Name: Zebra Balığı Larvalarında Kimyasal Olarak İndüklenen Kemik Kaybını Tespit Etmek için Alizarin Kırmızı Boyama Kullanımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Keşfedin kimyasal kaynaklı kemik toksisitesini Danio rerio larvalarında alizarin kırmızı boyama ile tespit etme yöntemini. Bu teknik, osteoporoz ve çevresel toksinlerin iskelet sağlığına etkilerini araştırmak için kalıcı kayıtlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81872646; 81811540034; 81573173) ve Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının Öncelikli Akademik Program Geliştirme (PAPD) tarafından desteklenmiştir.

Burada özetlenen tüm hayvan prosedürleri, Soochow Üniversitesi Etik Komitesi Hayvan Bakım Enstitüsü tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Balık yetiştiriciliği ve embriyo toplama 14
<ol><li>Balıkları her gün üç kez besleyin; Zebra balıklarının 14:10 saat açık/karanlık döngüsüyle 28,5 ± 0,5 °C'de muhafaza edilmesini sağlayın.</li>
	<li>Erkek ve dişi yetişkin balıkları, akşamları 2: 1 erkek-dişi oranında yumurtlama tanklarındaki izolasyon tahtalarıyla ayırın.</li>
	<li>Ertesi sabah, izolasyon tahtalarını saat 09: 00'da çıkarın ve embriyoları 2 saat sonra toplayın.</li>
	<li>Embriyoları deneyden önce 28.5 ° C'de tutulan bir biyokimyasal inkübatöre yerleştirin.</li>
</ol>2. Kimyasal maruziyet
<ol><li>Ana stoğu hazırlayın: kurşun asetat trihidratı (5 g) tartın ve karıştırarak ultra saf suda (50 mL) çözün. DİKKAT: PbAc toksiktir. Uygun toz maskeleri, koruyucu giysiler ve eldivenler giyin. Deneyi bir duman başlığı altında gerçekleştirin.</li>
	<li>Zebra balığı embriyolarını seçin ve rastgele 6 delikli plakalara dağıtın (3 mL zebra balığı yetiştirme suyunda kuyu başına 30 embriyo; bileşimi için Tablo 1'e bakınız). Embriyoları döllenme sonrası 2 ila 120 saat arasında PbAc (0, 5, 10, 20 mg / L) ile tedavi edin (hpf). NOT: PbAc konsantrasyonları, doz aralığı bulma deneylerine göre seçilmiştir. Sonuçlar, zebra balığı embriyolarındaki LC50 kurşun asetatın 120 hpf'de 41.044 mg / L olduğunu gösterdi. Bu nedenle, en yüksek konsantrasyon LC50'nin yarısına ve 2 kat seyreltme ile hazırlanan bir dizi çözeltiye ayarlandı.</li>
	<li>Larvaları döllenmeden 5 gün sonra günde iki kez besleyin (dpf). Zebra balığı embriyolarını 14:10 saat açık / karanlık döngüsü ile 28,5 ± 0,5 ° C'de tutun.</li>
	<li>Pb'siz ortamı (zebra balığı yetiştirme suyu) her 24 saatte bir 9 dpf'ye kadar yenileyin. NOT: Deneylerin tamamlanmasının ardından, kurşun içeren tüm çözeltiler belirlenmiş bir sıvı tankına döküldü ve deney yönetim merkezi tarafından muamele edildi.</li>
</ol>3. Alizarin kırmızısı boyama
NOT: Tüm boyama işlemi boyunca uygun toz maskeleri, koruyucu giysiler ve eldivenler giyin. Tüm çözeltilerin bileşimleri Tablo 1'de gösterilmiştir.
<ol><li>Özel boyama adımları NOT: Boyama işlemi, oda sıcaklığında 24 delikli bir plakada gerçekleştirilmiştir. Her çözelti eklendikten sonra, 24 delikli plakayı düşük hızda ayarlanmış sallama masasına yerleştirin.<ol><li>9 dpf'de her gruptan rastgele 10 zebra balığı larvasını çıkarın ve balıkları 2 saat boyunca 1 mL% 2 paraformaldehit / 1x fosfat tamponlu salin içinde sabitleyin.</li>
