Name: Hücresel Metabolizmayı Değerlendirmek için Otofloresan Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Öğrenin NAD(P)H ve FAD otofloresan görüntülemeyi hücresel metabolizmayı değerlendirmek için. Bu etiketsiz, yıkıcı olmayan yöntem canlı örneklerde ve zaman kursu çalışmalarında kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansman kaynakları arasında Teksas Kanser Önleme ve Araştırma Enstitüsü (CPRIT RP200668) ve Texas A & M Üniversitesi bulunmaktadır. Şekil 1, BioRender.com ile oluşturulmuştur.

1. Görüntüleme için hücre kaplaması
<ol><li><li><li><li><li></li><li></li><li><li> </li></ol><ol><li><li><ol><li><li><li><li></li></ol></li><li><ol><li> </li><li><ol><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li><li><li><li><li><li> </li></ol></li></ol></li><li><ol><li> </li><li> </li><li> </li><li><li> </li><li> </li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li> </li><li><li> </li><li><li><li> </li></ol></li><li></ol><ol><li> </li><li><li><li> </li></ol><ol><li><ol><li><li></li><li><ol><li></li></ol></li></ol></li><li><ol><li><li><ol><li></li></ol></li><li><ol><li></li></ol></li><li><ol><li> </li></ol></li><li><li> </li><li><ol><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li></li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63282/63282fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63282/63282fig02large.jpg" target="_blank"></a><ol start="3"><li> <ol><li></li><li></li><li> </li><li> <ol><li></li><li> </li><li> </li><li> </li><li></li><li> </li></ol></li><li></ol></li></ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63282/63282fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63282/63282fig03large.jpg" target="_blank"></a><ol><li> <ol><li><li> </li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li> </li><li></ol></li><li><ol><li> </li><li> </li><li><li> </li><li> </li><li></ol></li><li><ol><li><li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li><li></ol></li></ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Otofloresan yoğunluğu ve ömür boyu görüntüleme, hücrelerdeki metabolizmayı değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır21,55. FLIM yüksek çözünürlüktedir ve bu nedenle kanser çalışmaları için önemli olan tek hücreleri çözer, çünkü hücresel heterojenlik tümör saldırganlığına ve ilaç direncine katkıda bulunur7,39,41,44,45,46,58.<sup...

