Name: Zebra Balığı Larvalarında Omurilik Rejenerasyonunu İncelemek için Kontrollü Yarı Otomatik Lazer Kaynaklı Yaralanmalar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Öğrenin, Danio rerio larvalarında omurilik rejenerasyonunu incelemek için yarı otomatik lazer yaralanma yöntemini. Bu teknik, çevre dokulara zarar vermeden tekrarlanabilir yaralanmalar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma BBSRC (BB/S0001778/1) tarafından desteklenmiştir. CR, Princess Royal TENOVUS İskoçya Tıbbi Araştırma Burs Programı tarafından finanse edilmektedir. David Greenald'a (CRH, Edinburgh Üniversitesi) ve Katy Reid'e (CDBS, Edinburgh Üniversitesi) transgenik balıkların nazik hediyesi için teşekkür ederiz ( Ek Dosyaya Bakınız). Daniel Soong'a (CRH, Edinburgh Üniversitesi) 3i eğirme diski konfokaline nazik erişim için teşekkür ederiz.

Tüm hayvan çalışmaları, İngiltere İçişleri Bakanlığı'nın onayıyla ve yönetmeliklerine göre, PP8160052 proje lisansı altında gerçekleştirilmiştir. Proje, Edinburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Deneysel analizler için, her iki cinsiyetten 5 güne kadar olan zebra balığı larvaları aşağıdaki mevcut transgenik çizgilerden kullanılmıştır: Tg (Xla.Tubb: DsRed; mpeg1: GFP), Tg (Xla.Tubb: DsRed), Tg (betaaktin: utrophin-mCherry), Tg (Xla.Tubb: GCaMP6s) ve Tg (mnx1: gfp) (transgenik zebra balığı hatlarının üretimi ile ilgili Ek Dosya 1'e bakınız). Otomatik zebra balığı larva işleme platformunu kullanan protokolün bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu çalışmada kullanılan tüm özel yazılımlar, komut dosyaları ve ayrıntılı deneysel protokoller https://github.com/jasonjearly/micropointpy/ mevcuttur.
1. Numune hazırlama
<ol><li>Döllenme sonrası 5 saatte, embriyoları doğru gelişim aşaması için sıralayın21. Ölü yumurtaları ve zayıf gelişmiş ve aşırı gelişmiş embriyoları atın.</li>
	<li>Döllenme sonrası 3 günde (dpf), 90 mm'lik bir Petri kabında 50 mL balık tesisi suyuna 2 mL% 0.4 aminobenzoik-asit-etil-ester ekleyerek larvaları uyuşturun. Bir sorun olması durumunda cilt pigmentasyonunu önlemek için feniltiourea (PTU) ile yetiştirilen hayvanları kullanın (bkz. materyal tablosu), bu protokolde açıklanan 3 dpf larvalarında omurilik yaralanmaları için geçerli değildir. NOT: Bu nispeten yüksek anestezik konsantrasyon, lazer darbesini takiben larvaların hareketlerini önlemek için kullanılır.</li>
	<li>Embriyoları floresan muhabir ekspresyonu için tarayın (Ek Dosya 1). NOT: Yaralanmanın etkinliğini değerlendirmek için omurilik (veya diğer ilgi çekici yapı) için bir floresan muhabir sıklıkla gereklidir. Tg (Xla.Tubb: DsRed) kullanımı omuriliğin tanımlanmasına yardımcı olur.</li>
	<li>Seçilen larvaları, kuyu başına 300 μL balık tesisi suyu ile VAST sisteminde kullanılmak üzere 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Doğrudan 90 mm Petri kabından anestezi içeren ortamı kullanın. Kuyu başına sadece bir larva olduğundan emin olun. Lezyonlu larvaları toplamak için fazladan bir boş 96 kuyucuklu plaka hazırlayın. NOT: Başka bir lazer lezyon sistemi kullanıyorsanız, larvaları uygun bir gözlem odasında% 1 Düşük Erime Noktası (LMP) agaroz jeline monte edin.</li>
</ol>2. Mikroskop hazırlama
<ol><li>Ablasyon için lazer de dahil olmak üzere tüm sistem bileşenlerini (VAST, mikroskop, lazer, PC) açın.</li>
	<li>Donanım tamamen başlatıldıktan sonra, mikroskop yazılımını, ImageJ / Fiji'yi, piton entegre geliştirme ortamını (IDE) ve bu platformu kullanıyorsanız otomatik zebra balığı görüntüleme (VAST sistemi) yazılımını başlatın (bkz.</li>
	<li>Aşağıdaki adımları izleyerek VAST yazılımını kurun.<ol>
<li>VAST yazılımı başlatıldığında, ilk pencerede Plate'i seçin ve Bitti düğmesine tıklayın (Şekil 2A). Kılcal damarın boş ve temiz olup olmadığını soran başka bir küçük pencere açılacaktır. İçinde herhangi bir hava kabarcığı varsa kılcal damarın görüntüsüne bakarak doğrulayın. Değilse, Evet'e tıklayın. Herhangi bir kabarcık varsa, Hayır'a tıklayın ve 2.3.2-2.3.3 adımını izleyin (Şekil 2B).</li>
		<li>Büyük Parçacık (LP) Örnekleyici penceresinde, hava kabarcıklarını gidermek için Prime'a tıklayın (Şekil 2C).</li>
		<li>Ana yazılım penceresine gidin (kılcal görüntü ile) ve resme sağ tıklayın. Açılır menüden Boş kılcal görüntüyü kaydet'i seçin (Şekil 2B).</li>
		<li>LP Örnekleyici penceresinde, Dosya menüsüne gidin ve Komut Dosyası Aç seçeneğini belirleyin. Gerçekleştirilecek denemeye karşılık gelen komut dosyasını içeren bir dosya seçin.</li>
		<li>Ana VAST yazılım penceresinde Dosya'ya gidin ve Denemeyi Aç'ı seçin. Planlanan denemeye karşılık gelen deneme dosyasını seçin. NOT: Otomatik boşaltma ve Atıklara toplu çıkış kutularının işaretli OLMADIĞINDAN emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Görüntüleme için mikroskop yazılımını kurun.<ol>
<li>Donanımı başlatmak için mikroskop görüntüleme yazılımını başlatın (bkz. Bu işlem, sisteme bağlı olarak birkaç dakika sürebilir.</li>
		<li>Edinme ayarlarına gidin ve larvalarda ifade edilen floroforu görüntülemek için mikroskopu kurun. Odak hacminin, omuriliğin veya hedeflenen dokunun tüm derinliğini lezyona uğratmak için optik eksen boyunca yeterince uzadığından emin olmak için 10x NA 0.5 su daldırma hedefi kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lazer lezyonları için ImageJ/Fiji'yi kurun.<ol>
<li>Dosya menüsüne gidin, komut dosyası penceresini açmak için Yeni/Komut Dosyası'nı seçin.</li>
		<li>Yeni pencerede, Dosya menüsüne gidin ve lazer lezyonu komut dosyasını (Manual_MP_Operation.ijm) yüklemek için Aç'ı seçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Python IDE'yi ayarlayın.<ol>
<li>Python IDE'yi başlatın.</li>
		<li>Dosya menüsüne gidin ve lazeri yönetmek üzere komut dosyasını yüklemek için Dosya Aç'ı seçin (Watch_for_ROIs_py3.py).</li>
		<li>Çalıştır menüsüne gidin ve komut dosyasını çalıştırmak için Hata Ayıklama Yapmadan Çalıştır'ı seçin. Lazer zayıflatıcı başlatılırken TERMINAL panelindeki bir dizi iletinin bir miktar gürültüyle birlikte göründüğünden emin olun (Şekil 2D).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. VAST sisteminde lazer lezyonlarının yapılması
<ol><li>VAST yazılımının ana penceresindeki ok düğmelerine tıklayarak sahneyi hareket ettirerek kılcal damarı mikroskop hedefine göre ortalayın (Şekil 2B).</li>
	<li>Göz merceklerinden bakarak ve mikroskopun iletilen ışığını kullanarak kılcal damarın tepesine odaklanın. DİKKAT: Kılcal damar çok kırılgandır ve hedefe dokunulduğunda kırılabilir. İçeri ve dışarı odaklanırken mikroskop düğmesini yavaşça hareket ettirin.</li>
	<li>96 delikli plakaları, VAST sisteminin LP Örnekleyicisinin plaka tutucusuna yerleştirin. Larva içeren plakayı sol tutucuya ve toplama plakasını sağa yerleştirin. Plakaların doğru yönlendirildiğinden emin olun: A1 kuyusu, tutucunun sol ön köşesinde olmalıdır.</li>
