Siyanobakterilerde Bozulmamış Fitoidinin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Siyanobakterilere aşina olmayan insanların fitobilizomları rahatça izole etmelerini sağlayan basit ve hızlı bir protokoldür. Bu tekniğin avantajı küçük bir ölçeğe uyarlanmış olması ve yapımının kolay olmasıdır. Model ve model dışı sikobakterilerin bozulmamış fitoidizomlarını izole etmek için basit, güvenilir ve verimli bir yöntemdir.

750 nanometrede 0,8 OD hücre kültürünü bir litrelik bir şişeye aktararak başlayın ve 750 nanometrede 0,2 OD elde etmek için 500 mililitre B-HEPES ortamında seyreltin. OD 0,8'e 1'e ulaşana kadar kültürü 30 santigrat derecede sürekli karıştırarak büyütün, bu da geç üstel büyüme aşamasını gösterir. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca kültürü 10.000 kez g hızında santrifüjleyin ve üst kısmı atın.

Hücre peletlerini askıya alın ve 0.75 molar potasyum fosfat tamponu, pH yedi ile iki kez yıkanın. 50 mililitrelik santrifüj tüpündeki hücreleri oda sıcaklığında santrifüjle peletle. Süpernatant atın ve hücreleri 0,75 molar potasyum fosfat tamponu ile yeniden biriktirin.

Peletin ıslak ağırlığını elektronik bir terazi ile ölçün ve peletin bir gram ıslak ağırlığını tamponun beş mililitresine yeniden harcayın. İki mililitrelik vidalı kapak şişesine bir mililitre hücre süspansiyonu ve 0,4 ila 0,6 gram 0,1 milimetre cam boncuk ekleyin. Hücreleri bir boncuk çırpıcı ile 30 saniye boyunca kırın.

Tüplerin oda sıcaklığındaki su banyosunda iki dakika soğumasını bekleyin. Lizizden sonra, şişeleri oda sıcaklığında 500 kez g hızında 10 saniye santrifüjlayın. 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne pipet ile süpernatant toplayın.

Boncukları bir kez 0,5 mililitre 0,75 molar potasyum fosfat tamponu ile yıkayın, ardından aynı santrifüj tüpüne aktarın. Lizli hücre süspansiyonu için Triton X-100 ekleyin ve oda sıcaklığında sallanan bir çalkalayıcıya ve 20 dakika boyunca veya çözelti homojen hale gelene kadar 40 RPM'ye inkübe edin. Tüpleri 17, 210 kez g'da 20 dakika santrifüjleyin ve üst Triton misel tabakası olmadan süpernatantı oda sıcaklığında bir saate kadar saklayın.

pH yedide 0,75 molar potasyum fosfat tamponunda dört konsantrasyon sakkaroz yapın. 40 mililitre santrifüj tüpünün altına 2,8 mililitre iki azı dişi sakkaroz tamponu yerleştirin ve üç kat sakkaroz çözeltisi ile kaplama yapın. Son olarak, süpernatant fraksiyonu içeren üç mililitre PBS ekleyin ve elde edilen degradeleri santrifüjleyin.

Ultra merkezileştirme üzerine, katmanlar arasında kesirli PBS ve fitobiliproteinleri yoğunlaştırın ve Syn6803 ve arayüzlerdeki mavi bantları gözlemleyin. Fraksiyonları 0,75 molar potasyum fosfat tamponu ile tekrar tekrar konsantre ederek ve seyrelterek sakkarozu çıkarın ve santrifüj filtre ünitelerini membranleyin. PBS floresanını ölçmek için konsantre PBS örneğini 0,75 molar potasyum fosfat tamponu ile seyrelterek 500 mikrolitre hacmine kadar yapın.

Seyreltilmiş PBS örneğini şeffaf bir cam tüpe ekleyin ve tüpü tamamen donana kadar sıvı nitrojen içinde dondurun. Donmuş tüpü sıvı nitrojenle önceden doldurulmuş şeffaf bir savaş kabına taşıyın. Komple hücre lizisi, merkezlenmeden önce süpernatant ve koyu mavi-yeşil rengi gösterir.

İzole PBS'nin sakkaroz yoğunluğu gradyan ayrımı, ayrışmış fitobiliproteinlerin birkaç fraksiyonunu gösterir ve en düşük fraksiyon sağlam PBS'yi temsil eder. JSC one ve Syn6803'ün ayrışmış ve bozulmamış PBS'sinden emilim spektrumu, phycocyanin'e karşılık gelen 622 nanometrede aynı tepeye sahiptir. Ayrıca, JSC-1'in hem ayrışmış hem de bozulmamış PBS'sinde 571 nanometrede fitoerythrin emilimi zirvesi.

Ayrışmış PBS'nin emisyon spektrumu, phycocyanin emisyonunu temsil eden Syn6803 ve JSC-1'de yaklaşık 650 nanometrede güçlü bir tepeye sahiptir. Floresan emisyon maksimal 651 nanometre ve 684 nanometredeki zirveler, fitokyanin tarafından hasat edilen enerjinin çekirdekteki ApcD ve ApcE olan allophycocyanin ve terminal yayıcılarına verimli bir şekilde aktarıldığını ortaya koymaktadır. Şekil, fitobiliprotein alt ünlemlerinin güçlü bir şekilde floresan olduğu ve ApcE'nin okla belirtilen zayıf floresan gösterdiği UV ışınlaması altında çinko lekeli SDS-PAGE'i göstermektedir.

Kumasi mavi boyama, üst fraksiyonların diğer PBS olmayan suda çözünür proteinler içerdiğini ve bozulmamış PBS ve Syn6803'ün, ayrışmış PBS fraksiyonlarında eksik olan, okla gösterilen belirgin bir ApcE bandı gösterdiğini göstermektedir. Ultrasantrifüjleme, 1:3 oranında hazırlanan sakkaroz gradyanın 1:10 oranında yapılan degradeden daha geniş bantlar gösterdiğini göstermektedir. Daha fazla fitoidom elde etmek için hücreleri liziz ve süpernatantları tamamen solvoliz etmek önemlidir.

Kriyo-EM veya karışık spektrometre gibi diğer yöntemler, fitoidizomların protein yapısını veya protein bileşimini incelemek için kullanılabilir.