Name: Endojen Drosophila Geçici Reseptör Potansiyel Kanallarının Saflaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Öğrenin Drosophila TRP kanallarının saflaştırma yöntemini elektrofizyolojik özellikleri incelemek için. Bu protokol INAD protein kompleksi kullanarak uçur başlarından tam uzunlukta kanal izolasyonu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 31870746), Shenzhen Temel Araştırma Hibeleri (JCYJ20200109140414636) ve Guangdong Eyaleti, Çin Doğa Bilimleri Vakfı (No. 2021A1515010796) tarafından W. L. L. tarafından desteklenmiştir. LetPub'a (www.letpub.com) bu makalenin hazırlanması sırasındaki dilbilimsel yardımları için teşekkür ederiz.

1. GST etiketli TRP ve Onun etiketli NORPA parçalarının saflaştırılması
<ol><li>GST etiketli TRP 1261-1275 parçasını saflaştır<ol>
<li>CaCl 2 ısı şoku dönüşüm yöntemi 21'i kullanarak pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 plazmid10'u Escherichia coli (E. coli)BL21 (DE3) hücrelerine dönüştürün. Tek bir koloniye 10 mL Luria Bertani (LB) ortamında aşılayın ve 37 ° C'de gece boyunca büyüyün. Daha sonra, 10 mL tohumlama kültürünü 37 ° C'de 1 L LB ortamında yükseltin.</li>
		<li>Hücrelerin optik yoğunluğu (OD600) 0.5'e ulaştıktan sonra, hücreleri 16 ° C'ye soğutun ve hedef proteinin aşırı ekspresyonunu indüklemek ve 18 saat boyunca 16 ° C'de inkübe etmek için 0.1 mM izopropil β-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG; son konsantrasyon) ekleyin.</li>
		<li>Aşırı ekspresyondan sonra, 3.993 × g'de santrifüjleme ile 1 L kültürlenmiş hücreyi 20 dakika boyunca pelet ve 40 mL fosfat tamponlu salin (PBS) tamponunda yeniden askıya alır.</li>
		<li>Yeniden askıya alınan hücreleri, 4 °C'de önceden soğutulmuş yüksek basınçlı bir homojenizatöre yükleyin. Homojenizatör basıncını yavaşça 800 bar'a yükseltin. Giriş musluğunu açın ve yeniden askıya alınan hücrelerin dairesel olarak çok dar yarıklara sahip bir valften geçmesine izin verin. NOT: Hücreler, büyük bir basınç düşüşü ve kavitasyonun neden olduğu yüksek kesme kuvvetleri ile homojenize edilir.</li>
		<li>Bir yerçekimi akış kolonuna 5 mL glutatyon boncuk yükleyin ve boncukları toplam üç kez 50 mL PBS tamponu ile yıkayın.</li>
		<li>Hücre lizatını yüksek basınçlı homojenizatörden 48.384 x g'de santrifüj yapın. Santrifüjlü hücre lizatının (40 mL) süpernatantını, yerçekimi akış sütunundaki dengelenmiş glutatyon boncuklarına ekleyin ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Glutatyon boncuklarını her 10 dakikada bir yeniden askıya alın.</li>
		<li>30 dakikalık inkübasyondan sonra, boncukları ve akış fraksiyonunu ayırmak için sütun çıkış musluğunu açın. Akış kesirini atın. Kalan glutatyon boncuklarını 50 mL PBS tamponu ile iki kez durulayın.</li>
		<li>Glutatyon boncuklarına 15 mL elüsyon tamponu ekleyin ve 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Boncukları her 10 dakikada bir yeniden askıya alın.</li>
		<li>30 dakikalık inkübasyondan sonra, GST etiketli TRP 1261-1275 parçasını 50 mL'lik bir konik tüp içinde boşaltın ve 50 mM Tris (pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) tamponu kullanılarak dengelenen bir boyut hariç tutma sütununa (hazırlama sınıfı) yükleyin.</li>
		<li>Boyut hariç tutma sütununun elüsyon akış hızını 3 mL/dk'da tutun. Salınan proteinleri 5 mL/tüp oranında toplayın.</li>
		<li>UV absorpsiyon sinyallerini 280 nm'de analiz ederek boyut dışlama sütunundaki hedef proteinin zirvesini tanımlayın ve SDS-PAGE jel analizi ile doğrulayın (elektroforez parametreleri: istifleme jeli için 150 V; çözme jeli için 200 V). Jeli Coomassie mavisi R250 ile sabitleyin.</li>
		<li>Saflaştırılmış GST etiketli TRP 1261-1275 parçasını, masa üstü soğutulmuş bir santrifüjde 4 °C'de 3.000 x g'de santrifüj edilmiş 15 mL ultrafiltrasyon spin sütunu kullanarak boyut hariç tutma sütunundan 1 mL'ye yoğunlaştırın.</li>
		<li>Bira-Lambert Yasasını kullanarak konsantre protein konsantrasyonunu belirleyin. GST etiketli TRP 1261-1275 parçasının UV emilimini bir spektrofotometre kullanarak 280 nm'de ölçün.</li>
		<li>Protein dizilerini Protparam programına (https://web.expasy.org/protparam/) aktararak 280 nm'de yok olma katsayısını elde edin. Tipik olarak, GST etiketli TRP 1261-1275'in 1 L kültürü, 1 mL 600 μM protein (6 x 10-7 mol) verir. Gerekli malzemeler için Tablo 1'e bakınız.</li>
	</ol></li>
	<li>Onun etiketli NORPA 863-1095 parçasının saflaştırılması<ol>