	<li>VAST yazılımında, LP Örnekleyici penceresinde, Plaka Şablonu düğmesine tıklayın ve larva içeren tüm kuyucukları seçin. Pencereyi doğrulamak ve kapatmak için Tamam düğmesine tıklayın (Şekil 2C).</li>
	<li>LP Örnekleyici penceresinde, larva yüklemeye başlamak için Plakayı Çalıştır düğmesine tıklayın. NOT: Bir süre sonra, larva kılcal damarda pozisyonda (deney tanım dosyasında önceden tanımlanmış) görünür olmalı ve omuriliğe zarar vermelidir. VAST tepsi ışığı, larvayı mikroskop hedefine bakan yanal tarafla ayarlamak için birkaç rotasyondan sonra kapanacaktır.</li>
	<li>Mikroskop yazılımına gidin ve larvaları görüntülemek için Canlı düğmesine tıklayın.</li>
	<li>Mikroskop odak düğmesini omurilik merkezi kanalı görünene kadar çevirin. NOT: Önce iletilen ışığı kullanarak odaklamak ve ardından floresan ile rafine etmek daha kolay olabilir.</li>
	<li>Floresan bir anlık görüntü alın ve görüntüyü özel bir klasöre kaydedin.</li>
	<li>Görüntüyü ImageJ'de açın ve gerekirse kontrastı ayarlayın ( ImageJ'deki Image/Adjust/Brightness/contrast... menüsünü kullanarak).</li>
	<li>İlgi Çekici Bölge (ROI) çizgi aracına tıklayın ve omuriliğe ortalanmış kısa bir çizgi (20 μm) çizin (Şekil 3A).</li>
	<li>Mikroskobu %100 yansıtıcı ayna konumuna getirin.</li>
	<li>ImageJ komut dosyasını yükleyin ve Çalıştır düğmesine tıklayın. Aşağıdaki parametreleri kullanın: Tekrarlama - 2; Örnek - 1; Genişlik - 40 mikron; Zayıflama - 89 (Tam lazer gücü) (Şekil 3C).</li>
	<li>Lazer atış sırası tamamlandığında, görüntüleme yazılımında floresan görüntülemeye geçin ve gerekirse odağı ayarlayın. NOT: Lazere maruz kalma sırasında kuyruk yer değiştirmesi nedeniyle odakta bir kayma sıklıkla gözlenir.</li>
	<li>Yeni bir anlık görüntü alın ve kaydedin.</li>
	<li>Bu yeni görüntüyü ImageJ'de açın ve omuriliğin kendisinden (~ 80 μm) daha büyük olması gereken, notochord'un üst kısmındaki omuriliğin ventral tarafının altından başlayıp omurilik ile cilt arasındaki boşlukta sona erecek şekilde dorsal tarafa doğru giden yeni bir çizgi çizin (Şekil 3B).</li>
	<li>Mikroskobu %100 yansıtıcı ayna konumuna getirin.</li>
	<li>ImageJ komut dosyası penceresine gidin ve Çalıştır düğmesine tıklayın. Aşağıdaki parametreleri kullanın: Tekrarlama - 2; Örnek - 1; Genişlik - 40 mikron; Zayıflama - 89 (Tam lazer gücü).</li>
	<li>(Daha uzun) lazer atış sırası bittikten sonra, floresan görüntüleme ve odaklama ile transeksiyon kalitesini doğrulayın. Lezyon bölgesinde hiçbir hücre veya aksonun bozulmadan kalmadığından emin olun, bu da karanlık veya soluk ve homojen bir floresan alan olarak görünmelidir (Şekil 3D, alt panel).</li>
	<li>Lezyonlu larvaları, ana VAST yazılım penceresine gidip Topla düğmesine tıklayarak boş 96 delikli plakaya (orijinal kuyununkiyle aynı kuyu koordinatlarına sahip) toplayın .</li>
	<li>Pencerenin sol alt köşesindeki Tepsi Işığı onay kutusunu tıklatarak VAST sistem ışığını tekrar açın.</li>
	<li>Yaralanacak her yeni larva için adım 3.3-3.17'yi tekrarlayın.</li>
</ol>4. Lezyon sonrası elleçleme ve ek deneyler
<ol><li>Larvaları 96 kuyucuklu plakadan mümkün olan en kısa sürede çıkarın ve larvaların lezyon sonrası iyileşmesi için taze balık tesisi suyu ile temiz bir Petri kabına aktarın. Petri kabını 28 ° C'de bir inkübatöre koyun. NOT: Hasar genellikle lezyondan sonraki ilk saat içinde yayılmaya devam eder. Bu nedenle lezyonun gerçek boyutu, yaklaşık 1 saatlik bir gecikmeden sonra floresan görüntüleme ile değerlendirilmelidir.</li>
</ol>5. Sorun Giderme
<ol><li>VAST sisteminin tüplerinde ve kılcal damarlarında hava kabarcıkları varsa, bunları çıkarmak için LP Örnekleyici penceresindeki Prime düğmesine tıklayın.</li>
	<li>Başarısız lezyonları göz önünde bulundurun (lezyon bölgesinde kalan floresandan değerlendirildiği gibi, beklenen kalıntı ve homojen arka plan dışında), aşağıda belirtilen çeşitli nedenlerden kaynaklanabilir.<ol>
<li>Düşük lazer gücü: Bu olduğunda, daha yüksek bir değerle deneyin. NOT: VAST sistemi bir boya lazeri ile donatılmıştır. Bu, lazer ışığı üretimi için kullanılan boya çözeltisinin konsantrasyonunun zamanla değişebileceği ve lazer gücünde bir azalmaya yol açabileceği anlamına gelir. Yeni bir çözümle değiştirmek genellikle sorunu çözer22.</li>
		<li>Kötü kalibrasyon: Bu olduğunda, lazer sisteminin kalibrasyonunu ve gücünü adım 5.2.2.1-5.2.2.4'e göre doğrulayın. Doğru şekilde kalibre edilmezse, lazer istenen yere yönlendirilmez, böylece başarısız lezyonlara veya komşu dokularda istenmeyen hasara yol açar.<ol>
<li>Kılcal haznenin üstüne bir ayna kaydırağı yerleştirin. Kaplanmış tarafa odaklanın (hedefe bakmalıdır). Daha kolay odaklanmak için slaytta önceki bir varsayılanı kullanın.</li>
			<li>Bir kalibrasyon betiği kullanarak bir lazer ablasyon paterni uygulayın.</li>
			<li>Desenin kalitesini değerlendirin. Noktalar veya çizgiler keskin görünmeli ve bulanık olmamalıdır.</li>
			<li>Lazer gücünün önceki seanslara göre değişip değişmediğini değerlendirmek için artan güce sahip bir rampa kullanın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lezyonlar sırasında larva hareketi: Larvalar anesteziye farklı tepki verir; böylece lazer lezyonu işlem sırasında kuyruğun hareketlerini tetikleyerek başarılı bir transeksiyonun önlenebilmesini sağlar. Bu olduğunda, çevredeki dokulara zarar vermekten kaçınırken tamamlamak için lazer lezyonu adımlarının ekstra bir yinelemesini yapın.</li>
		<li>Kötü odaklanma: Bu gerçekleştiğinde, en iyi sonuçları almak için merkezi kanalın ortasına odaklanın.</li>
		<li>ROI çizimi, pozisyonu ve boyutu: ROI'nin konumu ve boyutu, başarılı transeksiyonlar için kritik öneme sahiptir. ROI, omurilikten daha büyük olmalı ve omuriliğin merkezine odaklanmalıdır. Bunu çözmek için, ROI'yi omuriliğin ventral tarafından çekmeye başlayın ve başarılı bir transeksiyon elde etmek için dorsal tarafa doğru yukarı çıkın. Bu muhtemelen ablasyon prosedürü sırasında lazer atışlarının sırası tarafından tetiklenen kuyruk hareketlerinden kaynaklanmaktadır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+zebrafish+as+a+model+for+successful+central+nervous+system+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Restorative+Neurology+and+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration.</a> Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).</li>
<li>Ohnmacht, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+motor+neurons+are+regenerated+after+mechanical+lesion+and+genetic+ablation+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish.</a> Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).</li>