		<li>Çözeltiyi boşaltın ve zebra balığı larvalarını 10 dakika boyunca 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) / 10 mM MgCl2 ile yıkayın.</li>
		<li>Çözeltiyi boşaltın ve larvaları aşağıdaki çözeltilerde her biri 5 dakika boyunca destaining için inkübe edin: susuz etanol (EtOH) çözeltisi (% 80 EtOH / 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) / 10 mM MgCl2,% 50 EtOH / 100 mM Tris-HCl (pH = 7.5) ve% 25 EtOH / 100mM Tris-HCl (pH = 7.5).</li>
		<li>Çözeltiyi boşaltın,% 3H2O 2 ve% 0.5 KOH'dan oluşan bir çözelti ile ağartarak pigmenti çıkarın ve pigment tamamen çıkarılana kadar her 10 dakikada bir gözlemleyin.</li>
		<li>Zebra balığı larvalarını, kabarcık kalmayana kadar her biri 10 dakika boyunca% 25 gliserin ve% 0.1 KOH ile birkaç kez durulayın. NOT: Kabarcıklardan kaçınmak önemlidir; Aksi takdirde, zebra balığı gövdesindeki kabarcıklar mikroskop altında siyah bir görüş alanı olarak görünecek ve bu da gözlemleri ve nicel analizleri etkileyecektir.</li>
		<li>Larvaları 50 dakika boyunca% 0.01 alizarinin 1 mL'sine batırarak lekeleyin.</li>
		<li>Çözeltiyi boşaltın ve arka planı temizlemek için 10 dakika boyunca 1mL% 50 gliserin / % 0.1 KOH ekleyin. Daha sonraki gözlemler için balıkları taze% 50 gliserin / % 0.1 KOH içinde saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Görüntü toplama
<ol><li>Her seferinde bir larvayı cam slayta aktarın ve larvaları sıvı damlasının ortasında tutun.</li>
	<li>Larvaları stereo mikroskop altında gözlemleyin.</li>
	<li>Fotoğraf makinesini açın, yazılımı açın ( Malzeme Tablosu'na bakın) ve varsayılan ayarları koruyun.</li>
	<li>AE'ye tıklayın ve en iyi görüntüyü elde etmek için uygun bir pozlama süresi (bu deneyde 60 ms) seçin.</li>
	<li>Tüm görüntüleri aynı ayarlar altında yakalayın. Daha sonra analiz etmek üzere görüntüleri .tif biçiminde kaydedin.</li>
</ol>5. Görüntü analizi
NOT: Görüntü analizi için bir dizi örnek grafik içeren bir örnek için Ek dosyaya bakın.
<ol><li>ImageJ simgesine çift tıklayın ve adım 4.5'te kaydedilen görüntüleri analiz edin.<ol><li>Dosya'ya tıklayın | Adım 4.5'te kaydedilen görüntüleri açmak için açın.</li>
		<li>Resme Tıklayın | Yazın, 8 bit'i seçin.</li>
		<li>Düzenle'ye tıklayın | Ters çevir.</li>
		<li>Analiz Et'e tıklayın | Kalibre et, açılır arayüzde Kalibre edilmemiş OD'yi seçin, alt arayüzün sol alt köşesindeki Global kalibrasyon'u kontrol edin ve Tamam'ı tıklatın.</li>
		<li>Analiz Et'e tıklayın | Ölçeği Ayarla | Açılır arayüzde ölçeği kaldırmak için tıklayın, aşağıdaki Global'i kontrol edin ve Tamam'ı tıklayın.</li>
		<li>Analiz Et'e tıklayın | Ölçümler'i ayarlayın, açılır arayüzde öğe alanını seçin, aşağıdaki Eşik sınırını kontrol edin (yalnızca seçilen aralığı ölçmek için) ve Tamam'ı tıklayın.</li>
		<li>Resme Tıklayın | Ayarla| Eşik, bir görüntüde test edilecek tüm hedeflerin seçilmesi için uygun eşiği seçmek üzere açılır arabirimin ortasındaki kaydırıcıyı kaydırın (her görüntünün eşiğini değiştirin) ve Ayarla'yı tıklatın.</li>
		<li>Analiz Et'e tıklayın | Ölçün. Her grubun tarihlerini kaydedin.</li>
	</ol></li>
	<li>Farklılıkları analiz etmek için tek yönlü ANOVA'yı ve ardından Tukey'in çoklu karşılaştırma testini kullanın ve anlamlılık seviyesini p < 0.001 (***) olarak ayarlayın.</li>
</ol>

