Name: Afinite Kromatografisi Kullanılarak İnsan Matriksi Metalloproteinaz-3ün Bakteriyel İfadesi ve Saflaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Öğrenin, E. coli'de rekombinant MMP-3 katalitik bölgesinin bakteriyel ifadesi ve afinité kromatografisi ile saflaştırılması yöntemini. Bu protokol, terapötik uygulamalar için aktif protein elde etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Jacksonville, Florida'daki Mayo Clinic'teki Dr. Evette Radisky ve Alexandra Hockla'ya, Hisx6pro-MMP-3cd genini klonlamak için şablon olarak pET-3a-pro-MMP-3cd plazmidini sağladıkları için ve yorumlarına ve DNA dizilimi için Nevada Üniversitesi, Reno'daki Nevada Genomik Merkezi'nden Dr. Paul Hartley ile birlikte teşekkür etmek istiyorlar. Yazarlar ayrıca Cassandra Hergenrader'e protein ekspresyonunun bir kısmına yardımcı olduğu için teşekkür etmek istiyorlar. M.R.-S. NIH-P20 GM103650-COBRE Bütünleştirici Sinirbilim hibesine ve UNR Ar-Ge mICRO SEED Hibe Ödülü'ne teşekkür ederiz.

<ol><li>Portolano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+for+structural+biology+in+HEK+293F+suspension+cells%3A+A+novel+and+accessible+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression for structural biology in HEK 293F suspension cells: A novel and accessible approach.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51897(2014).</li>
<li>Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+expression+of+recombinant+human+proteins+with+the+transient+transfection+of+HEK293+cells+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53568(2015).</li>
<li>Nilvebrant, J., Alm, T., Hober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+protein+purification+facilitated+by+a+small+bispecific+affinity+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3370(2012).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+production+of+soluble+proteins+from+insoluble+inclusion+bodies+by+a+two-step-denaturing+and+refolding+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-step-denaturing and refolding method.</a> PLoS One. 6 (7), 22981(2011).</li>
<li>Hu, X., Beeton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+functional+matrix+metalloproteinases+by+zymography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Detection of functional matrix metalloproteinases by zymography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2445(2010).</li>
<li>Radisky, E. S., Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+matrix+metalloproteinase+inhibition+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of matrix metalloproteinase inhibition in breast cancer.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (11), 3531-3548 (2017).</li>
<li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Do, L. D., Hritz, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metalloproteinases+and+their+inhibitors%3A+Potential+for+the+development+of+new+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Metalloproteinases and their inhibitors: Potential for the development of new therapeutics.</a> Cells. 9 (5), 1313(2020).</li>
<li>Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+matrix+metalloproteinases+and+TIMPs%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs.</a> Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).</li>
<li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+the+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+reveals+that+its+N-+and+C-terminal+domains+cooperate+in+matrix+metalloproteinase+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of the metalloproteinase inhibitor TIMP-1 reveals that its N- and C-terminal domains cooperate in matrix metalloproteinase recognition.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9476-9488 (2019).</li>
<li>Batra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-10+%28MMP-10%29+interaction+with+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+TIMP-1+and+TIMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) interaction with tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP-1 and TIMP-2.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15935-15946 (2012).</li>
<li>Singh, K. K., Jain, R., Ramanan, H., Saini, D. K. Expression and purification of matrix metalloproteinases in Escherichia coli. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSingh%2C+KK+%22Matrix+Metalloproteases%22">Matrix Metalloproteases</a>. Galea, C. A. , Humana Press. New York, NY. 3-16 (2017).</li>
<li>Manka, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+triple-helical+collagen+cleavage+by+matrix+metalloproteinase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structural insights into triple-helical collagen cleavage by matrix metalloproteinase 1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12461-12466 (2012).</li>
<li>Gomis-Ruth, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+inhibition+of+the+human+matrix+metalloproteinase+stromelysin-1+by+TIMP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1.</a> Nature. 389 (6646), 77-81 (1997).</li>
<li>Shirian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Converting+a+broad+matrix+metalloproteinase+family+inhibitor+into+a+specific+inhibitor+of+MMP-9+and+MMP-14%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Converting a broad matrix metalloproteinase family inhibitor into a specific inhibitor of MMP-9 and MMP-14.</a> FEBS Letters. 592 (7), 1122-1134 (2018).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+histidine-tagged+catalytic+domain+of+MMP-13+in+one+step+using+affinity+column+and+renaturation+of+it+with+histidine+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Liquid+Chromatography+%26+Related+Technologies%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant histidine-tagged catalytic domain of MMP-13 in one step using affinity column and renaturation of it with histidine tag.</a> Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 37 (15), 2118-2130 (2014).</li>
<li>Aydin, H., Azimi, F. C., Cook, J. D., Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+convenient+and+general+expression+platform+for+the+production+of+secreted+proteins+from+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4041(2012).</li>
<li>McNiff, M. L., Haynes, E. P., Dixit, N., Gao, F. P., Laurence, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin+fusion+construct+enables+high-yield+production+of+soluble%2C+active+matrix+metalloproteinase-8+%28MMP-8%29+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin fusion construct enables high-yield production of soluble, active matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) in Escherichia coli.</a> Protein Expression and Purification. 122, 64-71 (2016).</li>
<li>Maity, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GST-His+purification%3A+A+two-step+affinity+purification+protocol+yielding+full-length+purified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">GST-His purification: A two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50320(2013).</li>
<li>Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Montón Silva, A., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+benefits+of+protein+co-expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">The multifaceted benefits of protein co-expression in Escherichia coli.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52431(2015).</li>
<li>Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HeLa+based+cell+free+expression+systems+for+expression+of+Plasmodium+rhoptry+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">HeLa based cell free expression systems for expression of Plasmodium rhoptry proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (100), e52772(2015).</li>
<li>Zeytuni, N., Zarivach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+M.+magneticum+strain+AMB-1+magnetosome+associated+protein+MamA%CE%9441%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of the M. magneticum strain AMB-1 magnetosome associated protein MamAΔ41.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1844(2010).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Çözünür, insan, rekombinant MMP'lerin büyük ölçekli üretimi zorlu bir görev olmaya devam etmektedir. Memeli hücreleri, fonksiyonel MMP'leri yüksek maliyetlerle ve uzun bekleme süreleriyle ifade edebilirken, E. coli hızla saflaştırılması ve yeniden katlanması gereken yüksek miktarda MMP inklüzyon cismi üretir11,16. R2DP hücreleri, MMP inklüzyon gövdelerinin verimini önemli ölçüde artırarak daha uygun maliyetli ve üretken bir MMP yeniden katlama işlemi sağ...