Metabolizma, enerji üretmenin hücresel sürecidir. Hücresel metabolizma, glikoliz, oksidatif fosforilasyon ve glutaminoliz dahil olmak üzere birçok yolu kapsar. Sağlıklı hücreler, bağışıklık hücreleri tarafından sitokinlerin üretimi gibi çoğalma ve işlev için enerji üretmek için bu metabolik yolları kullanır. Metabolik bozukluklar, kanser ve nörodejenerasyon dahil olmak üzere birçok hastalık, değişmiş hücresel metabolizma ile karakterizedir1. Örneğin, bazı kanser hücresi tipleri, nükleik asitlerin, proteinlerin ve lipitlerin sentezi için moleküller üretmek üzere oksijen varlığında bile glikoliz oranlarını yükseltmiştir2,3. Warburg etkisi olarak bilinen bu fenomen, meme kanseri, akciğer kanseri ve glioblastomlar dahil olmak üzere birçok kanser türünün ayırt edici özelliğidir4. Kanser progresyonu ile ilişkili hücresel metabolizmadaki değişiklikler nedeniyle, hücresel metabolizma ilaç yanıtı için vekil bir biyobelirteç olabilir5,6. Ayrıca, hücre heterojenliği bireylerde farklı ilaç yanıtlarına yol açabileceğinden, ilaç etkinliğini hücresel düzeyde anlamak çok önemlidir7,8.
Hücresel metabolizmadaki değişiklikleri tanımlayan ve ölçen teknolojiler, kanser ve ilaç yanıtı çalışmaları için gereklidir. Kimyasal ve protein analizleri, hücrelerin veya dokuların metabolizmasını değerlendirmek için kullanılır, ancak tek hücreli çözünürlük ve mekansal bilgiden yoksundur. Metabolik plaka okuyucu tabanlı testler, numunedeki pH ve oksijen tüketimini zaman içinde ve ardından kimyasallar tarafından metabolik bozulmayı ölçebilir. PH, hücrelerin glikolitik aktivitesi hakkında bir fikir veren hücre dışı asitleşme oranını (ECAR) hesaplamak için kullanılabilir9. 2-[flor-18] floro-D-glukoz pozitron emisyon tomografisi (FDG PET) ve manyetik rezonans spektroskopisi (MRS) dahil olmak üzere tüm vücut görüntüleme yöntemleri, metabolik ölçümler yoluyla tümör nüksünü ve ilaç etkinliğini tanımlamak için klinik olarak kullanılan noninvaziv görüntüleme yöntemleridir10,11,12,13,14.
FDG-PET, RADYO-etiketli bir glikoz analoğu olan FDG'nin doku alımını görüntüler. Tümörler tarafından çevre dokuya göre FDG-PET alımının artması, Warburg etkisinden kaynaklanmaktadır12,13. MRS, 13C ve 31P gibi metabolizma için kullanılan moleküllerin ortak çekirdeklerini görüntüler ve metabolizmanın egzersiz veya yemek yeme gibi uyaranlara yanıt olarak nasıl değiştiği hakkında dinamik bilgiler elde edebilir14. FDG-PET ve MRS klinik olarak kullanılabilse de, bu teknolojiler intratümöral heterojenliği çözmek için uzamsal çözünürlükten yoksundur. Aynı şekilde, oksijen tüketimi ölçümleri büyük miktarda hücre popülasyonu üzerinde yapılır. Otofloresan görüntüleme, bu teknolojilerin mekansal çözünürlük engelinin üstesinden gelir ve hücresel metabolizmayı ölçmek için invaziv olmayan bir yöntem sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63282/63282fig01v2.jpg"> Şekil 1: Ortak metabolik yollarda NADH ve FAD. NADH ve FAD, glikoliz, Krebs döngüsü ve elektron taşıma zincirinde kullanılan koenzimlerdir. Bu moleküllerin otofloresan görüntülemesi hücresel metabolizma hakkında bilgi sağlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63282/63282fig01largev2.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
İndirgenmiş nikotinamid adenin (fosfat) dinükleotid (NAD (P) H) ve oksitlenmiş flavin adenin dinükleotid (FAD), glikoliz, oksidatif fosforilasyon ve glutaminoliz dahil olmak üzere metabolik reaksiyonların koenzimleridir (Şekil 1). Hem NAD(P)H hem de FAD otofloresandır ve floresan görüntüleme için endojen kontrast sağlar1,15. NADPH, NADH'ye benzer floresan özelliklere sahiptir. Bu nedenle, NAD (P) H genellikle NADH ve NADPH2,16'nın birleşik sinyalini temsil etmek için kullanılır.
Floresan ömür boyu görüntüleme (FLIM), floresan ömrünü veya bir floroforun uyarılmış durumda olduğu süreyi ölçer. Floresan ömürleri, floroforların mikro ortamına duyarlıdır ve hücresel metabolizma hakkında bilgi sağlar17. NAD (P) H ve FAD, her biri farklı bir ömre sahip olan proteine bağlı veya serbest konformasyonlardaki hücrelerde bulunabilir. Serbest NAD (P) H, proteine bağlı NAD (P) H'den daha kısa bir ömre sahiptir; tersine, serbest FAD, bağlı FAD18,19'dan daha uzun bir ömre sahiptir. Yaşam süreleri ve ömür boyu bileşen ağırlıkları, floresan ömür boyu bozunma verilerinden Ek. (1)20 aracılığıyla ölçülebilir:
I(t) = α 1e-t/τ1 + α 2e-t/τ2 + C (1)
Eq (1), zamanın bir fonksiyonu olarak normalleştirilmiş floresan yoğunluğunu temsil eder. Bu denklemdeki α 1 ve α 2, sırasıyla kısa ve uzun ömürlerin orantılı bileşenlerini temsil eder (α 1+ α 2=1), τ1 ve τ2 sırasıyla kısa ve uzun ömürleri temsil eder ve C, arka plan ışığını7,20 oluşturur. Burada τm olarak temsil edilen genlik ağırlıklı yaşam süresi, Ek. (2) kullanılarak hesaplanır.
τm= α 1τ1+ α 2τ2 (2)
Ortalama bir ömür, floroforun yoğunluk bozunumu üzerinde ortalama "t" ile hesaplanabilir, bu da iki üstel bir bozunma için Eq. (3) 17,21 ile gösterilir.
τ*m= (α 1τ12+ α 2τ22)/ (α 1τ1+ α 2τ2) (3)
Bir floresan yoğunluğu görüntüsü, floresan ömür boyu bozunumu entegre edilerek ömür boyu görüntüden hesaplanabilir. Otofloresan görüntüleme, canlı hücrelerin metabolizmasını hücre altı çözünürlükte karakterize etmek için kullanılabilecek tahribatsız ve etiketsiz bir yöntemdir. Optik redoks oranı, hücrenin kimyasal redoks durumunun optik analog metriğini sağlar ve NAD (P) H ve FAD yoğunluklarının oranı olarak hesaplanır. Optik redoks oranının hesaplanması için formül standartlaştırılmamış olsa da22,23,24,25, burada NAD (P) H ve FAD'nin birleşik yoğunlukları üzerindeki FAD yoğunluğu olarak tanımlanmaktadır. Bu tanım kullanılır, çünkü paydadaki toplam yoğunluk metriği 0 ile 1 arasında normalleştirir ve siyanür inhibisyonunun beklenen sonucu redoks oranında bir azalmadır. Serbest NAD(P)H ve FAD'ın floresan ömürleri, pH, sıcaklık, oksijene yakınlık ve ozmolarite dahil olmak üzere metabolik çözücü mikro ortamındaki değişiklikler hakkında fikir verir17.
NAD(P)H ve FAD'nin bağlı fraksiyonlarının floresan ömründeki değişiklikler, metabolik yol kullanımını ve substrata özgü metabolizmayı gösterebilir26. Komponent ağırlıkları, koenzimlerin serbest ila bağlı fraksiyonundaki değişiklikler için yorumlanabilir18,19. Toplamda, bu kantitatif otofloresan yaşam boyu metrikleri hücresel metabolizmanın analizine izin verir ve otofloresan görüntüleme normal dokulardan neoplazmları tanımlamak27,28, kök hücreleri karakterize etmek29,30, bağışıklık hücresi fonksiyonunu değerlendirmek31,32,33,34,35, nörolojik aktiviteyi ölçmek için kullanılmıştır36, 37,38 ve meme kanseri ve baş boyun kanseri gibi kanser türlerinde ilaç etkinliğini anlamak21,39,40,41,42. Yüksek çözünürlüklü otofloresan görüntüleme, tek hücreli analiz ve popülasyon içi heterojenitenin nicelleştirilmesi için görüntü segmentasyonu ile birleştirilebilir43,44,45,46,47.
NAD (P) H ve FAD, yoğunluk veya ömür boyu görüntüleme için yapılandırılmış tek fotonlu veya çok fotonlu floresan mikroskoplarda görüntülenebilir. Tek fotonlu mikroskoplar için, NAD (P) H ve FAD, bu dalga boylarındaki ortak lazer kaynakları nedeniyle, sırasıyla 375-405 nm ve 488 nm dalga boylarında tipik olarak uyarılır48. İki fotonlu floresan uyarımında, NAD (P) H ve FAD sırasıyla yaklaşık 700 ila 750 nm ve 700 ila 900 nm dalga boylarında uyaracaktır, 15,49. Floroforlar uyarıldığında, NAD (P) H ve FAD sırasıyla ~ 410 nm ila ~ 490 nm ve ~ 510 nm ila ~ 640 nm arasındaki dalga boylarında fotonlar yayar15. NAD (P) H ve FAD maksimuma emisyon dalga boyları sırasıyla yaklaşık 450 nm ve 535 nm'dir48.
Farklı uyarma ve emisyon dalga boyları nedeniyle, iki metabolik koenzimin floresansı spektral olarak izole edilebilir. NAD(P)H ve FAD'ın spektral özelliklerinin anlaşılması, otofloresan görüntüleme protokollerinin tasarımı ve optimizasyonu için gereklidir. Siyanür bir elektron taşıma zinciri (ETC) kompleks IV inhibitörüdür. Siyanürün hücresel metabolizma üzerindeki etkileri ve hücrelerdeki NAD(P)H ve FAD'ın otofloresan yoğunlukları ve ömürleri iyi karakterize edilmiştir27,40. Bu nedenle, bir siyanür pertürbasyon deneyi, NAD (P) H ve FAD görüntüleme protokollerini doğrulamak için etkili bir araçtır. Başarılı bir siyanür deneyi, NAD (P) H ve FAD görüntüleme protokolünün bilinmeyen grupların veya bozulmaların metabolizmasını değerlendirmek için kullanılabileceğine dair güven sağlar.