<ol><li>Compston, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+registration+of+agents+for+prevention+and+treatment+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis%3A+an+update+from+the+Group+for+the+Respect+of+Ethics+and+Excellence+in+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporosis+International%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science.</a> Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).</li>
<li>Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+preventing+bone+loss+induced+by+aromatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors.</a> Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).</li>
<li>Kataba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+exposure+to+environmentally+relevant+lead+levels+induces+oxidative+stress+and+neurobehavioral+alterations+in+larval+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio).</a> Aquatic Toxicology. 227, 105607(2020).</li>
<li>Morin, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+fracture+prevalence+and+in+bone+mineral+density+between+Chinese+and+White+Canadians%3A+the+Canadian+Multicentre+Osteoporosis+Study+%28CaMos%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Osteoporosis%22%5BJournal%5D)">Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos).</a> Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147(2020).</li>
<li>Lee, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+lead+poisoning+magnifies+bone+detrimental+effects+in+an+ovariectomized+rat+model+of+postmenopausal+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis.</a> Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).</li>
<li>Theppeang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+bone+mineral+density+and+lead+levels+in+blood%2C+tibia%2C+and+patella+in+urban-dwelling+women%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women.</a> Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoporosis+in+a+Chinese+population+due+to+occupational+exposure+to+lead%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Industrial+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead.</a> American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).</li>
<li>Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+and+bone+mass+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Exercise and bone mass in adults.</a> Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).</li>
<li>Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+structure+and+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Collagen structure and functional implications.</a> Micron. 32 (3), 251-260 (2001).</li>
<li>Kelly, W. L., Bryden, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+differential+stain+for+cartilage+and+bone+in+whole+mount+preparations+of+mammalian+fetuses+and+small+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates.</a> Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).</li>
<li>Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+high+content%2C+in+vivo+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+as+a+model+to+assess+chemical+toxicity+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Fish as a model to assess chemical toxicity in bone.</a> Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+GH%2FIGF+axis+in+arsenite-induced+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos.</a> Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820(2020).</li>
<li>Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+emerging+model+for+osteoporosis%3A+a+primary+testing+platform+for+screening+new+osteo-active+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds.</a> Frontiers in Endocrinology. 10, 6(2019).</li>
<li>Charles, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+quantitative+micro-computed+tomographic+analysis+in+zebrafish+to+define+gene+function+during+skeletogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis.</a> Bone. 101, 162-171 (2017).</li>
<li>Hammond, C. L., Moro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+transgenic+reporters+to+visualize+bone+and+cartilage+signaling+during+development+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo.</a> Frontiers in Endocrinology. 3, 91(2012).</li>
<li>Bensimon-Brito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+in+vivo+staining+with+alizarin+red+S--a+valuable+approach+to+analyse+zebrafish+skeletal+mineralization+during+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Revisiting in vivo staining with alizarin red S--a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration.</a> BMC Developmental Biology. 16, 2(2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Zebra balığı, kemik metabolik hastalığını incelemek için uygun bir modeldir. Kemirgen modelleriyle karşılaştırıldığında, zebra balığı modellerinin kurulması nispeten hızlıdır ve hastalığın ciddiyetinin ölçülmesi daha kolaydır. Vahşi tip zebra balığı larvalarında, kafa iskeletinin mineralizasyonu 5 dpf'de ve eksenel iskelet 7 dpf15'te gerçekleşir. Böylece, PS, OP, CB ve NC gibi kraniyal kemikler 9 dpf'de iyi gelişmiştir. Larvalar tamamen lekelendikten ve ağartıldıktan sonra, yumuşak dokular temizle...