Çoğu kompleks ökaryotik protein, ekspresyondan sonra ayrıntılı posttranslasyonel modifikasyonlara uğrar ve yüksek oranda yardımcı protein katlanmasını ve ko-faktörlerin işlevsel olmasını gerektirir1. Bir bakteri konağında büyük miktarlarda çözünür insan proteini üretmek, yüksek maliyetler ve daha küçük ölçekli laboratuvar deneyleri için bile sağlam ekspresyon ve saflaştırma yöntemlerinin bulunmaması nedeniyle önemli bir zorluk olmaya devam etmektedir2,3. MMP'ler, büyük moleküler ağırlığa sahip insan endopeptidazları, genellikle E. coli'de ifade edildiğinde çözünmez inklüzyon cisimleri olarak ifade edilir. Çözünür insan MMP'lerinin ekstraksiyonu genellikle zahmetli, zaman alıcı bir çözünürlük ve yeniden katlama işlemine yol açar4.
MMP'ler hem fizyolojik hem de patojenik süreçlerde kritik rollere sahiptir. İnsan MMP'leri, yapı ve substrat özgüllüğüne göre kategorize edilen ve yüksek oranda korunmuş bir katalitik alana rağmen farklı şekilde eksprese edilen 23 çinko endopeptidaz ailesidir5,6. MMP'ler inaktif zimojenler olarak salgılanır, posttranslasyonel aktivasyon ve endojen inhibitörleri, metalloproteinazların doku inhibitörleri (TIMP'ler) 7,8,9,10 ile düzenlenir. Başlangıçta ECM cirosundaki rolleriyle tanınmasına rağmen, MMP'ler gelişim, morfogenez, doku onarımı ve yeniden şekillendirmede de rol oynamıştır8. MMP'lerin düzensizliği, diğer hastalıkların yanı sıra nörodejeneratif, kardiyovasküler ve fibrotik hastalıklarla birlikte kanserle de özellikle ilişkilendirilmiştir5,7.
Sağlam büyük ölçekli MMP üretim yöntemlerinin geliştirilmesi, biyokimyasal ve hücre bazlı testler yoluyla MMP mekanizmalarının gelecekteki çalışmalarının başarısını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Çeşitli MMP'ler daha önce MMP aktivitesini değiştirmeden Hisx6 etiketli MMP'ler de dahil olmak üzere bakterilerde11 ifade edilmiştir12,13,14,15. Ancak, bu yöntemler çoğaltılması zor olabilecek sıkıcı, uzun adımlar içerir.
Memeli hücreleri, uygun posttranslasyonel modifikasyonları sağlarken birçok farklı insan proteinini eksprese etmek için de kullanılabilir16. Memeli ekspresyon sistemi, uygun post-translasyonel modifikasyonlarla rekombinant insan proteinleri üretmek için ideal bir seçim olmasına rağmen, bu yöntemin başlıca dezavantajları başlangıçtaki düşük verimler, maliyetli büyüme ortamı ve reaktifleri, kararlı ekspresyon hatlarına ulaşmak için uzun zaman çizelgeleri ve mantar veya bakteri gibi diğer türlerle kontaminasyon riskidir2,11 . Ayrıca, memeli hücre hatlarındaki MMP üretimi, TIMP veya fibronektinler gibi ilişkili hücresel proteinlerden safsızlıklar verir11. Memeli hücrelerinde gözlenen yavaş hücre büyümesinin aksine, bakteri ekspresyon sistemi, daha basit ortam ve büyüme gereksinimleri ile birlikte kısa sürede büyük ölçekli protein üretimi sunar. Bununla birlikte, bakteriyel ekspresyon sistemlerinde diğer ilişkili hücresel proteinlerin (yani TIMP'lerin) eksikliği nedeniyle, daha yüksek konsantrasyonlardaki aktif MMP'ler otoproteoliz yoluyla bozunmaya maruz kalır ve bu da zayıf MMP verimine neden olur17.
Bu yazıda, uygun fiyatlılığı, basitliği ve daha yüksek MMP verimi üretmedeki başarısı nedeniyle E. coli'yi ekspresyon konakçısı olarak kullanan rekombinant Hisx6-pro-MMP-3cd'nin bakteriyel ekspresyonu, saflaştırılması ve aktivasyonu için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır2,3,18. E. coli, rekombinant MMP'ler ve diğer karmaşık proteinler için gerekli protein katlama makinesinden ve posttranslasyonel işlemden yoksun olduğundan, birçok E. coli suşu bu sınırlamaların üstesinden gelmek için tasarlanmıştır ve E. coli'yi rekombinant insan MMP-3cd'nin ekspresyonu için daha uygun bir konakçı haline getirmiştir,19,20 . Örneğin, bu çalışmada kullanılan R2DP suşu, E. coli'de nadiren kullanılan kodonları içeren kloramfenikol dirençli bir plazmid sağlayarak ökaryotik ekspresyonu arttırır.
Bu protokolde açıklandığı gibi, R2DP hücrelerinde pET-3a vektöründen (Şekil 1) nispeten saf inklüzyon cisimlerinin aşırı ekspresyonundan sonra, Hisx6-pro-MMP-3 katalitik alan (MMP-3cd) proteinleri ekstrakte edilir ve denatüre edilir4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19, afinite etiketi kromatografisi kullanılarak saflaştırıldı. Yeniden katlanma ve diyaliz üzerine, pro-MMP-3cd (zymogen) 4-aminofenilmerkürik asetat (APMA) ile aktive edildi ve verimi ve daha fazla saflaştırma ihtiyacını değerlendirmek için SDS-PAGE analizi kullanıldı5,21. Bu protokol, örnek olarak çözünür MMP-3cd'nin ekspresyonunu, saflaştırılmasını ve aktivasyonunu açıklar. Bununla birlikte, diğer MMP'lerin ve insan proteazlarının benzer ekspresyonla ekspresyonu ve aktivasyon mekanizmaları için bir rehber olarak da kullanılabilir (Şekil 2). MMP-3cd dışındaki diğer proteinler için, okuyucunun bu protokolü denemeden önce hedef proteinleri için en uygun tampon bileşimlerini ve yöntemlerini belirlemesi önerilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig01.jpg"> Resim 1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd plazmidinin plazmid haritası. pET-3a vektörü bir ampisilin direnç geni içerir. Bir N-terminal Hisx6-etiket dizisi, BamHI ve NdeI kısıtlama bölgeleri arasında T7 promotörünün kontrolü altında pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd yapısını üretmek için pro-MMP-3cd dahil olmak üzere pET-3a tabanlı vektöre klonlanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig02.jpg"> Şekil 2: Pro-MMP-3cd'nin bakteriyel ekspresyonu, saflaştırılması, yeniden katlanması ve aktivasyonu. 1.1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd plazmidi BL21 (DE3) veya R2DP Hücrelerine dönüştürüldü. 1.2: Pro-MMP-3cd protein ekspresyonu IPTG kullanılarak indüklendi. 