<table><tbody><tr><td>2-deoksi-d-glukoz (2-DG)</td><td>Sigma</td><td>AC111980000; AC111980010; AC111980050; </td><td></td>AC111980250</tr><tr><td>Antibiyotik Antimikrobiyal (pen-strep)</td><td>Gibco</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Örnekleri</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>N/A</td><td>MCF-7 kanser hattı</td></tr><tr><td>CellProfiler</td><td>Broad Institute</td><td>N/A</td><td>Görüntü analiz yazılımı</td></tr><tr><td>Konik Boru</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>15 mL konik tüp</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td>Kültür ortamı</td></tr><tr><td>FAD dikroik ayna</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td>495 nm</td></tr><tr><td>FAD emisyon filtresi</td><td>Semrock</td><td>FF01-550/88-25</td><td>550/88 nm</td></tr><tr><td>FAD uyarma filtresi</td><td>Semrock</td><td>FF01-458/64-25</td><td>458/64 nm</td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher</td><td>16000036</td><td></td></tr><tr><td>Floresan Ömür Boyu Mikroskop</td><td>3i</td><td>Yok</td><td></td></tr><tr><td>Cam alt çanak</td><td>MatTek Corp</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Çoklu Foton Lazer</td><td>Tutarlı</td><td>N/A</td><td>2P Tutarlı Lazer, Ayarlanabilir 680 nm-1080 nm</td></tr><tr><td>NAD(P)H dikroik ayna</td><td>Semrock</td><td>FF409-Di03-25x36</td><td>409 nm</td></tr><tr><td>NAD(P)H emisyon filtresi</td><td>Semrock</td><td>FF02-447/60-25</td><td>447/60 nm</td></tr><tr><td>NAD(P)H uyarma filtresi</td><td>Semrock</td><td>FF01-357/44-25</td><td>357/44 nm</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Siyanür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>380970</td><td></td></tr><tr><td>SlideBooks 6</td><td>3i N</td><td>/A</td><td>Görüntü elde etme yazılımı</td></tr><tr><td>SPCImage</td><td>Becker & Hickl GmbH</td><td>N/A</td><td>Floresan ömür boyu analiz yazılımı</td></tr><tr><td>Aşama Üst İnkübatör</td><td>okoLab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Biosciences</td><td>786-262</td><td></td></tr><tr><td>Üre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>YG boncuk</td><td>Polysciences</td><td>19096-2</td><td>Yg mikroküreler (20.0 ve mikro; m)</td></tr></tbody></table>