Son zamanlarda yapılan çalışmalar, glukokortikoidlere, aromataz inhibitörlerine ve aşırı alkol tüketimine bağlı osteoporozun yaygın olduğunu doğrulamıştır 1,2. Kurşun (Pb) bitkilerde, toprakta ve su ortamlarında bulunan toksik bir metaldir3. Pb'nin insan vücudu üzerindeki olumsuz etkileri çok dikkat çekmiş olsa da, kemik üzerindeki geri dönüşü olmayan etkisinin daha fazla araştırılması gerekmektedir. Kurşun zehirlenmesi, hem gelişmekte olan hem de yetişkin iskeletinde normal yaşam aktivitelerini etkileyen çeşitli patolojik değişikliklere neden olur. Çalışmalar, kronik Pb maruziyeti ile kemik hasarı4 arasında, bozulmuş kemik yapıları5,6, azalmış kemik mineral yoğunluğu ve hatta artmış osteoporoz riski dahil olmak üzere bir ilişki bulmuştur7.
Mineralize doku kemik gücü8 için büyük önem taşır ve kemik mineralizasyon matriks birikimi kemik oluşumunun kritik bir indeksidir9. Alizarin kırmızısı, kalsiyum iyonları için yüksek bir afiniteye sahiptir ve alizarin kırmızısı boyama, kemik oluşumunu değerlendirmek için standart bir prosedürdür10. Bu yönteme göre, mineralize doku kırmızıya boyanırken, diğer tüm dokular şeffaf kalır. Lekeli alan daha sonra dijital görüntü analizi11 ile ölçülür.
Zebra balığı, ilaç keşfi ve hastalık modellerinde yaygın olarak kullanılan önemli bir model organizmadır. Zebra balığı ve insanlarda yapılan genetik çalışmalar, iskelet morfogenezinin altında yatan mekanizmalarda moleküler düzeydebenzerlikler göstermiştir 12. Ayrıca, zebra balıklarının büyük kavramalarında murin modellerinden daha yüksek verimli ilaç veya biyomolekül taraması yapılabilir ve proosteojenik veya osteotoksik moleküllerin mekanik çalışmasını kolaylaştırır13. Toto 10'daki iskeletin diferansiyel boyanması, küçük omurgalılar ve memeli fetüslerinde iskelet displazisinin incelenmesinde sıklıkla kullanılır. Alizarin kırmızısı boyama, zebra balığı larvalarındaki kimyasalların kemik gelişimsel toksisitesini araştırmak için yapıldı. Burada, zebra balığı larvalarında kurşun asetat kaynaklı kemik defektlerini tespit etmek için bir protokolü tanımlamak için kurşunu örnek olarak kullandık.