1.3: Kimyasal lizis ve sonikasyon, esas olarak çözünmeyen ve inklüzyon cisimlerinde bulunan Hisx6-pro-MMP-3cd proteinlerini çıkarmak için kullanılır. Üre, proteini inklüzyon cisimciklerinden denatüre etmek ve çözündürmek için kullanıldı. 2.1. Denatüre Hisx6-pro-MMP-3cd proteini, afinite kromatografisi saflaştırması ile saflaştırıldı. 3. Salınan Hisx6-pro-MMP-3cd, ürenin tampondan kademeli olarak çıkarılmasıyla diyaliz sırasında yavaşça yeniden katlandı. 4. Son olarak, yeniden katlanmış MMP-3cd proteini, N-terminal pro-peptid alanı çıkarılarak APMA kullanılarak aktive edildi. APMA daha sonra tuzdan arındırma yoluyla çözeltiden çıkarılır. Sayılar, bu adımları açıklayan protokol bölümlerine karşılık gelir. Kısaltmalar: MMP-3cd = Matriks metalloproteinaz-3 katalitik alan; APMA = 4-aminofenilmerkürik asetat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>0.22 ve mikro; m steril filtre</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLGP033RS</td><td>Saflaştırmadan önce protein ekstraktından bazı kirleticileri uzaklaştırmak ve Ni-NTA kolonunun tıkanmasını önlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>1 L Erlenmeyer şişeleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S76106F</td><td>n/a</td></tr><tr><td>1 L cam şişeler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>06-414-1D</td><td>n/a</td></tr><tr><td>1.5 mL mikrofüj tüpleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-682-002</td><td>Yok</td></tr><tr><td>15 mL konik tüpler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td>n/a</td></tr><tr><td>18 G, 1 inç eğimli iğne</td><td>Amazon</td><td>B07S7VBHM2</td><td>Diyaliz kaseti ile birlikte kullanılır</td></tr><tr><td>2 mL tuz giderme kolonu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89890</td><td>Aktivasyonu takiben APMA'yı kaldırır</td></tr><tr><td>2- (N-Morfolino) etansülfonik asit (MES)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAA1610422</td><td>yok</td></tr><tr><td>250 mL konik şişe yastıkları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-538-53A</td><td>Büyük hacimli santrifüjleme sırasında konik şişeleri stabilize edin</td></tr><tr><td>250 mL konik şişeler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-538-53</td><td>n/a</td></tr><tr><td>400 mL karıştırılmış hücre</td><td>Sigma Aldrich</td><td>UFSC40001</td><td>Santrifüj filtre ünitesinden çok daha büyük bir hacmi yeniden konsantre eder. Rosetta2(DE3)pLysS hücreleri, santrifüj filtre ünitesinin 15 mL sınırını aşabilen yüksek hacimlerde protein üretir</td></tr><tr><td>4-aminofenilmerkürik asetat (APMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9563-5G</td>, propeptid 5 mL şırıngayı <td>parçalayarak MMP-3'ü aktive eder</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0829167</td><td>Diyaliz kaseti 50</td></tr><tr><td>mL konik tüplerle</td> birlikte kullanılır <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td>Birçok saflaştırma adımında depolama için kullanılır</td></tr><tr>:<td>50 mL yeniden konsantrasyon tüpü</td><td>Sigma Aldrich</td><td>UFC901024D</td><td>Diyalizden sonra protein örneklerini yeniden konsantre etmek veya kirleticileri uzaklaştırmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td>Soğutulduktan sonra otoklavlanmış LB ortamını katılaştıran tampon bileşen</td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td>pET3a vektörü ile birlikte kullanılan antibiyotik; 100 & de kullanılır; LB ortamında g/mL</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td>pET3a vektörü ile kullanılacak kısıtlama enzimi</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür (CaCl2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>600-30-23</td><td>Kalsiyum iyonu MMP yapısını stabilize eder</td></tr><tr><td>Hücre yayıcılar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-189-7544</td><td>Dönüşümden</td></tr> <tr><td>sonra hücreleri bir petri kabına yaymak için kullanılabilirKloramfenikol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-055-125GM</td><td>pET3a vektörü ile kullanılan antibiyotik; 34 & mikro'da kullanılır; LB ortamında g / mL</td></tr><tr><td>Diyaliz Tamponu 1</td><td>n / a</td><td>n / a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl 2 , 1 & mikro; M ZnCl2, 4 m üre.</td></tr><tr><td>Diyaliz Tamponu 2</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 & M ZnCl2, 2 m üre.</td></tr><tr><td>Diyaliz Tamponu 3</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl<alt>2</alt>, 1 ve mikro; M ZnCl<alt>2</alt>.</td></tr><tr><td>Diyaliz klipsleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>68011</td><td>Yılan derisi diyaliz tüpü ile birlikte kullanılır</td></tr><tr><td>Diyaliz tüpü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88243</td><td>Çok daha büyük numune hacimlerini tutan, ancak numune kaybı riski daha yüksek olan alternatif diyaliz yöntemi</td></tr><tr><td>Digest tamponu</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>pET3a vektörünün sindirilmesinde kullanılan tampon</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık küvetler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-200-257</td><td>Büyüme ve ekspresyon sırasında bakteri kültürü OD'sini ölçmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D107125G</td><td>Herhangi bir disülfid bağını azaltarak protein denatürasyonuna yardımcı olur</td></tr><tr><td>DNA montaj karışımı</td><td>NEB</td><td>E2621S</td><td>Hisx6-pro-MMP-3cd PCR ürününü ve sindirilmiş pET3a vektörünü bağlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>DNaz I</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td>Daha sonra protein saflaştırmasını etkileyebilecek olumsuz DNA kirleticilerini parçalamak için endonükleaz</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A995-4</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J15694-AE</td><td>Denatürasyonda kullanılır. Oksidasyonu ve ardından disülfür