hücresel metabolizmayı değerlendirmek için otofloresan görüntüleme

Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism

Hücresel metabolizma, hücrelerin enerji ürettiği süreçtir ve kanser de dahil olmak üzere birçok hastalık anormal metabolizma ile karakterizedir. İndirgenmiş nikotinamid adenin (fosfat) dinükleotid (NAD(P)H) ve oksitlenmiş flavin adenin dinükleotid (FAD) metabolik reaksiyonların koenzimleridir. NAD (P) H ve FAD otofloresan sergiler ve uyarma ve emisyon dalga boyları ile spektral olarak izole edilebilir. Her iki koenzim, NAD (P) H ve FAD, her biri ayrı bir floresan ömrüne sahip olan serbest veya proteine bağlı bir konfigürasyonda bulunabilir - floroforun uyarılmış durumda kaldığı süre. Floresan ömür boyu görüntüleme (FLIM), hücresel metabolizmanın etiketsiz analizi için NAD (P) H ve FAD'nin floresan yoğunluğunun ve ömürlerinin ölçülmesini sağlar. Floresan yoğunluğu ve ömür boyu mikroskoplar, uygun uyarma ve emisyon dalga boyları seçilerek NAD(P)H ve FAD'yi görüntülemek için optimize edilebilir. Siyanür ile metabolik pertürbasyonlar, hücrelerdeki metabolik değişiklikleri tespit etmek için otofloresan görüntüleme protokollerini doğrular. Bu makalede, hücresel metabolizmayı ölçmek için NAD (P) H ve FAD'nin otofloresan görüntüleme tekniği gösterilecektir.

