Kinesin-7 CENP-E'nin In Vivo İnhibisyon, İmmünofloresan ve Akım Sitometrisi Kullanılarak Spermatositlerde Fonksiyonel Değerlendirilmesi

Mayoz, ökaryotlarda gametogenez ve cinsel üreme için gerekli olan evrimsel korunmuş bir olaydır. Protokolümüz, mayotik bölünme ve spermatogenez çalışmaları için etkili bir yöntem sunmaktadır. Spermatositlerin analizi için bir dizi protokol tanımladık.

Bu teknik, mayotik iğ, homolog kromozomlar ve spermatositlerdeki hücre altı organellerin gözlemlenmesi için uygulanabilir. Bu yöntem, mayotik bölünmenin analizi, gen düzenleyici hayvan modellerinin oluşturulması ve dokularda veya organlarda gen transfeksiyonu için kullanılabilir. Deneyciler karın ameliyatı sırasında steril bir ortam sağlamalı ve bu protokolün sıcaklığına, zamanına ve temel deneysel koşullarına dikkat etmelidir.

Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan mezun olan Bayan Meng-Fei Xu olacak. Anestezi uygulanmış fare uzuvlarını bağlayarak ve balmumu tepsisine sabitleyerek GSK923295 aracılı sentromer protein E veya CENP-E inhibisyon fare modelinin yapımına başlayın. Cerrahi alanı dezenfekte ettikten sonra, farenin karın boşluğunda beş milimetrelik bir açıklık açmak için steril bir neşter kullanın ve ardından cilde steril cerrahi kelepçeler yerleştirin.

Daha sonra steril cımbız yardımıyla testisleri bulmak için epididim yağ yastığını steril diseksiyon forsepsleri ile çekin. Testisleri stereoskop altında steril forseps ile sabitledikten sonra, 10 mikrolitre Riot kullanarak 10 mikromolar'lık son konsantrasyonda seminifer tübüllere yavaşça 10 mikrolitre GSK923295 enjekte edin. Tamamlandığında, testisleri karın boşluğuna geri itin ve cerrahi bölgeyi metin makalesinde açıklandığı gibi dikin.

Toplanan fare testislerinin gradyan dehidrasyonu için, numuneyi makalede açıklandığı gibi çeşitli ortamlarda sırayla inkübe edin. Seri inkübasyondan sonra, dokuyu gömme kutusunun altına yerleştirin ve erimiş parafini kutuya ekleyin. Parafinin tamamen katılaşması için, numuneleri altı saat boyunca dört santigrat derecede soğutun.

Daha sonra, numune ile bıçak yüzeyi arasındaki açıyı 5 ila 10 derecede tutarken numuneyi ultra mikrotomun tutucusuna sabitleyin. Ultra mikrotom kullanarak beş mikrometre kalınlığındaki bölümleri hazırlamak için dilim kalınlığını beş mikrometreye ayarlayın. Hazırlandıktan sonra, slayt kurutucudaki bölümleri 37 santigrat derecede 12 saat kurutmadan önce numune slaydını 40 santigrat derecede bir su banyosuna yayın.

12 saat sonra, daha önce açıklandığı gibi slaytların sıralı inkübasyonunu gerçekleştirin. Daha sonra, slaytları damıtılmış suda beş dakika durulayın, ardından Mayer'in Hematoksilin Çözeltisi ile oda sıcaklığında altı dakika boyunca boyayın. Daha sonra lekeli slaytları akan suda beş dakika durulayın ve iki dakika boyunca damıtılmış suyla inkübe edin.

Slaytları üç saniye boyunca% 1 etanol hidroklorür içinde inkübe edin ve ardından iki dakika boyunca durulayın ve suyu akıtın. Numuneyi 15 saniye boyunca% 1 eozin ile lekeleyin, ardından seri inkübasyon. İşiniz bittiğinde, slaytları 15 mikrolitre nötr sakız ve 24 x 50 milimetrelik bir kapak kayması kullanarak kapatın.

İmmünofloresan için, antijen alımı için slaytı antijen geri kazanım çözeltisine yerleştirerek düdüklü tencerede dört dakika boyunca yüksek basınç altında kaynatın. Ardından, beş dakika boyunca damıtılmış suyla ve beş dakika boyunca PBS ile iki kez durulamadan önce slaydı doğal olarak oda sıcaklığına soğutun. Hücreleri geçirgenleştirmek için, slaydı PBS'de% 0.25 Triton X-100'ün 500 mikrolitresinde 10 dakika boyunca inkübe edin ve ardından slaytları PBS ile beş dakika boyunca üç kez durulayın.