bağlarının oluşumunu önler</td></tr><tr><td>Jel geri kazanım kiti</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>Agaroz jellerinden DNA'yı izole eder ve saflaştırır</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G33-500</td><td>-80 ° C'de dondurulan gliserol stokları yapmak için kullanılır; C</td></tr><tr><td>Yerçekimi akış sütunu</td><td>BioRad</td><td>7321010</td><td>Rekombinant olarak His etiketli proteinlerin Ni-NTA saflaştırılması için kullanılır</td></tr><tr><td>Yüksek dönüşüm verimli hücreler</td><td>NEB</td><td>C2987</td><td>N-terminal His-tag'ı pET3a-pro-MMP-3cd yapısına klonlamak için daha fazla başarı şansına sahip yüksek dönüşüm verimli hücreler</td></tr><tr><td>HT Elüsyon Tamponu</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M üre, 250 mM imidazol. pH'ı 7.4</td></tr><tr><td>HT Dengeleme Tamponu</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M üre olarak ayarlayın. pH'ı 7,4</td></tr><tr><td>HT rejenerasyon tamponu</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM MES, 0,1 M NaCl'ye ayarlayın. PH'ı 5.0</td></tr><tr><td>HT Yıkama Tamponu</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M üre, 25 mM imidazole ayarlayın. pH'ı 7.4'e ayarlayın</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit (HCl)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A144C-212</td><td>pH tamponları için kullanılır</td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAA1022122</td><td>Histidin yan grubunu taklit eder. Spesifik olarak bağlanmayan proteinleri his etiketli hedef proteinden ayırmak için kullanılır</td></tr><tr><td>İnklüzyon Vücut Tamponu</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, %2 v/v Triton X 100, 0.5 M Üre. pH'ı 8.0'a ayarlayın</td></tr><tr><td>İzopropil-&szlig;-D-tiyokalaktopiranosid (IPTG)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FERR0392</td><td>pET3a'da hedef gen ekspresyonunu indükleyen bir reaktif. 0,5 mL 1 M alikot yapın, süzün, sterilize edin ve -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>LB Amp CamR ortamı</td><td>n/a</td><td>n/a Steril</td><td>1 L şişeye veya 1 L şişeye dökülmelidir. 1 L için 25 g LB Et Suyu ekleyin. Otoklavlama ile sterilize edin. 50 ° C'nin altına soğuduktan sonra; C, 100 & mikroya ampisilin ekleyin; g / mL ve kloramfenikol 34 & mikro; g/mL</td></tr><tr><td>LB Amp CamR plakalar</td><td>n/a</td><td>n/a Steril</td><td>petri kaplarına dökülmelidir. Petri kabı kapağı tamamen kaplanana kadar dökün. 1 L ortam 40-60 tabak verir. 1 L için: 25 g LB Et suyu, 16 g Agar. Otoklavlama ile sterilize edin. 50 ° C'nin altına soğuduktan sonra; C, 100 & mikroya ampisilin ekleyin; g / mL ve kloramfenikol 34 & mikro; g / mL</td></tr><tr><td>LB Et Suyu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1426-2</td><td>Tripton, maya özü ve sodyum klorür ile önceden karıştırılmış</td></tr><tr><td>Lizis Tamponu</td><td>n / a</td><td>n / a 50</td><td>mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g / mL lizozim,% 0.49 v / v Triton X-100. PH'ı 8.0'a ayarlayın</td></tr><tr><td>Lizozim</td><td>MP Biyomedikal</td><td>195303</td><td>Protein ekstraksiyonunda kullanılır. Bakteri hücre duvarlarını parçalayan enzim</td></tr><tr><td>Miniprep kiti</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td>Başarılı olursa, pET3a vektörü Ni-NTA reçinesi ile kullanılacak transformantlardan pET3a-pro-MMP-3cd yapısını</td></tr><tr><td>çıkarır NdeI</td><td>NEB</td><td>R0111S</td><td>Restriksiyon enzimi</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI88221</td><td>Rekombinant his etiketli proteinleri bağlamak için kullanılır. Bu güçlü etkileşim, MMP agregasyonunu önlemek için daha yüksek konsantrasyonlarda imidazol</td></tr><tr><td>Noniyonik yüzey aktif madde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI28316</td><td>Depolama deterjanı ile değiştirilebilir. Katalitik aktiviteyi bozmadan, MMP yüzeyindeki hidrofobik kalıntılar ile su molekülleri arasındaki etkileşimleri en aza indirir.</td></tr><tr><td>PCR karışımı</td><td>NEB</td><td>M0492S,</td><td>pET3a-pro-MMP-3cd vektörüne bir N-terminal his-etiketi yerleştirmek için bir PCR reaktifi</td></tr><tr><td>pET plazmid</td><td>Addgene</td><td>n/a</td><td>pET3a vektörü, ampisilin direnci, bir hedef genin indüklenebilir ekspresyonu ve T7 primerleri ile dizileme sunar</td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>LB agar ortamı</td></tr><tr><td>R2DP hücreleri</td><td>Novagen</td> <td>üzerindeki transformatörleri kaplamak için kullanılır714033</td><td>Ökaryotik proteinlerin gelişmiş ekspresyonuna sahip BL21 türevleri. E. coli'de nadir bulunan kodonların tRNA'larını içerir</td></tr><tr><td>SOC büyüme ortamı</td><td>NEB</td><td>B9020S</td><td>Dönüşüm sırasında hızlı büyüme için seçici olmayan büyüme ortamı</td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>Tamponlarda kullanılır ve protein stabilitesine yardımcı olur</td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI89905</td><td>Protein ekstraksiyonunda kullanılan deterjan. Lyses hücre duvarları</td></tr><tr><td>Çözündürme Tamponu</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Üre. PH'ı 8.0</td></tr><tr><td>Tris bazına</td> ayarlayın <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Fizyolojik pH aralığında kullanılan ortak tampon. </td></tr><tr><td>Hücre lizizi için kullanılan</td>sıcaklığa duyarlı<td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M1122980101</td> Deterjan</tr><tr><td>Üre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAJ75826A7</td><td>Protein ikincil yapısını bozmak için ilk kaotropik ajan</td></tr><tr><td>Çinko klorür (ZnCl2)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAA162810E</td><td>MMP yapısını stabilize eder. Çinko iyonu, MMP-3'ün katalitik bölgesinde bulunur</td></tr></tbody></table>

afinite kromatografisi kullanılarak İnsan matriksi metalloproteinaz-3'ün bakteriyel İfadesi ve saflaştırılması

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Matriks metalloproteinazlar (MMP'ler), hücre dışı matriks (ECM) bozunması ve yeniden şekillenmesinde merkezi rolleri olan metzinsin proteazlar ailesine ve ayrıca çeşitli büyüme faktörleri ve sitokinlerle etkileşimlere aittir. Spesifik MMP'lerin aşırı ekspresyonu, kanser, nörodejeneratif hastalıklar ve kardiyovasküler hastalık gibi çeşitli hastalıklardan sorumludur. MMP'ler, MMP aşırı ekspresyonu ile ilişkili hastalıkları tedavi edebilen terapötikler geliştirmeyi hedef alan hedefler olarak son zamanlarda ilgi odağı olmuştur.
Çözeltideki MMP mekanizmasını incelemek için, aktif, çözünür MMP'lerin üretimi için daha kolay ve sağlam rekombinant protein ekspresyonu ve saflaştırma yöntemlerine ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, çoğu MMP'nin katalitik alanı, posttranslasyonel makine eksikliği nedeniyle Escherichia coli'de (E. coli) çözünür formda ifade edilemezken, memeli ekspresyon sistemleri genellikle maliyetlidir ve daha düşük verime sahiptir. MMP inklüzyon organları, doğal konformasyondaki MMP'lerin verimini önemli ölçüde azaltan sıkıcı ve zahmetli kapsamlı saflaştırma ve yeniden katlama sürecinden geçmelidir. Bu yazıda, matris metalloproteinaz-3 katalitik etki alanı (MMP-3cd) üretmek için Rosetta2 (DE3) pLysS (bundan böyle R2DP olarak anılacaktır) hücrelerini kullanan ve afinite saflaştırmasında kullanılmak üzere bir N-terminal His-etiketi ve ardından pro-domain (Hisx6-pro-MMP-3cd) içeren bir protokol sunulmaktadır. R2DP hücreleri, bakteriyel ekspresyon sistemlerinde normalde nadir görülen kodonları içeren kloramfenikol dirençli bir plazmid yoluyla ökaryotik proteinlerin ekspresyonunu arttırır. Rekombinant protein ekspresyonu için tercih edilen geleneksel hücre hattı BL21 (DE3) ile karşılaştırıldığında, bu yeni suşu kullanarak saflaştırma, saflaştırılmış Hisx6-pro-MMP-3cd'nin verimini artırdı. Aktivasyon ve tuzdan arındırma üzerine, pro etki alanı N-terminal His-tag ile birlikte bölünür ve sayısız in vitro uygulamada anında kullanım için aktif MMP-3cd sağlar. Bu yöntem pahalı ekipman veya karmaşık füzyon proteinleri gerektirmez ve bakterilerde rekombinant insan MMP'lerinin hızlı üretimini tanımlar.

SDS-PAGE'de numuneler çalıştırılırken, protein çözünmez inklüzyon cisimleri şeklinde ifade edildiğinden, lize ve sonikasyonlu fraksiyonlar, protein henüz üre içinde çözünmediğinden, Hisx6-pro-MMP-3cd ekstraktını çok az içermeli veya hiç içermemelidir. Şekil 3 , BL21 (DE3) hücrelerinden ve R2DP hücrelerinden Hisx6-pro-MMP-3cd'nin His-tag saflaştırma elüsyon fraksiyonlarını karşılaştırmaktadır. Elüsyon fraksiyonları, diyalizden önce hem BL21 (DE3) hem de R2DP hücreleri için ayrı ayrı toplandı....

Onun etiketi saflaştırma, diyaliz ve aktivasyon, bakterilerde çözünür, aktif matriks metalloproteinaz-3 katalitik alan protein ekspresyonunun verimini arttırmak için kullanılır. Protein fraksiyonları SDS-PAGE jelleri ile analiz edilir.

Afinite Kromatografisi Kullanılarak İnsan Matriksi Metalloproteinaz-3'ün Bakteriyel İfadesi ve Saflaştırılması

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...

Bu ayrıntılı protokol, E.Coli'deki rekombinant MMP-3 katalitik alan için diğer MMP terapötik hedeflerine uygulanabilen oldukça verimli ve uygun maliyetli bir bakteri ekspresyonu yöntemini açıklamaktadır. E.coli, karmaşık bir protein katlama ve çeviri sonrası işleme sisteminden yoksundur. Bu yöntem, E.coli'de ökaryotik protein ekspresyonunu arttırmak için R2DP hücre suşunu kullanır.Spesifik MMP'lerin aşırı üretimi kanser, kardiyovasküler ve nörodejeneratif hastalıklar gibi çeşitli hastalıklara yol açar. Aktif çözünür MMP'ler, terapötikleri inhibe eden MMP'lerin geliştirilmesi için gereklidir. LB ampisilin kloramfenikol dirençli bir plakadan LB ampisilin kloramfenikol dirençli plakadan 37 santigrat derecede beş mililitre LB ampisilin kloramfenikol dirençli ortamda, tek bir izole pET His-tag pro MMP-3 katalitik alan dönüştürücü kolonisini aşılayın.Her kültürden alikotları kurtarın ve% 40 gliserol stokları hazırlayın. 500 mililitre LB ampisilin kloramfenikol dirençli ortam içeren bir litrelik şişeyi, gece kültürü ile 600 nanometrede 0.05 ila 0.1 optik yoğunluğa aşılayın. Optik yoğunluğu birkaç zaman noktasında 600 nanometrede, tipik olarak 0,4 ila 0,6 arasına düşene kadar üç ila dört saat boyunca ölçün.Bir molar IPTG stoğu olan kültürleri bir milimolar'ın son konsantrasyonuna indükleyin. 37 derecelik çalkalayıcıda üç ila dört saat daha inkübe edin. Hücreleri 250 mililitrelik konik şişelerde 13.000 G ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj edin ve kültürler tamamen peletlenene kadar tekrarlayın.Pelet gramı başına üç mililitre lizis tamponu ekleyin ve vorteks veya pipetleme ile peleti yeniden askıya alın. Bir litre kültür başına hacimce sodyum deoksikolat ağırlıkça% 10 1.25 mililitre ekleyin. Bir litre kültür başına 10 mikrolitre DNaz I ekleyin.Oda sıcaklığında 150 RPM'de 30 dakika çalkalayın. 13.000 G ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüj. Süper natantı atın.Pelet, yukarı ve aşağı pipetleyerek, kaynaştırma gövdesi tamponunun litre kültürü başına 100 mililitre içinde yeniden askıya alın. Aşırı ısınmayı önlemek için sonikasyon sırasında örnekleri buz üzerinde tutun. Her numuneyi 15 saniyelik altı döngü, beş çıkış ve% 50 nabız için sonikleştirin.Numuneleri 13.000 G ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Pelet'i kontrol edin. Pelet kompaktsa, süpernatanı atın.Her peleti bir litrelik kültürden ve beş mililitre çözündürme tamponundan geri alın. Proteinlerin çözünmesini sağlamak için buz üzerinde en az 30 dakika inkübe edin. Hücreleri 10 dakika