Epitelyal meme kanseri hücre hattı MCF-7, DMEM'de fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenerek kültüre alındı. Floresan görüntüleme için, hücreler görüntülemeden 48 saat önce 35 mm cam tabanlı görüntüleme kabı başına 4 × 105 hücre yoğunluğunda tohumlandı. Hücreler, yukarıda belirtilen protokoller kullanılarak siyanür tedavisinden önce ve sonra görüntülendi. Siyanür deneyinin amacı, NAD (P) H ve FAD floresansının spektral izolasyonunu doğrulamak ve hücrelerdeki metabolik değişiklikle...

Bu protokol, endojen metabolik koenzimlerin, indirgenmiş nikotinamid adenin (fosfat) dinükleotid (NAD (P) H) ve oksitlenmiş flavin adenin dinükleotidin (FAD) floresan görüntülemesini ve analizini tanımlar. NAD(P)H ve FAD'ın otofloresan görüntülemesi, hücresel metabolizmayı değerlendirmek için etiketsiz, tahribatsız bir yöntem sağlar.

Hücresel Metabolizmayı Değerlendirmek için Otofloresan Görüntüleme

Cellular metabolism is the process by which cells generate energy, and many diseases, including cancer, are characterized by abnormal metabolism. Reduced ...

ADH ve FAD, farklı uyarma ve emisyon dalga boylarında otofloresan sergileyen endojen moleküllerdir. Metabolik reaksiyonların ko-enzimleri olarak kullanılmaları nedeniyle, otofloresan mikroskobu hücresel metabolizmayı değerlendirebilir. NADH ve FAD'nin otofloresan görüntülemesi eksojen etiketler gerektirmez ve hücre altı çözünürlükte tahribatsız bir yöntemdir.Otofloresan mikroskopisi canlı örneklerde ve zaman kursu çalışmalarında kullanılabilir. Otofloresan görüntüleme, herhangi bir canlı hücreye veya dokuya geniş çapta uygulanabilir. Otofloresan görüntüleme nöron, kanser hücresi, tümör, in-vivo, kök hücre ve bağışıklık hücrelerinde kullanılmıştır.Prosedürü gösteren, Texas A & M Üniversitesi'ndeki Kantitatif Optik Görüntüleme Laboratuvarı'ndan yüksek lisans öğrencisi olan Linghao Hu olacak. Lazer kaynağı ve dedektörler de dahil olmak üzere çoklu foton floresan ömür boyu mikroskobunun tüm bileşenlerini açarak deneye başlayın. Numune yerleştirmeden önce, parlak alan lambasını açın ve ışığın göz merceğinin içine girdiğinden emin olun.Ardından, hücre görüntüleme için bir hedef seçin. Bir hava hedefi kullanmıyorsanız, hedefin üzerine uygun daldırma ortamından bir damla uygulayın. Cam tabanlı kabı mikroskop aşamasındaki numune tutucuya yerleştirin.Ardından, X/Y aşama kontrolünü kullanarak numuneyi hedefle ortalayın Numunenin güvenli olduğundan ve görüntüleme sırasında hareket etmeyeceğinden emin olun. İşiniz bittiğinde, göz merceğine bakın ve hücrelere odaklanmak için hedefi yukarı doğru hareket ettirin. Mikroskop bir mahfaza içindeyse, ışık kutusu kapağını kapatın.Ardından, görüntü alma yazılımını açın ve çoklu foton görüntüleme parametrelerini makalede açıklandığı gibi ayarlamak için Çoklu Foton Görüntüleme sekmesine tıklayın. Dedektörün kazancını, floresan ömrü görüntüleme veya FILM için en uygun değere ayarlayın. Ardından, numunenin her pikselindeki lazer harcamasının bekleme süresini istenen değere değiştirin.Nikotinamid adenin fosfat dinükleotid veya NADPH için, çoklu foton lazeri 750 nanometreye ayarlayın. Ardından, lazerin güç kontrolünün sıfıra ayarlandığını onaylayın, böylece lazer üzerindeki deklanşör açıldığında hücreler zarar görmez. Bir emisyon filtresini 400 ila 500 nanometreye ayarlayın.Parametreler ayarlandığında, görüntü ayarlarını optimize etmek için odaklama veya canlı görüntü biçiminde görüntülemeye başlayın. Hücrelerin odaklandığından emin olurken lazer gücünü yavaşça üç ila sekiz miliwatt artırın. