Arkeolojik Kalıntılar'dan Antik DNA'nın Alınması için Optimize Edilmiş Kemik Örnekleme Protokolleri

Bu protokoller, bir dizi iskelet elemanında aşağı akış DNA ekstraksiyonunda kullanılmak üzere kemik tozu üretimi için en iyi uygulama kılavuzları olarak hizmet eder. Dentin ve petroz piramidi dışındaki yerler için yayınlanmış birkaç antik DNA örnekleme protokolü vardır. Bugün, üç alternatif için ayrıntılı örnekleme yöntemlerini göstereceğiz.

Bu yöntemler aynı zamanda bozulmuş adli kalıntılarla kullanım için büyük bir potansiyel göstermektedir, ancak aynı zamanda insan dışı örneklerle benzer teknikler geliştirmek için bir temel oluşturmaktadır. Tüm numune alımlarını özel bir temiz odada, UV ışığı donanımlı bir PCR başlığı veya biyogüvenlik kabini altında gerçekleştirin. Hava akışını kapatın ve başıboş kemik tozu veya parçalarını yakalamak için steril alüminyum folyoyu tezgah üstü boyunca yayın.

Steril bir tartım tepsisine bir tartım kağıdı yerleştirin. Dekontamine olmuş azı dişini, elde taşınan bir kelepçe kullanarak, kök bir tartım tepsisinin üzerine bakacak şekilde emaye ile tutun. Bir diş matkabını elmas kenarlı dairesel bir kesme tekerleği ile donatın.

Matkap orta hız ayarına ayarlandığında, matkabın kenarından köke yaklaşık 20 derecelik bir açıyla hafifçe dokunun. Sarı, en dıştaki malzemeyi kökten toplamak için numuneyi tepsiye aşağı doğru kazıyın. Dentinin daha hafif materyali görünür hale geldiğinde toplamayı durdurun.

Tozu iki mililitrelik bir LoBind Safe-Lock tüpüne aktarın ve toplanan bu toz kütlesini en az 0,01 miligram hassasiyetle kapalı bir terazi kullanarak kaydedin. Tozu tartım kağıdından ekstraksiyon için iki mililitrelik LoBind Safe-Lock tüpüne aktarın. Bu tüpü 20 santigrat derecede saklayın.

Tüm kemik parçalarını ve mümkün olduğunca fazla tozu geri kazandığınızdan emin olun. Her örnekleme arasındaki folyoyu değiştirin, kullanılmış folyoyu otoklavlanabilir bir biyolojik tehlike torbasına atın. Çalışma alanını dekontamine edin ve bir sonraki kemiğe geçmeden önce her seferinde steril alüminyum folyoyu tezgah üstü boyunca yayın.

Standart tartım tepsisine küçük bir tartım kağıdı yerleştirin. Bir diş matkabı kullanarak üstün vertebral kemerin kortikal kemiğinin en dış tabakasını çıkarın ve atın. Daha sonra, omurları bir el kelepçesine sabitleyin, dikenli süreç dışa doğru ve üstün yönü aşağıda.

Omurları tutarken, dikenli işlemin düşük hız ve yüksek torklu lameller ile füzyonu ile oluşan V şeklindeki çentiğin merkezine doğru yukarı doğru delin. Dirençte gözle görülür bir düşüş olduğunda sondajı durdurun. Delme pozisyonunu hafifçe değiştirin ve 50 ila 100 miligram kemik tozu toplanana kadar tekrarlayın.

Kemik tozunu tartım kağıdından ekstraksiyon için iki mililitrelik bir LoBind tüpüne aktarın ve 20 santigrat derecede saklayın. Bir folyo atmadan önce tüm kemik parçalarının ve mümkün olduğunca fazla tozun geri kazanıldığından emin olun. Çalışma alanını dekontamine edin ve daha önce açıklandığı gibi numune toplamaya hazırlanın.

Standart bir tartım tepsisine küçük bir tartım kağıdı yerleştirin. Talus kubbesini yukarı doğru ve medial yüzeyi toplayıcıya doğru, tartım tepsisinin üzerinde tutun. Düşük hız ve yüksek torka ayarlanmış düşük ölçülü bir uca sahip bir diş matkabı kullanarak kortikal kemiği talusun boynundan yaklaşık bir milimetre derinliğe kazıyın.

Delme pozisyonunu değiştirin ve yaklaşık 50 ila 100 miligram kemik tozu toplanana kadar bunu tekrarlayın. Bu kemik tozunu tartım kağıdından ekstraksiyon için iki mililitrelik bir LoBind tüpüne aktarın. Tozu süresiz olarak 20 santigrat derecede saklayın.

Kalan kemiği ve fazla tozu kuru, sıcaklık kontrollü steril bir ortamda 25 santigrat derecede saklayın. Tüm atıkları otoklav biyolojik tehlike torbalarına veya kaplarına atın. Yeniden kullanılabilir tüm ekipmanı sterilize edin veya dekontamine edin ve her örnekleme arasında UV'ye maruz bırakın.

Pars petrosa, incelenen diğer 23 anatomik örnekleme yerinden daha yüksek endojen DNA verdi. Bu protokolde sunulan yedi ek anatomik örnekleme yeri, bir sonraki en yüksek verimi üretti. Sürekli olarak üretilen alternatif bölgeler, standart popülasyon genetiği analizleri için yeterli DNA verimi sağlar.

Tüm anatomik örnekleme yerlerinden kaynaklanan kütüphanelerdeki çoğaltma oranları düşüktü, bu da yüksek karmaşıklığı gösteriyordu. Dişler ve torasik omurlar yeterli moleküler iyileşme gösterdi. Kemik örneklemesinin en zorlu yönlerinden biri, bir matkabın nasıl tutulacağı, nerede delineceği ve delmenin ne zaman durdurulacağı gibi delme işlemidir.