<li>CaCl 2 ısı şoku dönüşüm yöntemi 21'i kullanarak pETM.3C NORPA 863-1095 plazmid20'yi E. coli BL21 (DE3) hücrelerine dönüştürün. Tek bir koloniyi 10 mL LB ortamında aşılayın ve 37 ° C'de gece boyunca büyüyün. Daha sonra, 10 mL tohumlama kültürünü 37 ° C'de 1 L LB ortamında yükseltin.</li>
		<li>Hücrelerin OD600'ü 0.5'e ulaştıktan sonra, hücreleri 16 ° C'ye soğutun ve hedef proteinin aşırı ekspresyonunu indüklemek ve 18 saat boyunca 16 ° C'de inkübe etmek için 0.1 mM IPTG (son konsantrasyon) ekleyin.</li>
		<li>Aşırı ekspresyondan sonra, 20 dakika boyunca 3.993 x g'de santrifüjleme ile 1 L kültürlenmiş hücreyi toplayın ve 40 mL bağlanma tamponunda yeniden askıya alın. Daha sonra, yeniden askıya alınmış hücreleri, adım 1.1.4'te açıklandığı gibi 4 ° C'de yüksek basınçlı bir homojenizatörde lize edin.</li>
		<li>Bir yerçekimi akış kolonuna 5 mL Ni-boncuk yükleyin ve 50 mL bağlayıcı tamponla üç kez yıkayın.</li>
		<li>Hücre lizatını yüksek basınçlı homojenizatörden 48.384 x g'de santrifüj yapın. Santrifüjlü hücre lizatının süpernatantını, yerçekimi akış sütunundaki dengelenmiş Ni-boncuklarına ekleyin ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Ni-boncukları her 10 dakikada bir yeniden askıya alın.</li>
		<li>30 dakikalık inkübasyondan sonra, boncukları ve akış fraksiyonunu ayırmak için sütun çıkış musluğunu açın. Akış fraksiyonunu atın ve kalan Ni-boncukları 50 mL yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.</li>
		<li>Ni-boncuklara 15 mL elüsyon tamponu ekleyin ve 30 dakika kuluçkaya yatırın. Ni-boncukları her 10 dakikada bir yeniden askıya alın.</li>
		<li>30 dakikalık inkübasyondan sonra, salınımlı His-etiketli NORPA 863-1095 parçasını 50 mL'lik bir konik tüpte toplayın ve 50 mM Tris (pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) kullanılarak dengelenen bir boyut hariç tutma sütununa (hazırlama sınıfı) yükleyin.</li>
		<li>Boyut hariç tutma sütununun elüsyon akış hızını 3 mL/dk'da tutun. Salınan proteini 5 mL / tüp oranında toplayın.</li>
		<li>UV absorpsiyon sinyallerini 280 nm'de analiz ederek boyut dışlama sütunundaki hedef proteinin zirvesini tanımlayın ve SDS-PAGE jel analizi ile doğrulayın (elektroforez parametreleri: istifleme jeli için 150 V; çözme jeli için 200 V). Coomassie mavi R250 kullanarak jeli lekeleyin.</li>
		<li>Saflaştırılmış His etiketli NORPA 863-1095 parçasını, masa üstü soğutulmuş bir santrifüjde 4 °C'de 3.000 x g'de santrifüj edilmiş 15 mL ultrafiltrasyon spin sütunu kullanarak boyut hariç tutma sütunundan 1 mL'ye konsantre edin.</li>
		<li>Bira-Lambert Yasasını kullanarak konsantre protein konsantrasyonunu belirleyin. Bir spektrofotometre kullanarak His-etiketli NORPA 863-1095 parçasının UV emilimini 280 nm'de ölçün.</li>
		<li>Protein dizilerini Protparam programına (https://web.expasy.org/protparam/) aktararak 280 nm'de yok olma katsayısını elde edin. Tipik olarak, His-etiketli NORPA 863-1095 fragmanının 1 L kültürü, 1 mL 600 μM protein (6 x 10-7 mol) verir. Gerekli malzemeler için Tablo 2'ye bakınız.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Drosophila kafalarının hazırlanması
<ol><li>CO 2 anestezi yöntemi22,23'ü kullanarak yetişkin sinekleri 50 mL konik santrifüjleme tüplerinde toplayın; hemen sıvı azotta 10 dakika dondurun ve -80 ° C'lik bir dondurucuda saklayın.</li>
	<li>Yeterli sayıda sinek topladıktan sonra, sineklerin bacaklarını, kafalarını, kanatlarını ve vücutlarını ayırmak için donmuş 50 mL konik tüpleri elle kuvvetlice sallayın. Karışımı sıralı olarak istiflenmiş üç adet önceden soğutulmuş paslanmaz çelik eleğe (sırasıyla 20/30/40 ağ boyutu) aktarın ve elekleri sallayın.</li>
	<li>Daha sonra, kafalar 40 örgülü elek içinden geçemediğinden, sinek kafalarını 40 örgülü elek dışına süpürmek, 50 mL konik tüplere aktarmak ve -80 ° C'de saklamak için bir fırça kullanın.</li>
	<li>Sinekleri ve kafalarını sürekli olarak toplayın ve deney için gerekli miktara (0,5 g) ulaşana kadar -80 ° C'lik bir dondurucuda saklayın. Tipik olarak, 0.5 g kafa toplamak için, 50 mL'lik bir konik tüpte 35 mL sinek gerekir. Gerekli malzemeler için Tablo 3'e bakınız.</li>
</ol>3. Drosophila TRP kanal saflaştırma
<ol><li>Toplam 0,5 g kafa tartın ve önceden soğutulmuş bir harç havanesi kullanarak sıvı azotta tamamen homojenize edin. Homojenize edilmiş kafaları 10x v/w lizis tamponunda (5 mL) çözün, 20 dakika boyunca 4 °C'de bir çalkalayıcıda inkübe edin ve ardından 4 °C'de 20 dakika boyunca 20.817 x g'de santrifüj yapın.</li>
	<li>Spin-down süpernatantını ("20817 g S", Şekil 4) toplayın ve 4 ° C'de 60 dakika boyunca 100.000 x g'de santrifüj yapın. Aşağıdaki aşağı çekme testi için spin-down süpernatantını ("100.000 g S", Şekil 4) kullanın.</li>