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl (pH = 7.5)</td> <td>Solarbio, Pekin, Çin</td> % 4 Paraformaldehit Düzeltme <td>Çözeltisini tutuklamak için</td><td>21</td></tr><tr><td>BBI</td><td>, Şangay, Çin</td><td>14</td><td>sabitleme mendili</td></tr><tr><td>10x PBS tamponu</td><td>BBI, Şangay, Çin</td><td>%</td><td></td></tr><tr><td>35 H 2 O < > </td> <td>Yonghua, Jiangsu, Çin</td><td>8</td><td>pigment çıkarma</td></tr><tr><td>50 mL Santrifüj tüpü</td><td>AKX, Jiangsu, Çin</td><td>4</td><td></td></tr>% <tr><td>95 Susuz etanol</td><td>Enox, Jiangsu, Çin</td><td>2</td><td>leke giderici</td></tr><tr><td>Alizarin kırmızısı (Saflık% 99,5)</td> <td>Solarbio, Pekin, Çin</td><td>1</td><td>boyama</td></tr><tr><td>Biyokimyasal inkübatör</td><td>Yiheng, Şangay, Çin</td><td>3</td><td>yükselen zebra balığı embriyoları</td></tr><tr><td>Elektronik ölçek</td><td>Sartorius, Almanya</td><td>5</td><td>Katı hammaddelerin tartılması</td></tr><tr><td>Gliserin (Saflık% 99,5)</td> <td>BBI, Şangay, Çin</td><td>7</td><td>lekeli balıkların saklanması</td></tr><tr><td>ImageJ (yazılım)</td> <td>ABD</td><td>9</td><td>dijital analiz</td></tr><tr><td>KOH (Saflık% 99,9)</td> <td>Sigma, Amerika</td><td>10</td><td>ağartma çözeltisi</td></tr><tr><td>Kurşun asetat trihidrat (Saflık% 99,5)</td> <td>Aladdin, Şangay, Çin</td><td>11</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 2 </ alt>(Saflık% 99.9)</td> <td>Aladdin, Şangay, Çin</td><td>12</td><td>temizleme solüsyonu</td></tr><tr><td>NIS-Elements F (yazılım)</td><td>Nikon, Japonya</td><td>13</td><td>gözlemleme ve fotoğraf çekme</td></tr><tr><td>Pipe</td><td>AKX, Jiangsu, Çin</td><td>18</td><td>embriyo ve çözelti plakalarının çıkarılması</td></tr><tr><td>(24 oyuklu)</td><td>Corning,Amerika</td><td>Embriyo plakalarını boyamak için</td><td>17</td> kap</tr><tr><td>(6 oyuklu)</td><td>Corning,Amerika</td><td>Embriyo yetiştirmek için</td> <td>16</td> konteyner</tr><tr><td>Silkeleme masası</td><td>Beyotime, Çin</td><td>19</td><td>çözeltiyi karıştırma</td></tr><tr><td>Stereo mikroskop</td><td>Nikon, Japonya</td><td>20</td><td>gözlem ve fotoğraf çekme</td></tr><tr><td>Zebra balığı</td><td>Soochow Üniversitesi Zebra Balığı Deney Merkezi, Suzhou, Çin</td><td>22</td><td>deney hayvanı</td></tr></tbody></table>

zebra balığı larvalarında kimyasal olarak İndüklenen kemik kaybını tespit etmek için alizarin kırmızı boyama kullanımı

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

Kurşun (Pb) maruziyetine bağlı kimyasal olarak indüklenen kemik kaybı, hem insan hem de hayvan iskelet sistemleri üzerinde bir dizi olumsuz etkiyi tetikleyebilir. Bununla birlikte, zebra balığındaki spesifik etkiler ve mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. Alizarin kırmızısı, kalsiyum iyonları için yüksek bir afiniteye sahiptir ve kemiği görselleştirmeye ve iskelet mineral kütlesini göstermeye yardımcı olabilir. Bu çalışmada zebra balığı larvalarında kurşun asetat (PbAc) kaynaklı kemik kaybını alizarin kırmızısı boyama yöntemi kullanarak saptamayı amaçladık. Zebra balığı embriyoları, döllenme sonrası 2 ila 120 saat arasında bir dizi PbAc konsantrasyonu (0, 5, 10, 20 mg / L) ile tedavi edildi. Döllenmeden 9 gün sonra larvalar üzerinde tam montajlı iskelet boyama yapıldı ve toplam lekeli alan ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü. Sonuçlar, mineralize dokuların kırmızıyla boyandığını ve lekeli alanın PbAc'a maruz kalma grubunda önemli ölçüde azaldığını ve kemik mineralizasyonunda doza bağlı bir değişiklik olduğunu göstermiştir. Bu yazıda PbAc'a bağlı kemik defektlerindeki iskelet değişikliklerini araştırmak için bir boyama protokolü sunulmaktadır. Bu yöntem, zebra balığı larvalarında, diğer kimyasalların neden olduğu kemik kaybının tespiti için de kullanılabilir.

Alizarin kırmızı boyama, zebra balığı larvalarında kemik mineralizasyonundaki değişiklikleri ölçmek için hassas ve spesifik bir yöntemdir. Bu çalışmada, PbAc'ın zebra balığı larvaları üzerinde ölüm, malformasyon, azalmış kalp atış hızı ve vücut uzunluğu kısalması gibi olumsuz etkileri olduğunu gözlemledik. Ayrıca, zebra balığı larvalarının mineral iskelet alanları, PbAc'ın neden olduğu kemik kaybını incelemek için değerlendirildi. 9 dpf'de (Şekil 1A), kafa iskeletinin birçok kemiği mineraliz...

Burada, kurşun asetat maruziyetinin zebra balığı larvalarında kemik kütlesi değişikliğine neden olduğunu göstermek için alizarin kırmızısı boyamayı kullandık. Bu boyama yöntemi, diğer tehlikeli toksik maddelerin neden olduğu zebra balığı larva kaybındaki kemik kaybının araştırılmasına uyarlanabilir.

Zebra Balığı Larvalarında Kimyasal Olarak İndüklenen Kemik Kaybını Tespit Etmek için Alizarin Kırmızı Boyama Kullanımı

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the ...

Bu yöntem, zebra balığındaki kimyasalların neden olduğu kemik toksisitesini tespit etmeye yardımcı olabilir. Alizarin Kırmızı Sabit dokunun boyanması, birkaç örneğin karşılaştırılmasını kolaylaştırabilecek iskelet değişikliklerinin kalıcı bir kaydını oluşturur. Bu teknik, zebra balığı modelinde osteoporozu incelemek için yararlı olabilir, çünkü osteoporozun özelliklerinden biri kemik kütlesindeki azalmadır.Döllenmeden sonraki dokuz günde her gruptan rastgele 10 zebra balığı larvasını çıkarın ve balıkları iki saat boyunca bir mililitre% 2 paraform aldehit ve 1X PBS'de sabitleyin. Çözeltiyi boşaltın ve zebra balığı larvalarını 100 milimolar Tris HCL kullanarak pH 7.5 veya 10 milimolar Magnezyum Klorür ile yıkayın. Boyama yapmak için, çözeltiyi boşaltın ve larvayı makalede açıklandığı gibi bir dizi çözelti içinde beş dakika boyunca inkübe edin.Son inkübasyondan sonra, çözeltiyi boşaltın ve% 3 hidrojen peroksit ve% 0.5 potasyum hidroksitten oluşan bir çözelti ile ağartarak pigmenti çıkarın. Pigment tamamen çıkarılana kadar her 10 dakikada bir gözlemleyin. Zebra balığı larvalarını% 25 gliserin,% 0.1 potasyum hidroksit ile kabarcık kalmayana kadar her biri 10 dakika boyunca birkaç kez durulayın.% 0.01'lik bir mililitreye batırılarak larvada leke Alizarin. Çözeltiyi boşaltın ve arka planı temizlemek için bir mililitre% 50 gliserin veya% 0.1 potasyum hidroksit ekleyin. Daha sonraki gözlemler için balıkları taze% 50 gliserin veya% 0.1 potasyum hidroksit içinde saklayın.Larvaları sıvı damlasının ortasında tutarak cam slayta bir seferde bir larva aktarın. Larvaları stereo mikroskop altında gözlemleyin. Fotoğraf makinesini açın.Yazılımı açın ve varsayılan ayarları koruyun. AE'ye tıklayın ve en iyi görüntüyü elde etmek için uygun bir pozlama süresi seçin. Tüm görüntüleri aynı ayarlar altında yakalayın.Daha sonra analiz etmek üzere görüntüleri nokta tiff biçiminde kaydedin. imageJ simgesine çift tıklayın. Kaydedilen görüntüleri analiz etmek için dosyaya tıklayın, ardından açın, ardından resme tıklayın, ardından sekiz bit yazın ve seçin.Düzenle'ye tıklayın ve ters çevirin. Analiz et'e tıklayın, ardından kalibre edin. Açılır arayüzde Kalibre edilmemiş OD'yi seçin.Alt arayüzün sol alt köşesindeki global kalibrasyonu kontrol edin ve Tamam'ı tıklatın. Analiz et'e tıklayın, ölçeği ayarlayın, ardından ölçeği kaldırın. Aşağıdaki global kontrol edin ve Tamam'ı tıklayın.Analize tıklayın, ardından ölçümleri ayarlayın. Açılır arabirimde öğe alanını seçin. Yalnızca seçilen aralığı ölçmek için aşağıdaki eşik sınırını kontrol edin ve Tamam'ı tıklayın.Resme tıklayın, ayarlayın, ardından eşik ve açılır arayüzün ortasındaki kaydırıcıyı kaydırın. Bir görüntüde test edilecek tüm hedeflerin seçilmesi için uygun eşiği seçmek için. Ve ayarla'yı tıklayın.Analiz et'e tıklayın, ardından tarihleri ölçün, kaydedin. Alizarin Kırmızı Boyama, zebra balığı larvalarında kemik mineralizasyonundaki değişiklikleri ölçmek için hassas ve spesifik bir yöntemdir. Döllenmeden dokuz gün sonra, parasfenoid, operküler, seratobranchial ve notokord gibi kafa iskeletinin birçok kemiği mineralize edilir ve bu nedenle kırmızıya boyanır.Buna karşılık, otolitler gibi kemikli olmayan yapılar kahverengi siyah görünür. Toplam lekeli alanı ölçmek için yapılan dijital analiz, kurşun asetat tedavi gruplarının litre başına 10 ve 20 miligramı için lekeli alanda önemli bir azalma olduğunu göstermiştir. Kemik mineralizasyonundaki değişiklikler doz bağımlılığı gösterdi.Daha iyi boyama etkisi ve gözlem için, zebra balığı larvalarının orijinal pigmentini çıkarmak ve ağartmadan sonra kabarcıkları çıkarmak önemlidir.