boyunca 13.000 kez G'de dört santigrat derecede santrifüj yapın.Pelet santrifüjlemeden sonra oluşursa, süpernatantı ayrı bir 50 mililitrelik konik tüpe dökün. Pelet, yukarı ve aşağı pipetleyerek, bir litre kültür başına beş mililitre daha çözünürleştirme tamponunda yeniden askıya alın. 13.000 G ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüj.Ardından, süpernatanları çekin. Pelet atın veya ek sonikasyon için eksi 80 santigrat derecede saklayın. HT yıkama tamponuna karşı boş bırakın ve ilk yıkama fraksiyonunun A280'ini kaydedin.A280 taban çizgisine yaklaşana kadar diğer kesirlerle tekrarlayın. Beş mililitre HT elüsyon tamponu ekleyerek His etiketli proteinleri derhal süzün. HT elüsyonu etiketli mikrofüj tüplerinde 0,5 ila bir mililitre fraksiyondaki akışı toplayın.Elüsyon fraksiyonunun A280'ini ölçün. A280, mililitre başına 0,3 miligramdan büyükse, fraksiyonu HT denge tamponu ile seyreltin. Salınımlı MMP fraksiyonlarını diyaliz tüpündeki bir litre diyaliz tamponuna batırın ve tüpü ve içeriğini dört santigrat derecede en az sekiz saat boyunca manyetik bir karıştırma üzerinde karıştırın.Bir litre diyaliz tamponu ikiye aktarın ve tüpü ve içeriğini dört santigrat derecede en az sekiz saat boyunca manyetik bir karıştırma üzerinde karıştırın. Daha sonra, bir litre diyaliz tamponu üçüne aktarın ve tüpü ve içeriğini dört santigrat derecede en az sekiz saat boyunca manyetik bir karıştırma üzerinde karıştırın. Numuneyi uygun bir kaba aktarın ve çevrilmiş MMP olarak etiketleyin.Tüpü herhangi bir çökelti için inceleyin. Mililitre MMP başına bir miligramlık bir mililitre aliquot başına, bir milimolar'ın son APMA konsantrasyonuna ulaşmak için 50 mikrolitre 20 milimolar APMA ekleyin. Bir çökelti oluşursa, dört santigrat derecede 10 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj yapın.Süpernatantı aktif MMP etiketli 1,5 mililitrelik bir mikrofüj tüpünde saklayın. Çökeltiyi APMA atıkları için işaretlenmiş bir kaba atın. SDS-PAGE, R2DP hücrelerindeki BL21 DE3 hücrelerinden His-tag pro MMP-3 katalitik etki alanının His-tag saflaştırma elüsyon fraksiyonlarını karşılaştırmak için çalıştırıldı.His-etiketli MMP katalitik etki alanının ve BL21 DE3 hücrelerinin ilk sekiz elüsyon fraksiyonu, R2DP hücrelerinde His etiketli MMP katalitik alanındakilerden daha az protein gösterdi. MMP3 CD ve R2DP hücrelerinin indüklenmiş, yeniden katlanmış, konsantre, aktive edilmiş ve tuzdan arındırılmış fraksiyonları gösterilmiştir. Aktivasyon üzerine, aktive edilen MMP-3 CD bandının moleküler ağırlığı, yaklaşık 30 kilodaltonda kalan His etiketli zimojenin aksine, yaklaşık 20 kilodaltondur.Hücre lizatlarını santrifüj ederken, peletler kompakt olmayabilir. Bu meydana geldiğinde, daha fazla sonikasyon yapın ve daha uzun süre santrifüj yapın. Proteini yeniden yoğunlaştırırken, yağış meydana gelebilir.Çözünürizasyon tamponunda çözün ve işlemi tekrarlayın. Burada açıklanan prosedür, sonunda MMP enzimatik aktivitesinin moleküler mekanizmasını anlamak için kullanılabilecek aktif insan MMP'lerinin çözünür ekspresyonu için ayrıntılı bir yöntem sağlar. Saflaştırılmış MMP proteinlerine FPLC gibi alternatif protein saflaştırma yöntemleri uygulanabilir.

bacterial-expression-purification-human-matrix-metalloproteinase-3

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Mama magnetosome aktivasyonu dahil olmak gösterildi eşsiz bir Magnetosome ilişkili protein. Burada Mama silme mutant arıtma protokolü (MamAΔ41)...