	<li>Yerçekimi akış sütununa 1 mL Ni-boncuk ekleyin ve boncukları 4 ° C'de 10 mL çift damıtılmış H2O (ddH2O) ile toplam üç kez yıkayın. Boncukları, 4 ° C'de üç kez 10 sütun hacimli lizis tamponu ile dengeleyin.</li>
	<li>Ni-kolonuna 500 μL 600 μM saflaştırılmış His-etiketli NORPA 863-1095 proteini (3 x 10-7 mol) ekleyin ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Boncukları her 10 dakikada bir yeniden askıya alın.</li>
	<li>Boncukları ve akış fraksiyonunu ayırmak için sütun çıkış musluğunu açın. SDS-PAGE analizi için akış kesirini alın (NORPA F, Şekil 4). Bu bölümde, yem proteinleri Ni-boncuklar üzerinde hareketsiz hale getirilir.</li>
	<li>Ni-boncukları 4 °C'de 10 kolon hacimli lizis tamponu (10 mL) ile yıkayın ve SDS-PAGE analizi için yıkama fraksiyonunu saklayın (Yıkama 1, Şekil 4A). Yukarıdaki adımları tekrarlayın ve SDS-PAGE analizi için numuneyi saklayın (Yıkama 2, Şekil 4A). Bu bölümde, Ni-boncuklar üzerindeki aşırı yem proteinleri uzaklaştırılır.</li>
	<li>100.000 x g santrifüjlemeden sonra Drosophila kafa homojenatının süpernatantını, 4 ° C'de Ni-sütununa ekleyin, burada His etiketli NORPA 863-1095 parçası hareketsiz hale getirilmiştir.</li>
	<li>Süpernatantı Ni-boncuklarla 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Boncukları her 10 dakikada bir yeniden askıya alın. Ardından, boncukları ve akış fraksiyonunu ayırmak için sütun çıkış musluğunu açın.</li>
	<li>SDS-PAGE analizi için süpernatantı toplayın (Dro kafa lizisi F, Şekil 4A). Bu bölümde, kafa homojenatlarındaki INAD protein kompleksleri (INAD / TRP / ePKC), Ni-boncuklar üzerindeki hareketsiz NORPA 863-1095 parçaları tarafından yakalanır.</li>
	<li>Ni-boncukları 4 °C'de 10 sütun hacimli lizis tamponu (10 mL) ile yıkayın ve SDS-PAGE analizi için süpernatantı yerçekimi çökelmesinden uzak tutun (Yıkama 3, Şekil 4A). Yukarıdaki adımları tekrarlayın ve SDS-PAGE analizi için süpernatantı toplayın (Yıkama 4, Şekil 4A). Bu bölümde, Ni-boncuklar üzerindeki bağlanmamış proteinler uzaklaştırılır.</li>
	<li>Ni-boncuklara 500 μL 600 μM GST etiketli TRP 1261-1275 protein (3 x 10-7 mol) ekleyin ve 4 ° C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın. Boncukları her 10 dakikada bir yeniden askıya alın.</li>
	<li>Endojen Drosophila TRP kanalını içeren yerçekimi sütunundan (TRP E1, Şekil 4B) salınan fraksiyonu toplayın. Yukarıdaki adımları tekrarlayın ve elüsyon fraksiyonunu toplayın (TRP E2, Şekil 4B). Bu adımda, GST etiketli TRP 1261-1275 parçalarını rakip olarak kullanarak, TRP kanalları Ni-boncuklar üzerindeki yakalanan INAD protein komplekslerinden (INAD / TRP / ePKC) salınır.</li>
	<li>Ni-boncukları 10 sütun hacimli bağlayıcı tamponla (10 mL; Tablo 1) 4 °C'de ve SDS-PAGE analizi için yıkama fraksiyonunu toplayın (Yıkama 5, Şekil 4B).</li>
	<li>Ni-boncuklara 500 μL elüsyon tamponu (Tablo 1) ekleyin ve 4 ° C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın. Yerçekimi akış kolonundan elüsyon fraksiyonunu toplayın (NORPA E1, Şekil 4B). Yukarıdaki adımları tekrarlayın ve elüsyon fraksiyonunu toplayın (NORPA E2, Şekil 4B).</li>
	<li>Elüsyon tamponunu kullanarak, INAD / ePKC protein kompleksleri ile birlikte His-etiketli NORPA 863-1095 fragmanını etkisiz hale getirin. Ardından, Ni-boncukları 500 μL bağlayıcı tamponda yeniden askıya alın.</li>
	<li>Elüsyonun verimliliğini analiz etmek ve elute tamponun çalışıp çalışmadığını değerlendirmek için SDS-PAGE'i (Coomassie mavisi R250 ile boyanmış) çalıştırmak için yeniden askıya alınmış Ni-boncukları alın (boncuklar, Şekil 4B). Gerekli malzemeler için Tablo 4'e bakınız.</li>
</ol>4. Drosophila TRP kanalının boyut hariç tutma kolon saflaştırılması
<ol><li>Protein saflaştırma sistemine bir boyut hariç tutma sütunu (analitik sınıf) takın. Kolonu 0,45 μm filtre ile filtrelenen sütun tamponu (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,75 mM DDM) ile dengeleyin.</li>
	<li>TRP E1 ve E2 fraksiyonunu 3.14. adımdan itibaren, soğutulmuş bir santrifüjde 4 °C'de 3.000 x g'de santrifüjlenmiş 4 mL ultrafiltrasyon spin sütunu kullanarak konsantre edin.</li>
	<li>Numune döngüsünü kolon tamponuyla durulayın ve numuneyi numune döngüsüne yükleyin. Numuneyi boyut hariç tutma kolonuna enjekte edin ve proteinleri uygun bir akış hızıyla (0,5 mL / dak) süzün.</li>
	<li>Hedef proteinin zirvesini 280 nm'de absorpsiyonla tanımlayın ve saflaştırılmış endojen Drosophila TRP kanalını tespit etmek için bir SDS-PAGE jeli çalıştırın (Şekil 5). Gerekli malzemeler için Tablo 5'e bakınız.</li>
</ol>

<ol><li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).</li>
<li>Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyunsaturated+fatty+acids+activate+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL.</a> Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).</li>
<li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photomechanical+responses+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+binds+to+Drosophila+TRP+with+an+unexpected+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode.</a> Structure. 29 (4), 330-344 (2021).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+intracellular+Ca2%2B+chelation+on+the+light+response+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+A%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).</li>
<li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li>
<li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide-mediated+phototransduction+in+Drosophila+photoreceptors%3A+the+role+of+Ca2%2B+and+trp%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp.</a> Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).</li>
<li>Delgado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+opening+of+the+TRP+channel+in+isolated+membrane+patches+excised+from+photosensitive+microvilli+from+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors.</a> Neuroscience. 396, 66-72 (2019).</li>
<li>Lev, S., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activity+of+the+TRP-like+channel+depends+on+its+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">The activity of the TRP-like channel depends on its expression system.</a> Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).</li>
<li>Hardie, R. C., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+heterologously+expressed+Drosophila+TRPL+channels%3A+Ca2%2B+is+not+required+and+InsP3+is+not+sufficient%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient.</a> Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).</li>
<li>Gutorov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+transient+receptor+potential+C+channel+activity+by+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 1487(2019).</li>
<li>Yagodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thapsigargin+and+receptor-mediated+activation+of+Drosophila+TRPL+channels+stably+expressed+in+a+Drosophila+S2+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line.</a> Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).</li>
<li>Guo, W., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+structural+studies+on+canonical+TRP+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels.</a> Cell Calcium. 83, 102075(2019).</li>
<li>Li, X., Fine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRP+channel%3A+The+structural+era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">TRP channel: The structural era.</a> Cell Calcium. 87, 102191(2020).</li>
<li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li>
<li>Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+distinct+conformations+reveal+activation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms.</a> Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+INAD+scaffold+is+a+dynamic%2C+redox-regulated+modulator+of+signaling+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye.</a> Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).</li>
<li>Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+exquisitely+specific+PDZ%2Ftarget+recognition+revealed+by+the+structure+of+INAD+PDZ3+in+complex+with+TRP+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel.</a> Structure. 24 (3), 383-391 (2016).</li>
<li>Ye, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpected+INAD+PDZ+tandem-mediated+plc%CE%B2+binding+in+Drosophila+photo+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+heat+shock+step+on+bacterial+transformation+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency.</a> Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+laboratory+handbook.+Second+Edition%22">Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition</a>. 80 (2), The Quarterly Review of Biology. (2005).</li>
<li>Nicolas, G., Sillans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+and+latent+effects+of+carbon+dioxide+on+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).</li>
<li>Arachea, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+selection+for+enhanced+extraction+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins.</a> Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).</li>
<li>Hellmich, U. A., Gaudet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+TRP+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Structural biology of TRP channels.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Beş PDZ alanı içeren INAD, Drosophila fototransdüksiyon makinelerinin temel organizatörüdür. Önceki çalışmalar, INAD PDZ3'ün TRP kanalı C-terminal kuyruğuna zarif bir özgüllükle bağlandığını göstermiştir (KD = 0.3 μM)18. INAD PDZ45 tandem, NORPA 863-1095 fragmanı ile son derece yüksek bir bağlanma afinitesi ile etkileşime girer (KD = 30 nM). Bu bulgular, NORPA CC-PBM parçasının aşağı çekme yemi olarak kullanılmasını sağlayan afinite saflaştırma artı rekabet stratejis...

Fototransdüksiyon, emilen fotonların nöronların elektriksel kodlarına dönüştürüldüğü bir süreçtir. Sadece opsinleri ve aşağıdaki G proteinine bağlı sinyal kaskadını hem omurgalılarda hem de omurgasızlarda iletir. Drosophila'da, beş PDZ alanını kullanarak, iskele proteini inaktivasyonu-sonrası-sonrası-potansiyel D (INAD), geçici bir reseptör potansiyeli (TRP) kanalı, fosfolipaz Cβ / No reseptör potansiyeli A (PLCβ / NORPA) ve göze özgü protein kinaz C (ePKC) 1'den oluşan bir supramoleküler sinyal kompleksi düzenler. Bu supramoleküler sinyal kompleksinin oluşumu, Drosophila fototransdüksiyon makinelerinin doğru hücre altı lokalizasyonunu, yüksek verimliliğini ve özgüllüğünü garanti eder. Bu komplekste, ışığa duyarlı TRP kanalları, NORPA'nın aşağı akış efektörleri olarak işlev görür ve kalsiyum akışına ve fotoreseptörlerin depolarizasyonuna aracılık eder. Önceki çalışmalar, Drosophila TRP kanalının açılmasına protonlar, yerel lipit ortamının bozulması veya mekanik kuvvet 2,3,4 aracılık ettiğini göstermiştir. Drosophila TRP kanalı ayrıca kalmodulin5 ile etkileşime girer ve kalsiyum tarafından hem pozitif hem de negatif geri besleme 6,7,8 ile modüle edilir.
Şimdiye kadar, Drosophila TRP ve TRP benzeri (TRPL) kanalların geçit mekanizması üzerine yapılan elektrofizyoloji çalışmaları, eksize edilmiş membran yamalarına, ayrışmış vahşi tip Drosophila fotoreseptörlerinden tüm hücre kayıtlarına ve S2, SF9 veya HEK hücrelerindehetero-eksprese kanallara dayanıyordu. Tam uzunluktaki Drosophila TRP kanalının yapısal bilgileri de belirsizliğini koruyor. Saflaştırılmış proteinin elektrofizyolojik özelliklerini yeniden yapılandırılmış bir membran ortamında incelemek ve tam uzunluktaki Drosophila TRP kanalının yapısal bilgisini elde etmek için, saflaştırılmış tam uzunlukta TRP kanallarının elde edilmesi, memeli TRP kanalı çalışmalarında kullanılan metodolojilere benzer şekilde gerekli ilk adımdır14,15,16,17.
Son zamanlarda, INAD protein kompleksi18,19,20'nin montaj mekanizmasına dayanarak, TRP kanalını streptavidin boncukları5 ile Drosophila kafa homojenatlarından arındırmak için bir afinite saflaştırma artı rekabet stratejisi geliştirilmiştir. Streptavidin boncuklarının düşük kapasitesi ve pahalı maliyeti göz önüne alındığında, burada His-etiketli yem proteinini ve buna karşılık gelen düşük maliyetli Ni-boncukları çok daha yüksek kapasiteye sahip kullanan gelişmiş bir saflaştırma protokolü tanıtılmıştır. Önerilen yöntem, TRP kanalının geçit mekanizmasını yapısal açılardan incelemeye ve TRP kanalının elektrofizyolojik özelliklerini saflaştırılmış proteinlerle ölçmeye yardımcı olacaktır.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Bakteri suşları</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Yetkin Hücreler</td><td>Novagen</td><td>69450</td><td>Protein aşırı ekspresyonu</td></tr><tr><td><güçlü>Deney modelleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D.melanogaster: W1118 suşu</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>BDSC:3605</td><td>Drosophila kafa hazırlığı</td></tr><tr><td>< güçlü > Malzeme< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>20/30/40 örgü paslanmaz çelik elekler</td><td>Jiufeng metal örgü şirketi</td><td>GB / T6003.1</td> <td> Drosophila kafa hazırlığı</td></tr><tr><td>% 30 Akrilamid-N, N ve asal;-Metilenbisakrilamid (29: 1)</td> <td>Lablead</td><td>A3291</td><td>SDS-PAGE jel hazırlama</td></tr><tr><td>Amonyum Persülfat</td><td>Invitrogen</td><td>HC2005</td><td>SDS-PAGE jel hazırlama</td></tr><tr><td>Kokteyl proteaz inhibitörü</td><td>Roche</td><td>05892953001</td><td>Proteaz inhibitörü</td></tr><tr><td>Coomassie parlak mavi R-250</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100472-0025</td><td>SDS-PAGE jel boyama</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A620058-0100</td><td>Boyut dışlama sütunu tampon hazırlama</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu (EDTA)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500838-0500</td><td>Boyut dışlama sütunu tampon hazırlama</td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610235-0005</td><td>SDS-PAGE tampon hazırlama</td></tr><tr><td>Glutatyon Sefaroz 4 Hızlı Akışlı boncuklar</td><td>Cytiva</td><td>17513202</td><td>Afinite kromatografisi</td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500529-0001</td><td>Elüsyon tamponu Ni sütunu</td></tr><tr><td>İzopropil-beta-D-tiyokalaktopiranosit (IPTG)</td> için hazırlık <td>Sangon Biotech</td><td>A600168-0025</td><td>Protein aşırı ekspresyonunun indüksiyonu</td></tr><tr><td>LB Suyu Tozu</td><td>Sangon Biotech</td><td>A507002-0250<</td><td>em>E.coli. hücre kültürü</td></tr><tr><td>L-Glutatyon indirgenmiş (GSH)</td> <td>Sigma-aldrich</td><td>G4251-100G</td><td>Glutatyon boncukları</td></tr> <tr><td>için elüsyon tamponu hazırlığıNi-Sefaroz excel boncukları</td><td>Cytiva</td><td>17371202</td><td>Afinite kromatografisi</td></tr><tr><td>N-Dodesil beta-D-maltosit (DDM)</td> <td>Sangon Biotech</td><td>A610424-001</td><td>Protein saflaştırması için deterjan</td></tr><tr><td>N, N, N ', N'-Tetrametiletilendiamin (TEMED)</td> <td>Sigma-aldrich</td><td>T9281-100ML</td><td>SDS-PAGE jel hazırlama</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607008-0500</td><td>E.coli. hücresi için homojenizasyon tamponu</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Lablead</td><td>P0754-25G</td><td>Proteaz inhibitörü</td></tr><tr><td>Önceden boyanmış protein işaretleyici</td><td>Thermo Scientific</td><td>26619/26616</td><td>Önceden boyanmış protein merdiveni</td></tr><tr><td>Boyut dışlama sütunu (hazırlık sınıfı)</td><td>Cytiva</td><td>28989336</td><td>HiLoad 26/60 Superdex 200 PG sütunu</td></tr><tr><td>Boyut dışlama sütunu (analitik sınıf)</td><td>Cytiva</td><td>29091596</td><td>Superose 6 10/300 GL sütununu artırın</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501218-0001</td><td>Protein saflaştırma tamponu hazırlığı</td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat (SDS)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500228-0001</td><td>SDS-PAGE jel/tampon hazırlama</td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T1503-10KG</td><td>Protein saflaştırma tamponu hazırlama</td></tr><tr><td>Ultrafiltrasyon dönüşü sütun</td><td>Millipore</td><td>UFC901096/801096</td><td>Protein konsantrasyonu</td></tr><tr><td><güçlü>Ekipman</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analitik Terazi</td><td>DENVER</td><td>APX-60</td><td>Drosophila Metagesi kafa</td></tr><tr><td>15 mL ve 50 mL konik santrifüj tüpleri için masa üstü yüksek hızlı soğutmalı santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Protein konsantrasyonu</td></tr><tr><td>Masa üstü yüksek hızlı soğutmalı santrifüj 1.5 mL santrifüj tüpleri</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Homojenizasyondan sonra Drosophila kafa lizatının santrifüjlenmesi</td></tr><tr><td>Boş yerçekimi akış sütunu (İç Çap = 1.0cm)</td> <td>Bio-Rad</td><td>738-0015</td><td>TRP protein saflaştırması</td></tr><tr><td>Boş yerçekimi akış sütunu (İç Çap = 2,5 cm)</td> <td>Bio-Rad</td><td>738-0017</td><td>E.coli.Gel Dokümantasyon Sisteminden yem ve rakip protein saflaştırması</td></tr> <tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>Universal Hood II Jel Doc XR Sistemi</td><td>SDS-PAGE görüntüleme</td></tr><tr><td>Yüksek hızlı soğutmalı santrifüj</td><td>Beckman coulter</td><td>Avanti J-26 XP</td><td>E.coli. hücrelerinin/hücre lizatının santrifüjlenmesi</td></tr><tr><td>Yüksek basınçlı homojenizatör</td><td>UNION-BIOTECH</td><td>UH-05</td><td>E.coli. hücrelerinin homojenizasyonu</td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen tankı</td><td>Taylor-Wharton</td><td>CX-100</td><td>Drosophila kafa hazırlığı</td></tr><tr><td>Protein arıtma sistemi</td><td>Cytiva</td><td>AKTA temizleyici</td><td>Protein arıtma</td></tr><tr><td>Buzdolabı (-80 derece; C)</td> <td>Thermo</td><td>900GP</td><<td>em > Drosophila kafa hazırlığı</td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>MAPADA</td><td>UV-1200</td><td>OD600 E.coli. hücrelerinin ölçümü</td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000c</td><td>Protein konsantrasyonunun belirlenmesi</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td>Beckman sürgü</td><td>makinesi Optima XPN-100 Ultrasantrifüj</td><td>Ultrasantrifüj</td></tr></tbody></table>

endojen drosophila geçici reseptör potansiyel kanallarının saflaştırılması

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Drosophila fototransdüksiyonu, bilinen en hızlı G proteinine bağlı sinyal yollarından biridir. Bu kaskadının özgüllüğünü ve verimliliğini sağlamak için, kalsiyum (Ca2+)-geçirgen katyon kanalı, geçici reseptör potansiyeli (TRP), iskele proteinine sıkıca bağlanır, inaktivasyon-sonrası-potansiyel D (INAD) ve göze özgü protein kinaz C (ePKC) ve fosfolipaz Cβ / No reseptör potansiyeli A (PLCβ / NORPA) ile büyük bir sinyal protein kompleksi oluşturur. Bununla birlikte, Drosophila TRP kanalının biyokimyasal özellikleri belirsizliğini korumaktadır. INAD protein kompleksinin montaj mekanizmasına dayanarak, endojen TRP kanalını saflaştırmak için modifiye edilmiş bir afinite saflaştırma artı rekabet stratejisi geliştirilmiştir. İlk olarak, saflaştırılmış histidin (His) etiketli NORPA 863-1095 fragmanı Ni-boncuklara bağlandı ve endojen INAD protein kompleksini Drosophila kafa homojenatlarından aşağı çekmek için yem olarak kullanıldı. Daha sonra, TRP kanalı ile rekabet etmek için Ni-boncuklara aşırı saflaştırılmış glutatyon S-transferaz (GST) etiketli TRP 1261-1275 parçası eklendi. Son olarak, süpernatanttaki TRP kanalı, boyut dışlama kromatografisi ile aşırı TRP 1261-1275 peptidinden ayrıldı. Bu yöntem, Drosophila TRP kanalının geçit mekanizmasını hem biyokimyasal hem de yapısal açılardan incelemeyi mümkün kılar. Saflaştırılmış Drosophila TRP kanallarının elektrofizyoloji özellikleri gelecekte de ölçülebilir.

Bu makalede, endojen Drosophila TRP kanalını saflaştırmak için bir protein saflaştırma yöntemi gösterilmiştir (Şekil 1).
İlk olarak, yem ve rakip proteinleri elde etmek için rekombinant protein ekspresyonu ve saflaştırma uygulanır. Daha sonra, GST etiketli bir TRP 1261-1275 fragmanı, LB ortamındaki E. coli BL21 (DE3) hücrelerinde eksprese edilir ve glutatyon boncukları ve bir boyut hariç tutma sütunu kullanılarak saflaştırılır (<strong class="xfi...

INAD protein kompleksinin montaj mekanizmasına dayanarak, bu protokolde, endojen Drosophila TRP kanalını saflaştırmak için modifiye edilmiş bir afinite saflaştırma artı rekabet stratejisi geliştirilmiştir.

Endojen Drosophila Geçici Reseptör Potansiyel Kanallarının Saflaştırılması

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

Bu protokolde, elektrofizyolojik özellikleri incelemek için gerekli ilk adım olan saflaştırılmış, tam uzunlukta TRP kanalları elde etmek ve tam uzunluktaki Drosophila TRP kanalının yapısal bilgilerini elde etmek için saflaştırma işlemini gösteriyoruz. INAD protein kompleksinin örnekleme mekanizmasına dayanarak ve çok daha yüksek kapasiteye sahip düşük maliyetli nikel boncuklar kullanılarak, sinek kafalarından yeterli miktarda TRP kanalı saflaştırılabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Yuyang Liu olacak.Başlamak için, kalsiyum klorür ısı şoku dönüşüm yöntemini kullanarak pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 plazmidini E.coli BL21 hücrelerine dönüştürün. Tek bir koloniye 10 mililitre Luria Bertani ortamında aşılayın ve gece boyunca 37 santigrat derecede büyüyün. 10 mililitre tohumlama kültürünü bir litre Luria Bertani ortamına ekleyin ve 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Hücrelerin optik yoğunluğu 0.5'e ulaştıktan sonra, hücreleri 16 santigrat dereceye kadar soğutun ve 0.1 milimolar izopropil-beta-D-1-tiyogalaktopiranosid ekleyin. Aşırı ekspresyondan sonra, santrifüjleme yoluyla bir litre kültürlenmiş hücreyi toplayın ve 40 mililitre fosfat tamponlu salin içinde yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan hücreleri, dört santigrat dereceye kadar önceden soğutulmuş yüksek basınçlı homojenizatöre yükleyin.Homojenizatör basıncını yavaşça 800 bar'a yükseltin. Giriş tırnağını açın ve yeniden askıya alınan hücrelerin dar yarıklı bir valften dairesel olarak geçmesine izin verin. Beş mililitre glutatyon boncuklarını bir yerçekimi akış kolonuna yükleyin ve boncukları toplam üç kez 50 mililitre fosfat tamponlu salin tamponu ile yıkayın.Yüksek basınçlı homojenizatörden hücre lizatını 48, 384 kez G.Yerçekimi akış sütunundaki dengelenmiş glutatyon boncuklarına santrifüj edilmiş hücre lizatının süpernatanının yaklaşık 40 mililitresini ekleyin ve 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin. Glutatyon boncuklarını her 10 dakikada bir tekrar askıya alın. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, boncukları ve akış fraksiyonunu ayırmak için sütun çıkış sekmesini açın.Akış fraksiyonunu atın ve kalan glutatyon boncuklarını 50 mililitre fosfat tamponlu salin tamponu ile iki kez durulayın. Glutatyon boncuklarına 15 mililitre elüsyon tamponu ekleyin ve boncukları her 10 dakikada bir yeniden askıya alın. GST etiketli TRP 1261-1275 parçasını 50 mL'lik bir konik tüpe boşaltın ve bir boyut hariç tutma sütununa yükleyin.Tüp başına salınan proteinlerin beş mililitresini toplayın ve saflaştırılmış parçaları, soğutulmuş bir santrifüjdeki bir ultrafiltrasyon spin kolonunda santrifüjleme yoluyla bir mililitreye yoğunlaştırın. His etiketli NORPA 863-1095 parçasını saflaştırmak için, nikel boncukları kullanarak daha önce gösterilen prosedürü izleyin. Yetişkin sinekleri 50 mililitrelik konik santrifüj tüplerinde toplayın ve 10 dakika boyunca sıvı azotta dondurun.Dondurulmuş tüpleri elle kuvvetlice sallayın ve karışımı üç, sıralı olarak istiflenmiş, önceden soğutulmuş paslanmaz çelik eleklere aktarın. Elekleri sallayın ve sinek kafalarını bir fırça kullanarak 40 örgülü elek üzerinden süpürün. Onları beş mililitrelik konik tüplere aktarın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.Önceden soğutulmuş bir harç ve havane kullanarak sıvı azotta 0,5 gram kafayı homojenize edin. Homojenize edilmiş kafaları beş mililitre 10X lizis tamponunda çözün, ardından 20 dakika boyunca dört santigrat derecede 20, 817 kez G'de santrifüjleme yapın. Spin down süpernatant, 60 dakika boyunca dört santigrat derecede 100.000 kez G'yi daha da santrifüj eder.Yerçekimi akış kolonuna bir mililitre nikel boncuk ekleyin ve boncukları dört santigrat derecede 10 mililitre çift damıtılmış su ile üç kez yıkayın. Boncukları, dört santigrat derecede üç kez 10 sütun hacimli lizis tamponu ile dengeleyin. Nikel kolonuna 500 mikrolitre 600 mikromolar saflaştırılmış His-etiketli NORPA 863-1095 proteini ekleyin ve sütunu inkübe edin.Boncukları her 10 dakikada bir askıya alın. Boncukları ve akış fraksiyonunu ayırmak için kolon çıkış musluğunu açın ve nikel boncukları 10 mililitre soğuk lizis tamponu ile yıkayın. Daha sonra, nikel kolonuna Drosophila kafa homojenatının soğuk süpernatantını ekleyin.Kuluçkadan sonra, boncukları 10 mililitre lizis tamponu ile yıkayın ve boncuklara 500 mikrolitre 600 mikromolar GST etiketli TRP 1261-1275 protein ekleyin. Yerçekimi sütunundan salınan fraksiyonu toplayın. Nikel boncukları 10 mililitre bağlayıcı tamponla yıkayın.Ardından, elüsyon tamponu ekleyin ve yerçekimi akış sütunundan elüsyon fraksiyonunu toplayın. Drosophila TRP kanal saflaştırmasından salınan fraksiyonları, dört mililitrelik bir ultrafiltrasyon spin sütunu kullanarak konsantre edin. Numuneyi boyut hariç tutma sütununa enjekte edin ve proteinleri makul bir akış hızıyla süzün.GST etiketli TRP 1261-1275 fragmanı E.coli hücrelerinde eksprese edildi ve glutatyon boncukları ve bir boyut dışlama sütunu kullanılarak saflaştırıldı. Benzer şekilde, His-etiketli NORPA 863-1095 parçası, nikel boncuklar ve boyut hariç tutma sütunu kullanılarak ifade edildi ve saflaştırıldı. Salınımlı TRP kanalı, aşırı GST etiketli TRP 1261-1275 peptidinden, boyut hariç tutma kromatografisi ile ayrılır.Bir yan ürün olarak, INAD, ePKC, NORPA 863-1095 kompleksleri TRP 1261-1275 peptid yarışmasından sonra elde edilir. Bu protokolü denerken hatırlanması gereken en önemli şey, sinek kafalarını sıvı azotta homojenize etmek ve homojenatı DDM adı verilen bir deterjan içeren tamponda çözmektir. Bu prosedürü takiben, montaj ve düzenleme mekanizmalarını incelemek için kullanılabilecek tüm INAD protein kompleksini de saflaştırabiliriz.Bu yöntemin gelecekteki potansiyel bir uygulaması, Cryo-EM tekniklerini kullanarak endojen Drosophila TRP kanalının yapısal bilgilerini incelemek olacaktır. Ek olarak, yapay çift katmanlı lipit membranındaki saflaştırılmış endojen Drosophila TRP kanallarının elektrofizyolojik özelliklerinin ölçülmesi de mümkündür.

purification-endogenous-drosophila-transient-receptor-potential

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu prosedür sinaptik potansiyeller, nöromüsküler bileşke (NMJ) ışık darbeleri ile uyandırmak için mavi bir ışık ile aktive alg kanal ve hücre spesifik genetik ifade araçları...

Synaptic Potansiyellerinin Channelrhodopsin2 aracılığı Uyarım Drosophila Nöromüsküler Kavşaklar

In situ yama kelepçe kayıtları bozulmamış devresi nöronların elektrofizyolojik karakterizasyon için kullanılır. MSS küçük ve sağlam bir kılıf ile çevrili olduğundan Drosophila genetik model yama klemp ise zordur. Bu makale sonraki yama klemp kayıtları için kılıf ve temiz nöronlar kaldırmak için prosedürü açıklar.

Hazırlanması<em&gt; Drosophila</emIçin&gt; Orta Nöronlar<em&gt; In situ</em&gt; Patch Sıkma

Bu video, beyaz gözlü Drosophila'da uzun süreli depolarize edici artpotansiyel (PDA) araştırmak için deneysel bir protokolü göstermektedir. Sineğin gözü, fotopigment rodopsini metarhodopsine dönüştürmek için yoğun mavi ışık darbelerine maruz bırakılır ve pozitif iyon kanallarını açan ve membran depolarizasyonuna neden olan bir sinyal kaskadı başlatır. Mavi ışık, metarhodopsinin rodopsine yeniden dönüşümünü önlediğinden, pozitif iyonların sürekli akışı, uzun süreli depolarize edici son...

Drosophila Fotoreseptörlerinde Uzun Süreli Depolarizan Afterpotential (PDA) Araştırılması

Kaynak: Wagner, K.  et al., eGFP Etiketli Proteinler Kullanılarak Drosophila fotoreseptör hücrelerinde membran protein kaçakçılığının incelenmesi. J. Vis. Uzm. (2022). Bu video, eGFP etiketli TRPL proteinleri kullanılarak Drosophila fotoreseptör hücrelerinde membran protein trafiğinin görselleştirilmesini göstermektedir. Görüntüleme için transgenik sineklerin hazırlanmasını, fotoreseptör hücrelerinin floresan görüntülerinin yakalanmasını ve rabdomerelerde nispi eGFP floresansının ölçülmesiyle...

Drosophila fotoreseptör hücrelerinde membran protein kaçakçılığının incelenmesi

Drosophila melanogaster fotoreptörlerinden alınan bütün hücreli kayıtlar, çeşitli koşullar altında kendiliğinden oluşan karanlık yumruları, kuantum darbeleri, ışığa karşı makroskopik tepkileri ve akım-voltaj ilişkilerini ölçebilir. D. melanogaster genetik manipülasyon araçları ile birlikte bu yöntem, her yerde bulunan inositol-lipid sinyal yolunu ve TRP kanalının hedefini incelemeyi mümkün kılar.

Tam Hücreli Gerilim Kelepçesi Kayıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</emPhotoreceptors

Bu protokolün amacı , orta derecede (0.5-1 g) Drosophila embriyolarının toplanması ve afinite saflaştırması-kütle spektrometresi (AP-MS) gibi protein proteini uygulamalarında kullanılabilen protein ekstraktlarının hazırlanması için basit ve ucuz bir yaklaşım sağlamaktır ).

Orta Ölçekli Hazırlanışı<em&gt; Drosophila</em&gt; Proteomik Denemeler için Embriyo Özleri

Bu makalede tarafından istihdam Tetradotoksin ve Tetradotoksin dayanıklı sodyum kanal, NaChBac arasındaki monosynaptic bağlantıları sınamak için bir yöntem sunar.

Tetradotoksin dayanıklı sodyum kanallarını kullanarak Drosophila Monosynaptic bağlantıları inceleyerek

Bu makalede biyokimyasal miktarda deterjan çözündürüldükten TRPV1 spektroskopik analiz için elde için belirli yöntemleri açıklar. Kombine protokoller memeli iyon kanalları membran kontrollü bir ortamda yapısal ve fonksiyonel çalışmaları kolaylaştırmak için uyarlanmış Biyokimya ve biyofizik araçları sağlar.

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Bu iletişim kuralı maliyet-etkin ve uygun farmakolojik ajanları, sinirsel proteinlerin genetik mutasyonlar test etkinleştirmek için Drosophila melanogaster merkezi sinir sistemi azalan elektriksel aktivitesinin kaydetmek için bir yöntem açıklar, ve/veya keşfedilmemiş fizyolojik yolları rolü.

Üçüncü-biçim Drosophila Melanogaster merkezi sinir sisteminin etkinliğinin elektrofizyolojik kayıt

Burada, fotoreseptör membran proteinlerinin lokalizasyonu ve eGFP floresan kullanılarak Drosophila bileşik gözünde retinal dejenerasyonun değerlendirilmesi için non-invaziv yöntemler tanımlanmıştır.

eGFP Etiketli Proteinler Kullanarak Drosophila Fotoreseptör Hücrelerinde Membran Protein Kaçakçılığının İncelenmesi

Bi-stabil fotopigmentleri elektrofizyolojik olarak karakterize etmek için bir protokol sunuyoruz: (i) foton absorpsiyonunu takiben fotopigment molekülleri içindeki yük yer değiştirmelerini ve fotoreseptörlerdeki büyük miktarlarını kullanmak ve (ii) rodopsin ve metarodopsin fotopigment durumlarının emilim-spektrum farklılıklarından yararlanmak. Bu protokoller, bi-stabil fotopigment sistemlerini etkileyen mutasyonları taramak için yararlıdır.

Drosophila Fotoreseptörlerinde Fotopigment Düzeylerini Ölçmek için Elektrofizyolojik Yöntemler

Öğrenin Drosophila TRP kanallarının saflaştırma yöntemini elektrofizyolojik özellikleri incelemek için. Bu protokol INAD protein kompleksi kullanarak uçur başlarından tam uzunlukta kanal izolasyonu sağlar.

Endojen Drosophila Geçici Reseptör Potansiyel Kanallarının Saflaştırılması

Daha fazla video keşfet