using-alizarin-red-staining-to-detect-chemically-induced-bone-loss

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video, Alizarin Kırmızı boyası kullanılarak kültürlenmiş primer osteoblastlarda mineralizasyon veya kalsiyum birikiminin derecesini tespit etmek için bir boyama tekniğini göstermektedir.

Alizarin Kırmızı Boyama: Kültürlenmiş Osteoblastlarla Mineralizasyonu Görselleştirme Tekniği

Bu videoda, anyonik bir boya olan Alizarin Red S kullanılarak osteoblast tarafından salgılanan kalsiyum birikintilerinin tespiti için bir yöntem açıklıyoruz. Kültürlenmiş osteoblastlar önce boyanır ve daha sonra boya, kalsiyum birikintilerinin kolorimetrik miktar tayini veya osteoblast mineralizasyon derecesi için geri kazanılır.

İn Vitro Mineralizasyon Deneyi: Alizarin Red S Boyama ve Ekstraksiyonu ile Kemik Grefti İkamesi Üzerindeki Osteoblast Kalsiyum Birikintilerini Ölçmek İçin Kolorimetrik Bir Yöntem

Nörolojik ve non-nörolojik hastalıkların çok zebra balığı model yetişkin balık ziyade embriyo / larva incelenir için, erişkin zebrabalıkları hastalık modellerinde uygulanabilen bir nicel yan hat rejeneratif deneyi geliştirilmiştir. Deney 1) neuromast ve 2) tek tek saç hücre düzeyde çözünürlüğü dahil.

Yetişkin Zebra balığı Lateral Hat Rejenerasyon için bir Deneyi

Bu çalışmada, zebra balığı larvaları üzerinde Evans Mavi Boya (EBD) analizi yapmak için basit bir yöntem açıklıyoruz.  Bu teknik, iskelet kası bütünlüğünün karakterizasyonu ve zebra balığı kas distrofisi modellerinin tanımlanması için güçlü bir araçtır ve yeni terapötiklerin geliştirilmesi için değerli bir yöntemdir.