Antijen blokajı için, numuneyi bir saat boyunca 300 mikrolitre% 3 sığır serum albümini veya BSA ile ve PBST'de% 3 BSA'daki birincil antikorlarla 16 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, dokuların kurumasını önlemek için slaydı nemlendirilmiş bir kutuya koyun. Slaytları 30 dakika boyunca doğal olarak oda sıcaklığına ısıtın.

Birincil antikoru atın, ardından slaytı PBST'de beş dakika boyunca üç dakika durulayın. Sekonder antikorları %3 BSA ve PBST ile seyreltin. Daha sonra numuneyi seyreltilmiş ikincil antikorlarla 37 santigrat derecede bir ila iki saat boyunca inkübe edin.

Numuneyi PBST'de beş dakika boyunca beş kez duruladıktan sonra, çekirdekleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 50 mikrolitre DAPI ile lekeleyin. Kapak kapağını solmaya karşı montaj ortamıyla monte edin ve kapak kapağını oje ile kapatın. Akış sitometrisi için, fare testislerini altı santimetre Petri kaplarında toplayın ve cerrahi makas kullanarak testisleri bir milimetreküp parçaya bölün.

Daha sonra testisleri bir mililitre% 1 kollajenaz içinde 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpünde 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca sindirin. Spermatojenik hücreleri çökeltmek için, numuneyi beş dakika boyunca 1.000 G'de santrifüj edin ve numuneye 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca bir mililitre% 0.25 tripsin EDTA çözeltisi eklemeden önce süpernatantı atın. Daha sonra, numuneyi beş dakika boyunca 1.000 G'de santrifüj edin.

Çökeltilmiş hücreleri dört santigrat derecede sekiz saatten fazla bir süre boyunca bir mililitre% 70 soğuk etanol ile inkübe etmek için süpernatantı atın. Beş dakika boyunca 1.000 G'de santrifüjlemeden sonra, hücre tortularını toplayın ve spermatojenik hücreleri 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede 500 mikrolitre propidyum iyodür veya PI boyama çözeltisi ile boyayın. İnkübasyondan sonra, hücre kalıntılarını ortadan kaldırmak için numuneyi 300 ağlı bir ekran kullanarak filtreleyin ve hücreleri dört santigrat derecede depolamak için hücreleri bir akış tüpünde toplayın.

Bir akış sitometresi kullanarak 488 nanometrede uyarma dalga boyunda floresan sinyallerini ve ışık saçılımını tespit edin. ModFit MF LT 32 yazılımını kullanarak numunedeki DNA içeriğini ve ışık saçılımını analiz edin. Testis GSK923295 enjeksiyonundan sonra, CENP-E inhibisyonuna bağlı olarak seminifer tübüllerde spermatojenik dalga değiştirildi.

Bununla birlikte, seminifer tübüllerdeki spermatojenik dalga kontrol grubunda düzenli ve organizeydi. Birkaç homolog kromozomun CENP-E inhibisyonundan sonra ekvator plakasında hizalanmadığı gözlendi. Ayrıca, CENP-E inhibisyonu seminifer tübüllerde metafaz I spermatositlerin artmasına neden olmuştur.

İmmünofloresan analizi, CENP-E inhibisyonundan sonra seminifer tübül başına anti-sinaptonemal kompleks protein üç veya SYCP3 pozitif hücre sayısının azaldığını göstermiştir. Öte yandan, metafaz hücresi başına SYP3 noktaları ve hücre başına SYP3 uzantıları GSK92395 gruplarında etkilenmedi. Metafaz I spermatositlerde iğ kutuplarının mesafeleri CENP-E inhibisyonu nedeniyle artmıştır.

Temsili analiz, CENP-E inhibisyonunun GSK 923295 grubundaki haploid hücrelerin kontrole kıyasla azalmasına neden olduğunu göstermektedir. Diploid hücrelerin ve anöploidi hücrelerinin oranları CENP-E inhibisyonundan sonra anlamlı olarak etkilenmedi. Tersine, tetraploid hücrelerin oranları GSK923295 grubunda kontrol grubundan daha fazla artmıştır.

Spermatojenik hücrelerin transmisyon elektron mikroskobu analizi, GSK923295 grubundaki spermatojenik hücrelerin bozulmuş organizasyonunu gösterdi. Deneyci karın cerrahisi ve testis enjeksiyonu sırasında enjeksiyon pozisyonuna, ilaç dozuna, enjeksiyon yöntemine ve dikiş yöntemine dikkat etmelidir. Bu teknik, hedeflenen proteinlere odaklanan in vivo elektroporasyon ve gen düzenleme araçları ile birlikte miyotik bölünme ve spermatogenez alanında kullanılabilir.