<li>Anguita-Salinas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dynamics+during+spinal+cord+regeneration+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish.</a> Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).</li>
<li>Chapela, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+drug+screening+platform+boosts+the+discovery+of+novel+therapeutics+for+spinal+cord+injury+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals.</a> Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).</li>
<li>Schlüßler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+mapping+of+spinal+cord+growth+and+repair+in+living+zebrafish+larvae+by+brillouin+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging.</a> Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).</li>
<li>Cavone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+macrophage+subpopulation+signals+directly+to+progenitor+cells+to+promote+regenerative+neurogenesis+in+the+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord.</a> Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).</li>
<li>Keatinge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+gRNA+phenotypic+screening+in+zebrafish+reveals+pro-regenerative+genes+in+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury.</a> PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).</li>
<li>National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nc3rs.org.uk">https://nc3rs.org.uk</a> (2021).</li>
<li>Hui, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+wide+expression+profiling+during+spinal+cord+regeneration+identifies+comprehensive+cellular+responses+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish.</a> PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).</li>
<li>Vasudevan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerated+interneurons+integrate+into+locomotor+circuitry+following+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).</li>
<li>Becker, T., Becker, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cell+interactions+allow+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).</li>
<li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+controls+pro-regenerative+Collagen+XII+in+functional+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).</li>
<li>Briona, L. K., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+transection+in+the+larval+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualised+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Spinal cord transection in the larval Zebrafish.</a> Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).</li>
<li>Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+regeneration+in+adult+Zebrafish+by+gentamicin+induced+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).</li>
<li>Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305 (5681), 254-258 (2004).</li>
<li>Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+mitochondrial+transport+in+single-axon+regeneration+of+zebrafish+mauthner+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).</li>
<li>Nichols, E. L., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regeneration+of+the+sensory+root+via+axonal+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion.</a> Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).</li>
<li>Ellström, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury+in+zebrafish+induced+by+near-infrared+femtosecond+laser+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).</li>
<li>Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+exit+the+CNS+in+spinal+root+avulsion%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia exit the CNS in spinal root avulsion.</a> PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).</li>
<li>Early, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+high-resolution+in+vivo+screen+in+zebrafish+to+identify+chemical+regulators+of+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination.</a> eLife. , 1-31 (2018).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>AndOr Micropoint Manual. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual">https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual</a> (2021).</li>
<li>Knafo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensory+neurons+control+the+timing+of+spinal+microcircuit+selection+during+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion.</a> eLife. 6, 25260(2017).</li>
<li>Tsarouchas, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+control+of+proinflammatory+cytokines+Il-1%CE%B2+and+Tnf-%CE%B1+by+macrophages+in+zebrafish+spinal+cord+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Howell, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHowell%2C+D+%22Statistical+methods+for+psychology%22">Statistical methods for psychology</a>. , Duxbury. 324-325 (2002).</li>
<li>Tukey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+individual+means+in+the+analysis+of+variance%5BTitle%5D)+AND+%22Biometrics%22%5BJournal%5D)">Comparing individual means in the analysis of variance.</a> Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).</li>
<li>Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+development+of+voltage-gated+Na%2B+and+K%2B+currents+regulates+functional+maturation+of+forebrain+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).</li>
<li>Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+long-term%2C+multi-channel+and+non-invasive+electrophysiology+platform+for+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li>
<li>Menelaou, E., McLean, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+control+of+locomotion+by+distinct+types+of+spinal+V2a+interneurons+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish.</a> Nature Communications. 10, 1-12 (2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Zebra balıklarında rejenerasyon sırasında oyunda olan süreçlerin daha derin bir şekilde anlaşılmasına acil bir ihtiyaç vardır. Bu hayvan modeli, biyomedikal araştırmalara, özellikle omurilik yaralanmalarına birçok fayda sağlar1. Çalışmaların çoğu, iyi eğitimli bir operatör gerektiren ve çoklu doku hasarına neden olan manuel lezyonları içermektedir. Burada lezyon özellikleri üzerinde kontrol sağlayan ve çevre dokulara verilen hasarı azaltan bir lazer lezyon protokolü sunulmaktadır. Ayrıca, bu tekni...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63259">Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae</a>. The title was&#160;updated.
The title was updated from:
Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
to:
Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63259">Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae</a>. The Title was&#160;updated.

Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Memelilerin aksine, zebra balığı (Danio rerio) yaralanmadan sonra merkezi sinir sistemlerini (CNS) onarabilir1. Zebra balığı larvalarının omurilik rejenerasyonu için bir model olarak kullanılması nispeten yenidir. Onarımın altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için değerli olduğu kanıtlanmıştır2. Bunun nedeni, manipülasyon kolaylığı, kısa deneysel döngü (her hafta yeni larvalar), dokuların optik şeffaflığı ve larvaların in vivo floresan mikroskobu için ideal olan küçük boyutudur.
Omurilik rejenerasyonu durumunda, larva kullanmanın iki ek avantajı, iyileşme hızı, yetişkinler için birkaç haftaya kıyasla birkaç gün ve manuel teknikler kullanarak yaralanmaları indükleme kolaylığıdır. Bu, son araştırmalar da dahil olmak üzere birçok çalışmada3,4,5 başarıyla kullanılmıştır6,7. Genel olarak, bu anlamlı veri üretiminin artmasına, deneysel protokollerin yüksek uyarlanabilirliğine ve deneysel maliyetlerin azalmasına neden olur. Döllenmeden sonraki 5 günden daha genç larvaların kullanımı, hayvan araştırmalarında 3R ilkelerini izleyerek hayvanların kullanımını da azaltır8.
Zebra balığı larvalarında omurilik yaralanmasından sonra, enflamatuar yanıt, hücre proliferasyonu, nörogenez, hayatta kalan veya yeni üretilen hücrelerin göçü, fonksiyonel aksonların reformu ve nöral süreç devrelerinin ve omurga dokularının küresel olarak yeniden şekillendirilmesi dahil olmak üzere birçok biyolojik süreç meydana gelir6,7,9,10 . Başarılı bir şekilde organize edilmek için, bu süreçler bir dizi hücre tipi, hücre dışı matris bileşenleri ve biyokimyasal sinyaller arasında ince bir şekilde düzenlenmiş bir etkileşimi içerir11,12. Omurilik gibi karmaşık bir dokunun bu önemli yeniden yapılanmasının ayrıntılarını çözmek, hassas ve kontrollü deneysel yaklaşımların kullanılmasını ve geliştirilmesini gerektirir.
Zebra balıklarında omurilik rejenerasyonunu incelemek için kullanılan birincil deneysel paradigma, rezeksiyon, bıçaklama veya kriyoyaralanma yoluyla doku hasarını indüklemek için cerrahi araçlar kullanmaktır3,13. Bu yaklaşımlar, herhangi bir yeni operatör için zaman alıcı olan ve kısa vadeli projelerde kullanılmalarını engelleyebilecek mikrocerrahi becerilerinde özel eğitim gerektirme dezavantajına sahiptir. Ayrıca, genellikle rejenerasyonu etkileyebilecek çevre dokulara zarar verirler.
Başka bir yaklaşım da kimyasal olarak14 veya genetik manipülasyonlarla15 hücre hasarını indüklemektir. İkincisi, yüksek oranda hedeflenmiş hasara izin verir. Bununla birlikte, böyle bir teknik, herhangi bir deney yapmadan önce, her benzersiz bir hücre tipi hedeflendiğinde yenilenen yeni transgenik balıklar üretmek için uzun hazırlık çalışmaları gerektirir.
Bu nedenle, rejenerasyonda çeşitli çalışmalara uygun, hedefe yönelik ancak çok yönlü lezyonlara izin veren bir yönteme ihtiyaç vardır. Bir çözüm, ilgilenilen dokuda lokalize hasarı indüklemek için bir lazer kullanmaktır16,17,18,19,20. Gerçekten de, lazere bağlı doku hasarının kullanımı, birçok avantajı olan omurilik lezyonlarının oluşturulması için sağlam bir yaklaşım sunmaktadır. Bu tür lazer manipülasyon modülleri ile donatılmış mikroskoplar, zamansal kontrolün ekstra yararı ile hücre ablasyonunun gerçekleşeceği özelleştirilmiş şekilli bir alanın belirlenmesine izin verir. Lezyonun boyutu ve pozisyonu böylece herhangi bir soruyu ele almak için uyarlanabilir.
Çoğu lazer lezyon sisteminin eksik özelliği, bir dizi larva için yüksek oranda tekrarlanabilir bir şekilde yaralanmalara neden olma olasılığıdır. Burada, zebra balığı larvalarında yarı otomatik hassas ve kontrollü lezyonları indüklemek için otomatik larva kullanımı için tasarlanmış mikroakışkan bir platforma dayanan orijinal bir protokol açıklanmaktadır21. Dahası, burada sunulan sistemde, larvalar, hayvanın rostrokaudal ekseni etrafında serbest dönmesine izin veren bir cam kılcal damara yerleştirilir. Kullanıcı, larvaların hangi tarafının lazere sunulacağını seçebilirken, floresan görüntülemenin lazer ışınını tam olarak hedeflemesine ve lezyondan sonraki hasarı değerlendirmesine izin verebilir.
Burada açıklanan protokol, UV lazerle donatılmış bir eğirme diski (bundan böyle VAST sistemi olarak anılacaktır) ile birleştirilmiş yarı otomatik bir zebra balığı larva görüntüleme sistemi ile birlikte kullanılmaktadır. Bununla birlikte, protokolün ana noktaları ve tekniğin iddialarının çoğu, iki fotonlu lazer tarama mikroskopları, UV lazerle sağlanan dönen disk mikroskopları (FRAP modülü) veya fotoğraf manipülasyonu için lazer modüllü video mikroskoplar dahil olmak üzere hücre ablasyonu yapabilen bir lazerle donatılmış herhangi bir sistem için geçerlidir. VAST sistemi ile geleneksel numune işleme arasındaki temel farklardan biri, ikincisi için, larvaların 96 delikli bir plakaya yüklenmesi yerine, cam kapaklar / cam tabanlı Petri tabakları üzerine düşük erime noktalı agarozda monte edilmesinin gerekli olmasıdır.
Bu yöntemin sunduğu faydalar, rejenerasyon sürecinde hücresel ve moleküler mekanizmalar hakkında yenilikçi araştırmalar için fırsatlar sunmaktadır. Ayrıca, yüksek veri kalitesi, multidisipliner bir bağlamda nicel araştırmalara izin verir.

