dosya adı kutusuna dosya adını girin ve şekli czi dosya biçiminde kaydedin. Resmi tiff olarak kaydetmek için dosya'yı tıklatın, Farklı kaydet'i seçin, dosya adı kutusuna dosya adını girin. Kayıt türü düğmesini tıklayın ve açılır menüden tiff'i seçin.Aynı kuyucuktaki yaranın diğer noktalarında iki ila üç görüntü daha çekmek için oda kızağını manuel olarak yeniden konumlandırın. Görüntülemeden sonra, PBS'yi her bir oyuktan çıkarın ve bir mililitre C2C12 ortamı ekleyin. O9-1 hücrelerini içeren kesici uçları haznenin her bir kuyucuğuna manuel olarak yerleştirerek kuyu kesici uç ko-kültür sistemini monte edin.Kesici uçları yavaşça kuyunun içine doğru itin, böylece kesici ucun alt kısmı alttaki C2C12 hücrelerinin hemen üzerine oturur. Kuyu ekleme yapılarını inkübatöre geri döndürün ve hücrelerin toplam dokuz ila 12 saat boyunca göç etmesine izin verin. En uygun göç süresini belirlemek için, hücreleri yara oluşumundan sonraki altı saatte, daha sonra her iki ila üç saatte bir kontrol edin.Kontrol koşullarındaki hücreler yarayı tamamen kapladığında deneyi sonlandırın. Geçiş testinin sonlandırılmasına başlayın ve geçiş döneminin dokuz ila 12 saatinden sonra O9-1 hücre eklerini çıkararak sistem yapısökümünü iyi yerleştirin. C2C12 ortamını dikkatlice aspire edin.Oda kuyularına 0,5 mililitre PBS ekleyin ve göçü takiben hücrelerin son görüntülerini alın. Ortamla karıştırılmış tüm PBS'leri dikkatlice aspire edin ve kit talimatlarını kullanarak plastik odaları oda kuyularından çıkarın. C2C12 hücrelerini içeren temel slaytı bırakarak.İmmün boyama için, slaytı derhal oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 paraform aldehit ile inkübe edin. Daha sonra paraformaldehiti çıkarın ve slaytı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBST içeren% 0.1 Triton X-100 ile yıkayın. 15 dakika sonra, PBST'yi dökün ve slaytı PBS ile her biri 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.Ardından, aderans hücrelerinin bozulmasını önleyen çözeltilerin slayttan dökülmesini önlemek için slaytın etrafında hidrofobik bir kalem bulunan hidrofobik bir sınır oluşturun. Daha sonra, hidrofobik sınır içindeki slayta yaklaşık 0,5 mililitre% 1 BSA blokaj çözeltisi ekleyin ve slaytı nemlendirilmiş bir slayt odasında oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Kuluçkanın sonunda, bloke edici çözeltiyi çıkarın ve falloidin antikorunu hidrofobik sınır içindeki bu slayta ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.Ertesi gün, slaytı ışığa maruz kalmaktan korunan bir slayt tutucuya yerleştirin. Hücreleri oda sıcaklığında her biri 10 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. DAPI içeren montaj ortamı ekleyin, slaytları cam kapak fişleriyle monte edin ve standart bir floresan mikroskobu kullanarak hücreleri yakalayın.Bu çalışmada, ko-kültür kuyularına rekombinant Wnt5a'nın eklenmesi, bazı bölgelerin dokuz saat tamamen iyileşmesiyle miyoblast göçünü hızlandırmıştır. Her üç koşuldaki göçmen miyoblastlar, iyi biçimlendirilmiş ve çıkıntılı filopodia ve lamellipodia ve aktin sitoiskelet projeksiyonlarının asimetrik polarizasyonu dahil olmak üzere normal göçmen hücresel morfolojiyi sergiledi. NCC kaynaklı Wnt5a'nın miyoblast göçü üzerindeki parakrin etkisi incelenmiştir.Wnt5a'ya karşı 50 nanomolar siRNA ile tedavi, Wnt5a gen ekspresyonunu negatif kontrole kıyasla% 64 oranında azaltmıştır. NCC'lerde Wnt5a nakavtını takiben C2C12 mil patlamalarının göçü ve eksojen rekombinant Wnt5a'nın eklenmesi, bu miyoblastlardaki bu göç açığını ve morfolojik kusuru kurtardı. Parakrin modelindeki sinyal alan hücre mekanizmalarını daha iyi anlamak için, ROR2 reseptörü devrildi ve gen ekspresyonu% 54 oranında azaltıldı Miyoblastlarda ROR2'nin yıkılması, NCC'lerin varlığına rağmen göç kapasitelerini azaltır.Eksojen rekombinant Wnt5a, ROR2 yıkımının miyoblastların Wnt5a sinyallerini alma yeteneğini bozduğunu düşündüren ROR2 nakavtından sonra miyoblast göçünü kurtaramadı. Kültür hücreleri yeterli yoğunluğa sahip P10 ucu ile çizilir ancak bir kez monte edilir ve altta yatan hücreyi bozmadan ko-kültür sistemi ile özenle monte edilir. Bu teknik, karmaşık Wnt / PCP yolu içindeki spesifik bir moleküler sinyal eksenini nöral krest hücresi ve ikinci kalp alanı biyolojisi ile ilgili olarak incelemek için bir kavram kanıtı olarak kullanılmıştır.

modeling-paracrine-noncanonical-wnt-signaling-in-vitro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu videoda, murin miyoblastlarının göç kapasitesini değerlendirmek için temassız bir ko-kültür yara iyileşme testi açıklanmaktadır. Bu, in vitro olarak parakrin kanonik olmayan Wnt sinyal etkileşimlerinin sinyal gönderen ve sinyal alan bileşenlerinin anlaşılmasına yardımcı olur.