Saflaştırılması M. magneticum Deformasyon AMB-1 Magnetosome İlişkili Protein MamAΔ41

Yeni ve son derece verimli, iki kademeli afinite kromatografisi protokolü geliştirildi ve ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu yöntem iki içsel yakınlık küçük bir arıtma etiketi dayanan ve farklı özelliklere sahip geniş bir hedef proteinlerin uygulanabilir.

Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma

Kaynak: Becker, B. ve diğerleri. Mayada Risin Toksin A Zinciri (RTA) kaçakçılığı için gerekli hücresel bileşenleri belirlemek için basit bir floresans tabanlı raporlayıcı testi. J. Vis. Exp. (2017).Bu video, polihistidin etiketli bir rekombinant proteinin nikel bazlı affinite kromatografisi kullanılarak arıtılmasını göstermektedir. Anahtar adımları belirtir; bunlar arasında sonikasyon yoluyla bakteriyel lizizi, lizatın aydınlaştırılması ve filtrasyonu ile imidazol kullanılarak hedef proteinin...

 Rekombinant Bakteriyel Proteinin Arındırılması için Afinite Kromatografi Tekniği

Bu video, antikor üreten bir hücre kültüründen elde edilen kültür süpernatantından monoklonal antikorların saflaştırılması için bir tekniği göstermektedir. İşlem, boncuklar üzerindeki süpernatanttaki antikorları hareketsiz hale getiren ve kirleticilerden etkili bir şekilde ayrılmaya izin veren konjuge Protein A ile çapraz bağlı agaroz boncuklarından oluşan bir matrisin kullanılmasını içerir. Düşük pH'lı bir elüsyon tamponu uygulanarak, protein A-antikor etkileşimi gevşetilir ve antikor içeren...

Monoklonal Antikorların Saflaştırılması için Bir Afinite Kromatografisi Tekniği

Bu protokol, ECM proteinlerini dokulardan veya tümörlerden zenginleştirmek ve ECM ile zenginleştirilmiş preparatları protein bileşimlerini kütle spektrometresi ile analiz etmek için peptitlere deglikosile etmek ve sindirmek için bir prosedürü açıklar.

Kütle Spektrometresi Analizi için Peptitler içine Dokular ve Sindirim gelen Ekstrasellüler Matriks Proteinleri zenginleştirilmesi

Bu, salgılanan, glikosile edilmiş memeli proteinlerinin üretimi ve ardından X-ışını kristalografisi ve diğer biyofiziksel çalışmalar için yeterli homojen protein verimi ile tek aşamalı saflaştırma için hızlı, uygun maliyetli bir protokoldür.

Verimli memeli hücre ekspresyon ve Kristalizasyon için hücre dışı Glikoproteinlerin Tek aşamalı saflaştırma

Burada, S100A12'yi (calgranulin C) ifade etmek ve saflaştırmak için bir yöntem sunuyoruz. İnsan patojen H. pylori'ye karşı antimikrobiyal aktivitesini ölçmek için bir protokolü açıklıyoruz.

S100A12&#39;nin Ekspresyon, Saflaştırma ve Antimikrobiyal Aktivitesi

İyon kanalları arıtma kez, zorlu ama bir kez elde, potansiyel olarak vitro araştırmalar fonksiyonları ve yapıları kanallarının izin verebilirsiniz. Burada, biz ifade ve arıtma memeli bestrophin protein, bir ailenin Ca2 +için kademeli yordamlar açıklar-Cl- kanalları aktif.

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

Burada bir iletişim kuralı için immobilize benchtop metal benzeşme Kromatografi arıtma ve etiketli bir polyhistidine sonraki sulandırma, heme olmayan demir bağlama dioxygenase lisans öğretim laboratuvar için uygun mevcut.

Benchtop Metal benzeşme kromatografi, sulandırma immobilize ve bir Polyhistidine tahlil Metalloenzyme Lisans Laboratuvarı etiketli.

Burada, bir protokol Kapsüllenen ve bir fluorogenic matriks metalloproteinaz (MMP) functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels hücrelerde kültür sunulan-parçalanabilir peptid. Hücresel MMP ve metabolik aktivite doğrudan bir standart Mikroplaka Okuyucu kullanarak hidrojel kültürler ölçülür.

Küresel hücresel matriks metalloproteinaz ve 3D Hydrogels metabolik etkinliğini ölçme

Bu protokol, MultiBac Baculovirus sistemini kullanarak insan miyozin-7a holoenziminin rekombinant olarak üretilmesi ve özel bir in vitro filament kayma testi kullanılarak motilitesinin incelenmesi prosedürlerini detaylandırır.

İnsan Miyozin-7a'nın MultiBac Sistem Tabanlı Saflaştırılması ve Biyofiziksel Karakterizasyonu

Öğrenin, E. coli'de rekombinant MMP-3 katalitik bölgesinin bakteriyel ifadesi ve afinité kromatografisi ile saflaştırılması yöntemini. Bu protokol, terapötik uygulamalar için aktif protein elde etmeyi sağlar.

Afinite Kromatografisi Kullanılarak İnsan Matriksi Metalloproteinaz-3'ün Bakteriyel İfadesi ve Saflaştırılması

Daha fazla video keşfet