<table><tbody><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop yazılımı Zen Blue 2.0</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/FIJI</td><td>Açık Kaynak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visual Studio Code</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop ve aksesuarları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ApoTome mikroskobu</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) daldırma lensi</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>çift AxioCam 506 m CCD kameralar</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lazer taramalı konfokal mikroskop LSM880</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eğirme diski modülü CSU-X1</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dik mikroskopAxio Examiner D1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV lazer</td><td>Micropoint</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VAST BioImager</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>90 mm Petri kabı</td><td>Thermo-Fisher</td><td>101R20</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka</td><td>Corning</td><td>3841</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Click-It EdU Görüntüleme Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>C10637</td><td></td></tr><tr><td>aminobenzoik asit-etil metil-ester (MS222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>feniltiyoüre (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Antikorlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti-tavuk Alexa Fluor 488</td><td>Jackson</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti-fare Cy3</td><td>Jackson</td><td>715-165-150</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>AB13970</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-tubulin asetillenmiş antikor</td><td>Sigma</td><td>T6793</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Transgenik zebra balığı hatları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tg(beta-aktin:utrofin-mCherry)</td><td></td><td>N/A</td><td>David Greenhald tarafından kurulan, Edinburgh Üniversitesi</td></tr><tr><td>Tg(mnx1:gfp)</td><td></td><td>N/A</td><td>İlk olarak [Flanagan-Steet et al. 2005]</td></tr><tr><td>Tg(Xla.Tubb:DsRed)</td><td></td><td>N/A</td><td>İlk olarak [Peri ve Nusslein-Volhard 2008]</td></tr><tr><td>Tg(Xla.Tubb:DsRed; mpeg1:GFP)</td><td></td><td>N/A</td><td>Katy Reid tarafından kuruldu, Edinburgh Üniversitesi</td></tr><tr><td>Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)</td><td></td><td>N/A</td><td>David Greenhald tarafından kuruldu, Edinburgh Üniversitesi</td></tr></tbody></table>

