Zebra Balığı Larvalarında Kimyasal Olarak İndüklenen Kemik Kaybını Tespit Etmek için Alizarin Kırmızı Boyama Kullanımı
28 Aralık 2021
Burada, kurşun asetat maruziyetinin zebra balığı larvalarında kemik kütlesi değişikliğine neden olduğunu göstermek için alizarin kırmızısı boyamayı kullandık. Bu boyama yöntemi, diğer tehlikeli toksik maddelerin neden olduğu zebra balığı larva kaybındaki kemik kaybının araştırılmasına uyarlanabilir.
Bu yöntem, zebra balığındaki kimyasalların neden olduğu kemik toksisitesini tespit etmeye yardımcı olabilir. Alizarin Kırmızı Sabit dokunun boyanması, birkaç örneğin karşılaştırılmasını kolaylaştırabilecek iskelet değişikliklerinin kalıcı bir kaydını oluşturur. Bu teknik, zebra balığı modelinde osteoporozu incelemek için yararlı olabilir, çünkü osteoporozun özelliklerinden biri kemik kütlesindeki azalmadır.
Döllenmeden sonraki dokuz günde her gruptan rastgele 10 zebra balığı larvasını çıkarın ve balıkları iki saat boyunca bir mililitre% 2 paraform aldehit ve 1X PBS'de sabitleyin. Çözeltiyi boşaltın ve zebra balığı larvalarını 100 milimolar Tris HCL kullanarak pH 7.5 veya 10 milimolar Magnezyum Klorür ile yıkayın. Boyama yapmak için, çözeltiyi boşaltın ve larvayı makalede açıklandığı gibi bir dizi çözelti içinde beş dakika boyunca inkübe edin.
Son inkübasyondan sonra, çözeltiyi boşaltın ve% 3 hidrojen peroksit ve% 0.5 potasyum hidroksitten oluşan bir çözelti ile ağartarak pigmenti çıkarın. Pigment tamamen çıkarılana kadar her 10 dakikada bir gözlemleyin. Zebra balığı larvalarını% 25 gliserin,% 0.1 potasyum hidroksit ile kabarcık kalmayana kadar her biri 10 dakika boyunca birkaç kez durulayın.
% 0.01'lik bir mililitreye batırılarak larvada leke Alizarin. Çözeltiyi boşaltın ve arka planı temizlemek için bir mililitre% 50 gliserin veya% 0.1 potasyum hidroksit ekleyin. Daha sonraki gözlemler için balıkları taze% 50 gliserin veya% 0.1 potasyum hidroksit içinde saklayın.
Larvaları sıvı damlasının ortasında tutarak cam slayta bir seferde bir larva aktarın. Larvaları stereo mikroskop altında gözlemleyin. Fotoğraf makinesini açın.
Yazılımı açın ve varsayılan ayarları koruyun. AE'ye tıklayın ve en iyi görüntüyü elde etmek için uygun bir pozlama süresi seçin. Tüm görüntüleri aynı ayarlar altında yakalayın.
Daha sonra analiz etmek üzere görüntüleri nokta tiff biçiminde kaydedin. imageJ simgesine çift tıklayın. Kaydedilen görüntüleri analiz etmek için dosyaya tıklayın, ardından açın, ardından resme tıklayın, ardından sekiz bit yazın ve seçin.
Düzenle'ye tıklayın ve ters çevirin. Analiz et'e tıklayın, ardından kalibre edin. Açılır arayüzde Kalibre edilmemiş OD'yi seçin.
Alt arayüzün sol alt köşesindeki global kalibrasyonu kontrol edin ve Tamam'ı tıklatın. Analiz et'e tıklayın, ölçeği ayarlayın, ardından ölçeği kaldırın. Aşağıdaki global kontrol edin ve Tamam'ı tıklayın.
Analize tıklayın, ardından ölçümleri ayarlayın. Açılır arabirimde öğe alanını seçin. Yalnızca seçilen aralığı ölçmek için aşağıdaki eşik sınırını kontrol edin ve Tamam'ı tıklayın.
Resme tıklayın, ayarlayın, ardından eşik ve açılır arayüzün ortasındaki kaydırıcıyı kaydırın. Bir görüntüde test edilecek tüm hedeflerin seçilmesi için uygun eşiği seçmek için. Ve ayarla'yı tıklayın.
Analiz et'e tıklayın, ardından tarihleri ölçün, kaydedin. Alizarin Kırmızı Boyama, zebra balığı larvalarında kemik mineralizasyonundaki değişiklikleri ölçmek için hassas ve spesifik bir yöntemdir. Döllenmeden dokuz gün sonra, parasfenoid, operküler, seratobranchial ve notokord gibi kafa iskeletinin birçok kemiği mineralize edilir ve bu nedenle kırmızıya boyanır.
Buna karşılık, otolitler gibi kemikli olmayan yapılar kahverengi siyah görünür. Toplam lekeli alanı ölçmek için yapılan dijital analiz, kurşun asetat tedavi gruplarının litre başına 10 ve 20 miligramı için lekeli alanda önemli bir azalma olduğunu göstermiştir. Kemik mineralizasyonundaki değişiklikler doz bağımlılığı gösterdi.
Daha iyi boyama etkisi ve gözlem için, zebra balığı larvalarının orijinal pigmentini çıkarmak ve ağartmadan sonra kabarcıkları çıkarmak önemlidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, kurşun asetat maruziyetinin zebrafish larvalarında kemik kütlesinde değişikliklere yol açtığını göstermek için alizarin red boyamasını kullanmaktadır. Bu yöntem, çeşitli tehlikeli toksinlerin neden olduğu kemik kaybının araştırılması için uyarlanabilir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Toksikoloji
- Gelişimsel Biyoloji
Arka Plan
- Alizarin red boyama, iskelet yapılarının görselleştirilmesi için kullanılan bir tekniktir.
- Zebrafish, kemik gelişimi ve toksisite çalışmalarında model organizma olarak kullanılır.
- Kurşun asetatın biyolojik sistemler üzerinde toksik etkileri olduğu bilinmektedir.
- Osteoporoz, zebrafish üzerinde modellenebilen kemik kütlesindeki azalma ile karakterizedir.
Çalışmanın Amacı
- Kurşun asetatın zebrafish larvalarının kemik kütlesi üzerindeki etkisini değerlendirmek.
- Kimyasalların neden olduğu kemik toksisitesini tespit etmek için bir yöntem geliştirmek.
- Örnekler arasındaki iskeletsel değişikliklerin karşılaştırılmasını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Fiksasyon uygulanmış zebra balığı dokusunun Alizarin red ile boyanması.
- Zebra balığı larvalarının paraformaldehit ve PBS ile fiksasyonu.
- Larvaların Tris HCL veya Magnezyum Klorür ile yıkanması.
- Makalede belirtildiği şekilde renk giderme işlemleri.
Ana Sonuçlar
- Kurşun asetat maruziyeti, kemik kütlesinde gözlemlenebilir değişikliklere yol açtı.
- Boyama yöntemi, iskeletsel değişikliklerin kalıcı bir kaydını sağladı.
- Sonuçlar, osteoporoz çalışmalarında zebrafish'in model olarak kullanımını desteklemektedir.
- Metodoloji, diğer tehlikeli toksik maddelerin araştırılmasına olanak tanır.
Sonuçlar
- Alizarin red boyaması, zebrafishlerde kemik toksisitesini değerlendirmek için etkilidir.
- Çalışma, toksikolojik araştırmalarda zebrafishlerin potansiyelini vurgulamaktadır.
- İleri araştırmalar, çeşitli toksik maddelerin kemik sağlığı üzerindeki etkilerini detaylandırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Bu yöntem, zebrafish larvalarında kimyasal olarak indüklenen kemik kaybının erken teşhisine olanak tanıyarak toksikolojide mekanistik risk azaltmaya ve iskelet sağlığı yolakları için hedef doğrulamaya destek sağlar. Alizarin red boyama yoluyla mineralize doku değişikliklerini nicelleştirerek, bileşiklerin kemik mineralizasyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek içinle tekrarlanabilir, doz bağımlı bir veri sunar. Bu yaklaşım, kemik aktif bileşiklerin ön klinik güvenlik taramalarında ve öncü bileşik optimizasyonunda öngörücü güvenilirliği destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Kemik mineralizasyonu ve iskelet bütünlüğü ile ilgili terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Örnekler genelindeki iskeletsel değişikliklerin kalıcı ve ölçülebilir bir kaydını sunarak biyolojik risk azaltma sürecini destekler.
- Öngörücü Değer: Keşif sürecinin erken aşamalarında kemik kütlesi üzerinde doz bağımlı etkileri olan bileşikleri tanımlayarak portföy önceliklendirmesini kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Tedavi grupları arasında objektif karşılaştırma yapabilmek için boyalı alanın kantitatif, eşik tabanlı ölçümlerini sağlar.
- Operasyonel Değer: Çok kuyucuklu formatlarda tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği sağlamak için örnek hazırlama ve görüntüleme protokollerini standartlaştırır.
- Analiz Hazırlığı: ImageJ analiziyle uyumlu dijital çıktılar üreterek kemik toksisitesi fenotiplerinin yüksek içerikli taramasını mümkün kılar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Toksik maddelere karşı insanla ilgili iskelet yanıtlarını modeller ve kemik kaybı için translasyonel biyobelirteç uyumunu destekler.
- Operasyonel Değer: Kemik mineralizasyonu için korunmuş, omurgalı bazlı bir analiz yöntemi sunarak keşif ve preklinik iş akışları arasında köprü kurar.
- Risk Azaltma: Memeli çalışmalarından önce kemik kaybı sinyallerini tespit ederek riskle uyumlu ilerleme kararlarına bilgi sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, özellikle iskelet sistemleri üzerinde potansiyel hedef dışı etkilere sahip bileşikler için, hedef doğrulamadan lider bileşik tanımlamaya ve preklinik güvenlik değerlendirmesine kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Bir omurgalı modelinde, kimyasalların kemik gelişimi ve mineralizasyon yolları üzerindeki etkilerinin hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Boyalı alandaki doza bağlı değişikliklerin tespit edilmesi için analiz standardizasyonu ve kantitatif okumalar sağlar.
- Analitik: Farklı koşullar arasında kemik mineralizasyonunun istatistiksel karşılaştırmasına olanak tanıyan, kalibre edilmiş ve eşik değer tabanlı alan ölçümleri sunar.
- Translasyonel Araştırma: Zebrafish larvalarında toksik maddelere karşı korunmuş iskelet yanıtlarını modelleyerek preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli kimyasal kütüphanelerin kemik toksisitesi potansiyeli açısından taranması için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kemikle ilgili yolaklardaki mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış fiksasyon, boyama ve dijital kantitasyon adımları aracılığıyla tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Kemik kaybı sorumluluğuna dair erken ve kantitatif sinyaller sunarak go/no-go kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Önemli yatırımlar öncesinde iskelet toksisitesi risklerini belirleyerek riske göre ayarlanmış önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Zebrafish kullanımı, histoloji ve floresan/kolorimetrik görüntüleme konularında uzmanlık gerektirir.
- Standardize edilmiş nicelleştirme için stereo mikroskopiye ve görüntü analiz yazılımlarına (örneğin, ImageJ) bağımlıdır.
- Tekrarlanabilir sonuçlar için boyama protokollerinin ve eşik ayarlarının ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Kurşun asetat dışındaki diğer model sistemlere veya kimyasal sınıflara genişletilirken adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Doğru sinyal deteksiyonunu sağlamak için pigment giderme ve arka plan temizleme adımlarının gerekliliği ile sınırlıdır.