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

Küçük laboratuvar balıkları, insan kemik bozukluklarının altında yatan mekanizmalar üzerine kemik araştırmaları ve kemik modüle edici ilaçların taranması için popüler modeller haline gelmiştir. Bu yazıda, osteoporotik lezyonları olan medaka larvalarında alendronatın kemik hücreleri üzerindeki etkisini değerlendirmek için bir protokol tanımlanmıştır.

İlaç Tedavi ve<em&gt; İn Vivo</em&gt; Bir Medaka Balık Osteoporoz Modelinde Osteoblast-Osteoklast Etkileşimler Görüntüleme

Zebra balığı içinde öldürücü iskelet mutant fenotipleri alellerle tarafından seçici üreme değiştirmek için bu iletişim kuralını hedefidir. Ölümcül mutantlar yetişkinliğe büyüdü ve kendilerini bred, bu nedenle bu protokolü izleme ve sınama döl tarafından birden fazla nesilden alellerle seçmek için bir yöntem açıklanır.

Zebra balığı öldürücü iskelet Mutant alellerle test döl tarafından değişen

Burada, 3 Yetişkin zebra balığı yaralanma model ve immünsupresif ilaç tedavisi ile kombine kullanımları açıklanmaktadır. Biz doku Yenileyici görüntüleme ve kemik Qafqaz orada tespit rehberlik sağlar.

Kemik doku Yenileyici prednizolon etkilerini incelemek için yetişkin zebra balığı yaralanma modelleri

Bu protokol, in vivo rejenerasyon sırasında zebra balığının elasmoid pullarının toplanmasını ve görselleştirilmesini açıklar. Ayrıca hasattan sonra 7 güne kadar bu ölçeklerin ex vivo kültürü sunulmaktadır.

Zebra Balığı Pul Rejenerasyonu Toto ve Ex Vivo Pul Kültürü

Bu protokol, basit bir in vitro kültür tekniği kullanarak hücresel dinamikleri incelemek için bir yöntem sunar. Zebra balığı araştırmacıları ve eğitimcileri, ölçeklerdeki floresan çekirdekleri ve apoptotik hücreleri görselleştirerek kemik homeostazı ve temel hücre biyolojisi ile ilgili olanlar gibi hücresel süreçleri inceleme fırsatı sunar.

Zebra Balığı Ölçeklerinde Hücresel Dinamikleri İncelemek için İn Vitro Kültür Tekniği

Bu protokol, zebra balığı larvalarında gerçekleştirilen ve kemik rejenerasyonunu ve ablasyona karşı bağışıklık tepkisinin etkilerini incelemek için bir model görevi gören iki fotonlu bir lazer ablasyon yaklaşımını tanımlar.

Gelişmekte Olan Zebra Balığı Larvalarında Osteoblastların İki Foton Lazer Aracılı Ablasyonu

Burada açıklanan protokol, 5 günlük bir zebra balığı larvasında kraniyofasiyal kıkırdakların boyanması ve diseksiyonu için basit ve takip etmesi kolay bir prosedür sunmaktadır. Çeşitli gelişim koşulları altında bu yapıların anatomisini, şeklini ve boyutunu incelemek için kullanılabilir.

Zebra Balığı Kraniyofasiyal Dokularının Alcian Mavisi ile Boyanması Üzerine Diseksiyonu

Keşfedin kimyasal kaynaklı kemik toksisitesini Danio rerio larvalarında alizarin kırmızı boyama ile tespit etme yöntemini. Bu teknik, osteoporoz ve çevresel toksinlerin iskelet sağlığına etkilerini araştırmak için kalıcı kayıtlar sunar.

Zebra Balığı Larvalarında Kimyasal Olarak İndüklenen Kemik Kaybını Tespit Etmek için Alizarin Kırmızı Boyama Kullanımı

Daha fazla video keşfet