zebra balığı larvalarında omurilik rejenerasyonunu İncelemek için kontrollü yarı otomatik lazer kaynaklı yaralanmalar

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Zebra balığı larvaları, döllenmeden sadece birkaç gün sonra yüksek rejeneratif kapasiteye sahip tamamen işlevsel bir merkezi sinir sistemine (CNS) sahiptir. Bu, bu hayvan modelini omurilik yaralanması ve rejenerasyonunu incelemek için çok yararlı kılar. Bu tür lezyonları indüklemek için standart protokol, gövdenin dorsal kısmını manuel olarak transekte etmektir. Bununla birlikte, bu teknik kapsamlı eğitim gerektirir ve ek dokulara zarar verir. Lazerle indüklenen lezyonlar için bu sınırlamaları aşmak için bir protokol geliştirildi ve eğitimsiz bir operatör için bile birçok hayvan üzerinde ve farklı seanslar arasında omurilik transeksiyonunun yüksek tekrarlanabilirliği ve bütünlüğüne izin verdi. Ayrıca, doku hasarı esas olarak omuriliğin kendisi ile sınırlıdır ve cilt, kas ve CNS gibi farklı dokulara zarar vermenin kafa karıştırıcı etkilerini azaltır. Ayrıca, omuriliğin hemi-lezyonları mümkündür. Lazer hasarından sonra doku bütünlüğünün daha iyi korunması, elektrofizyoloji gibi ek analizler için gerekli olan daha ileri diseksiyonları kolaylaştırır. Bu nedenle, bu yöntem manuel olarak ulaşılamayan yaralanma derecesinin hassas kontrolünü sağlar. Bu, gelecekte bu güçlü modelde yeni deneysel paradigmalara izin verir.

Omurilik transeksiyonunun doğrulanması Protokolün tam omurilik transeksiyonuna izin verip vermediğini değerlendirmek için yapısal ve fonksiyonel araştırmalar yapıldı.
İlk olarak, lezyon bölgesindeki floresan kaybının lazer aydınlatmadan floresan fotobeyazlatma değil, nöronal doku hasarından kaynaklandığını doğrulamak için, asetillenmiş tübüline karşı bir antikor kullanarak immün boyama (bakınız Materyal Tablosu ve Ek Dosya 1) yapıldı. Lezyo...

Bu protokol, larva elleçlemesi için otomatik bir mikroakışkan platform ile birleştirilmiş bir lazer lezyon sistemi kullanarak zebra balığı larvalarında dokuya özgü ve yüksek oranda tekrarlanabilir yaralanmaları indüklemek için bir yöntemi açıklamaktadır.

Zebra Balığı Larvalarında Omurilik Rejenerasyonunu İncelemek için Kontrollü Yarı Otomatik Lazer Kaynaklı Yaralanmalar

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...