Murin Miyoblastlarının Ko-Kültürdeki Göç Kapasitesini Değerlendirmek için Yara Testi

Yumuşak agar koloni oluşum testi, in vitro hücresel ankrajdan bağımsız büyümeyi doğrulamak için kullanılan bir yöntemdir. Bu protokolün amacı, transforme olmuş hücrelerin tümörjenik potansiyelinin ve proteinlerin transforme olmuş hücreler üzerindeki tümör baskılayıcı etkilerinin tespiti için sıkı bir yöntem göstermektir.

Yumuşak Agar koloni formasyon deneyi

Bu video makale, pankreatik duktal adenokarsinomda dorsal kök gangliyonları (DRG)/kanser hücresi modelinin kullanımını göstermektedir.

Sırt kök ganglion Modeli: Kanserli Sinir Invasion Vitro Modelleme

Bütün montaj bağlanmış raportör fareler ve bölüm boyama, mikroskopi ve in vivo deneylerde kullanımı solunum yolu normal model oluşturmanın altında yatan mekanizmaların analizi kolaylaştırır. İşte bu teknikler trakeal gelişimi sırasında Wnt sinyal analizine katkıda açıklar.

İletken Airways Desenlendirme sırasında Wnt Sinyalizasyonu incelenmesi

Epitelden mezenkimal geçişe (EMT) kanserlerin invaziv hale gelmesine izin verir. EMT'yi araştırmak için, serum ve enzimlerden yoksun bir nöral kök hücre (NSC) tabanlı in vitro model tanımlanmıştır. Bu standartlaştırılmış sistem, hücre göçünün, gen ve protein ekspresyonunun kantitatif ve kalitatif değerlendirmesine izin verir. Model, ilaç keşfi için uygundur.

Ilaç keşfi için uygundur EMT araştırma için enzim ve serum içermeyen nöral kök hücre kültürü modeli

Bu video makalede sistematik ve verimli birçok omurgasız embriyolar karmaşık sinyal yolları ve düzenleyici ağları bileşenleri karakterize etmek için kullanılabilir in vivo metodolojisi basit ayrıntıları.

Sadelik Gücü: olarak deniz kestanesi Embriyolar<em&gt; Vivo</em&gt; Karmaşık Hücre-hücre Sinyal Ağ Etkileşimleri incelenmesi için Gelişim Modelleri

Bu tahlil, filizlenen anjiyogenezi in vitro olarak kontrol eden biyolojik süreçleri analiz etmek için 3D-kollajen jel içinde kültürlenmiş embriyoid cisimlere farklılaştırılmış fare embriyonik kök hücrelerini kullanır. Bu teknik, ilaçları test etmek, hastalıkları modellemek ve embriyonik olarak ölümcül olan delesyonlar bağlamında spesifik genleri incelemek için uygulanabilir.

In Vitro Vasküler Hastalık Modellemesi ve İlaç Testi için Fare Embriyonik Kök Hücreleri Kullanılarak Anjiyogenezin Üç Boyutlu Filizlenme Testi

Bu makale, T hücresi soylarının nesil, fenotip ve sayı kinetiğinin analizi ile timik çökelme öncüllerini karakterize etmek için in vivo ve in vitro metodolojiyi açıklamaktadır.

Timus Karakterizasyonu kullanma Fare Embriyo atalarıdır Settling<em&gt; In Vivo</em&gt; Ve<em&gt; In Vitro</em&gt; Tahliller

El yazması burada Xenopus floresan levhası 'ligandların salgılanmasını ve difüzyon analiz yöntemleri basit bir kümesi sağlar. Bu ligand dağılımını değiştirmek için başka proteinlerin yeteneğini test ve morfojen degradeler düzenleyen mekanizmalar içgörü verebilir deneyleri izin verdiği için bir ortam sağlar.

Konfokal Analizi Kullanımı<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wnt ve Shh morfogen Gradyanların modülyatorlar Soruşturma

Notch sinyali, hücreler arasında doğrudan temasa dayanan bir hücresel iletişim şeklidir. Notch sinyalini in vitro olarak düzgün bir şekilde indüklemek için, Notch ligandları hücrelere hareketsiz bir durumda sunulmalıdır. Bu protokol, fare osteoklast öncülerinde Notch sinyalinin in vitro stimülasyonu için yöntemleri açıklar.

Fare Osteoklast Öncüleri Notch Sinyal uyarılması

Öğrenin parakrin kanonik olmayan Wnt sinyalizasyonunu in vitro modellemeyi C2C12 ve O9-1 hücreleri kullanarak. Bu yöntem Wnt/PCP yolak bileşenlerinin fonksiyonel ve moleküler değerlendirmesini sağlar.

Parakrin Kanonik Olmayan Wnt Sinyalizasyonunun In Vitro Olarak Modellenmesi

Daha fazla video keşfet