Burada önerdiğimiz teknik, bitişik dokulara verilen hasarı azaltarak ve deneyimsiz operatörler için bile tekrarlanabilirliği artırarak manuel lezyon protokollerinin sınırlamalarının üstesinden gelmemizi sağlar. Bu teknik, hedeflenen bir UV lazerle birleştirilmiş dönen cam kılcal damar sayesinde çevre dokulara zarar vermeden lezyonun tam olarak nerede indükleneceğini seçmemizi sağlar. VAST ekipmanının çalıştırılmasında birçok adım söz konusudur, bu nedenle her şeyin doğru yapıldığından emin olmak için her adımı işaretlemenizi tavsiye ederim.Larvaları anestezi içeren ortamı kullanarak anestezi yaparak başlayın ve daha sonra bunları kuyucuk başına 300 mikrolitre ortam içeren 96 delikli bir plakaya aktarın. Ablasyon için lazer de dahil olmak üzere tüm sistem bileşenlerini açın. Ardından, otomatik zebra balığı görüntülemeyi veya VAST yazılımını başlatın, ilk pencerede Plaka'yı seçin ve Bitti düğmesine tıklayın.Kılcal damarın boş ve temiz olup olmadığını soran küçük bir pencere açılacaktır. İçerideki hava kabarcıkları için kılcal damarın görüntüsünü kontrol edin. İçinde hava kabarcığı yoksa, açılan pencerede Evet'e tıklayın.LP Örnekleyici penceresinde, Dosya menüsüne gidin ve Komut dosyasını aç seçeneğini belirleyin. Gerçekleştirilecek denemeye karşılık gelen komut dosyasını içeren bir dosya seçin. Ardından, ana VAST yazılım penceresinde Dosya'ya gidin ve Denemeyi aç'ı seçin.Planlanan denemeye karşılık gelen deneme dosyasını seçin. ImageJ/Fiji yazılımını başlatın, Dosya menüsüne gidin ve komut dosyası penceresini açmak için Yeni komut dosyası'nı seçin. Ardından, Dosya menüsüne gidin ve lazer lezyon betiğini yüklemek için Aç'ı seçin.Ardından, Python IDE'yi başlatmak için Dosya menüsüne gidin ve lazeri yönetmek üzere komut dosyasını yüklemek için Dosya aç'ı seçin. Ardından, Çalıştır menüsüne tıklayın ve komut dosyasını çalıştırmak için Hata Ayıklamadan Çalıştır'ı seçin. Lazer zayıflatıcı başlatılırken terminal panelindeki bir dizi mesajın bir miktar gürültüyle birlikte göründüğünden emin olun.VAST yazılımının ana penceresinde, sahneyi hareket ettirmek ve kılcal damarı mikroskop hedefine göre ortalamak için ok düğmelerine tıklayın. Göz merceklerine bakın ve mikroskopun iletilen ışığını kullanarak kılcal damarın tepesine odaklanın. LP numune alma cihazının sol plaka tutucusuna larvaları içeren 96 delikli bir plaka yerleştirin.Ardından, numune alma cihazının sağ plaka tutucusuna toplama için başka bir plaka yerleştirin. Plakanın A1 kuyucuğunun tutucunun sol ön köşesinde olduğundan emin olun. VAST yazılımının LP Örnekleyici penceresinde, Plaka şablonu düğmesine tıklayın ve larva içeren tüm kuyucukları seçin.Pencereyi doğrulamak ve kapatmak için Tamam düğmesine tıklayın. Ardından, larvaları yüklemeye başlamak için LP Örnekleyici penceresindeki Plakayı çalıştır düğmesine tıklayın. Ardından, mikroskop yazılımına gidin ve larvaları görüntülemek için Canlı düğmesine tıklayın.Mikroskop odak düğmesini, omurilik merkezi kanalı görünene kadar açın. Floresan ile anlık görüntü alın ve görüntüyü bir klasöre kaydedin. Görüntüyü ImageJ'de açın ve gerekirse kontrastı ayarlayın.İlgi alanı çizgi aracına tıklayın ve omuriliğe ortalanmış kısa bir çizgi çizin. Mikroskobu %100 yansıtıcı ayna konumuna getirin. ImageJ komut dosyasını yükleyin ve Tekrarlama'yı 2, Örnek'i 1, Genişlik'i 40 mikrona ve Zayıflamayı 89'a ayarlayın.Tüm parametreleri ayarladıktan sonra, Tamam düğmesine tıklayın. Lazer çekim sırası tamamlandığında, görüntüleme yazılımında floresan görüntülemeye geçin ve odağı ayarlayın. Yeni bir anlık görüntü alın ve kaydedin.Bu yeni görüntüyü ImageJ'de açın ve omuriliğin kendisinden daha büyük yeni bir çizgi çizin. Mikroskobu %100 yansıtıcı ayna konumuna getirin. ImageJ komut dosyası penceresine gidin ve Tekrarlama'yı 2, Örnek'i 1, Genişlik'i 40 mikrona ve Zayıflamayı 89'a ayarlayın.Tüm parametreleri ayarladıktan sonra, Tamam düğmesine tıklayın. Lazer atış sırası bittiğinde, floresan görüntüleme ve odaklama ile transeksiyon kalitesini doğrulayın. Lezyon bölgesinde hiçbir hücrenin veya aksonun bozulmadan kalmadığından emin olun.Ana VAST yazılım penceresine gidin ve lezyonlu larvaları boş 96 delikli plakaya toplamak için Topla düğmesine tıklayın. Ardından, VAST sistem ışığını tekrar açmak için onay kutusu tepsisi ışığını tıklayın. Larvaları 96 kuyucuklu plakadan mümkün olan en kısa sürede çıkarın ve larvaların lezyon sonrası iyileşmesi için tatlı balık suyu ile temiz bir Petri kabına aktarın.Petri kabını 28 santigrat derecede bir inkübatöre koyun. Asetillenmiş tübülin immüno-boyaması ve kalsiyum görüntüleme, lazer lezyonunun omurilik dokusunun devamlılığını tamamen bozduğunu göstermektedir. Bu resimde sağlam bir omurilik gösterilmiştir.Aksonların lezyonun kaudal ve rostral tarafları arasındaki tam bir bozulması, omuriliğin tam transeksiyonunu doğrular. Tamamlanmamış transeksiyonun bir örneği burada gösterilmiştir. NBTG cAMP 6-S larva üzerindeki transekte omurilik bu resimde gösterilmiştir.Dikdörtgenler, lezyonların rostral ve kaudal taraflarındaki floresan yoğunluğunu ölçmek için kullanılan ROI'leri göstermektedir. Grafik görüntü, rostral ve kaudal analiz ROI'lerinde zaman içinde floresan yoğunluğu değişimini temsil eder. Bir NBT:dsRed larvasının lazer lezyonundan önce, lazer lezyonundan üç saat, 24 saat ve 48 saat sonra maksimum yoğunluk projeksiyon floresan görüntüleri burada gösterilmiştir.Yaralanmadan 24 saat sonra, yaralar kapanmaya başladı ve 48 saat sonra omuriliğin ilk yapısının kısmen restorasyonuna yol açtı. Kalsiyum görüntüleme kullanılarak yaralanmadan 48 saat sonra kısmi fonksiyonel bir yeniden bağlantı doğrulandı. Kaudal bölgedeki sivri uçların genliği ile rostral alan arasındaki oran, yaralanma sonrası 3, 24 ve 48 saat arasında bir artış göstermiştir.NBT:dsRed mpeg1 GFP larva lazer lezyonları kullanılarak lazer lezyonlarından sonra makrofaj alımı gözlendi. Etiketli hücre sayısında manuel ve lazer lezyonları arasında fark gözlenmedi. Lezyonsuz balıklar, her iki lezyon koşulunda da lezyonlu balıklardan daha az çift etiketli hücre gösterdi.Lazer lezyonu manuel lezyona göre daha az kas ve deri hasarına neden olur. Lezyonun tam olup olmadığını doğrulamak çok önemlidir. Lezyon bölgesinde sağlam bir hücre veya yapı görünmemelidir, sadece loş bir arka plan görülmelidir.Omurilik rejenerasyonunu incelemek için, immüno-histokimya ve kalsiyum görüntüleme dahil olmak üzere birçok yöntem kullanıyoruz. Önemli olarak, manuel lezyonlu hayvanların aksine, doku diseksiyona dayanabileceğinden, elektrofizyoloji de yapabiliriz. Bu yeni teknik, tekrarlanabilir ve kontrollü lezyonlara izin vererek yaralanma sonrası omurilikteki yapısal ve fonksiyonel doku organizasyonunu nicel olarak incelememizi sağlar.

controlled-semi-automated-laser-induced-injuries-for-studying-spinal

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Burada, uzun vadeli görüntüleme, iki foton görüntüleme ve doku hasarı teknikleri ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme zebrafish embriyolar montaj için bir yöntem açıklanmaktadır.

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Burada sunulan yöntem, yüksek enerjili lazer darbeleri ve zamanla bu yaralanmalar ve kurtarma ileri analizi ile canlı zebrafish embriyo kesin hasar oluşur. Ayrıca genetik olarak tek etiketli veya iskelet kas hücre gruplarının sırasında ve lazer ışık kaynaklı hasar sonrası takip edilebilir göstermek.

Zebra balığı Embriyonik İskelet Kası Lazer-yaralama

Bu video, lazer yaralanması kullanılarak yetişkin zebra balıklarında retina dejenerasyonunu indüklemek için bir prosedürü göstermektedir. Lazer, retinadaki fotoreseptör hücrelerini hedef alarak hücre ölümünü ve dejeneratif bir süreci tetikler. Bu hasar, Müller glia (MG) hücrelerini aktive eder ve retinal rejenerasyona yardımcı olan kök hücre progenitörlerine farklılaşmalarına yol açar.

Zebra Balıklarında Retina Dejenerasyonu ve Rejenerasyonunun Fokal Lazer Yaralanması Kullanılarak Modellenmesi

Kaynak: Volpe, B. A.,  et al. Zebra Balığı İnternöromast Hücrelerinde Konfokal Mikroskop Tabanlı Lazer Ablasyon ve Rejenerasyon Testi. J. Vis. Uzm. {{TAG_ 31}} (2020) Bu video, konfokal mikroskopi kullanarak zebra balıklarında internöromast hücre iyileşmesinin izlenmesini, hızlandırılmış floresan görüntüleme yoluyla hücre ölümünü ve onarımını izlemeyi göstermektedir.

Konfokal mikroskopi kullanılarak zebra balıklarında lazerle ablasyonlu internöromast hücrelerinin iyileşmesinin izlenmesi

Periferal sinir sisteminin (PNS) yaralanmadan sonra önemli tamir yeteneğine sahip olmasına rağmen, küçük bu olgu yöneten hücresel ve moleküler mekanizmaları bilinmektedir. Canlı, transgenik zebrafish ve tekrarlanabilir bir sinir kesisi testi kullanarak, sinir dejenerasyonu ve rejenerasyonu sırasında dinamik glial hücre davranışlarını eğitim görebilirsiniz.

Motor Sinir transeksiyonu ve Canlı Zebra balığı Glial Hücre Davranışlarının Time-lapse Görüntüleme

Spinal Transeksiyon sonra, yetişkin zebrabalıkları altı hafta sonrası yaralanma ile fonksiyonel iyileşme var. Larva şeffaflık ve hızlı iyileşme yararlanmak için, larva omurilik transecting için bir yöntem mevcut. Transeksiyon sonra, 3 gün sonrası yaralanma ile 2 gün sonrası yaralanma başlayan duyusal iyileşme gözlemlemek, ve C-bend hareketi.

Larva Zebra balığı Omurilik Kesisi

Zebra balığı yetişkin nörogenezi ve rejenerasyonunun hücresel ve moleküler mekanizmalarına ışık tutmak için, zebra balığı yetişkin telensefalonunda mekanik yaralanmalara neden olan invaziv cerrahi ve ardından bıçaklanmış hemisferdeki değişikliklerin immünohistokimya veya in situ hibridizasyon ile izlenmesi için bir protokol geliştirdik.

Zebra balığı Yetişkin telencephalon stab Yara Yaralanma: Omurgalı Beyin nöron ve Rejenerasyon Soruşturma Bir Yöntem

Tek tek hücrelerde yönlendirilmiş strese veya ölüme neden olacak hedefli manipülasyonların gerçekleştirilmesi nispeten zor olmuştur. Burada, hücre kültüründe ve canlı hayvanlarda tek tek hücreleri seçici olarak strese sokmak ve öldürmek için tek hücre çözünürlüklü bir ablasyon yaklaşımı, standart bir konfokal UV lazere dayalı olarak açıklanmaktadır.

Konvansiyonel UV Lazer konfokal mikroskopi kullanılarak Tetikleme Hücre Stres ve Ölüm

Zebra balığı retina dejenerasyonu/rejenerasyon omurgalılarda mekanizmaları incelemek için popüler bir hayvan modelidir. Bu iletişim kuralı yerelleştirilmiş yaralanma dış retina iç retina en az hasar ile kesintiye neden yöntemi açıklanır. Daha sonra in vivo retina morfoloji ve Müller glia yanıt retina yeniden oluşturma işlemi boyunca izliyoruz.

Bir lazer kaynaklı retina dejenerasyonu, Zebra balığı rejenerasyon modelini Müller Glia hücre aktivasyonu

Lazer ablasyon biyolojik sistemlerde rejenerasyon eğitimi için yaygın olarak uygulanan bir teknolojidir. Sunulan protokol, lazer ablasyon için standart bir lazer tarama konfokal mikroskobu ve zebrabalığı lateral hattında ki internöromast hücrelerinin yenilenmesinin daha sonra zaman atlamalı görüntülemesini açıklar.

Zebrabalığı İnternöromast Hücrelerinde Konfokal Mikroskop Tabanlı Lazer Ablasyon ve Rejenerasyon Tonu

Bu protokol, zebra balığı larvalarında gerçekleştirilen ve kemik rejenerasyonunu ve ablasyona karşı bağışıklık tepkisinin etkilerini incelemek için bir model görevi gören iki fotonlu bir lazer ablasyon yaklaşımını tanımlar.

Gelişmekte Olan Zebra Balığı Larvalarında Osteoblastların İki Foton Lazer Aracılı Ablasyonu

Öğrenin, Danio rerio larvalarında omurilik rejenerasyonunu incelemek için yarı otomatik lazer yaralanma yöntemini. Bu teknik, çevre dokulara zarar vermeden tekrarlanabilir yaralanmalar sağlar.

Zebra Balığı Larvalarında Omurilik Rejenerasyonunu İncelemek için Kontrollü Yarı Otomatik Lazer Kaynaklı Yaralanmalar

Daha fazla video keşfet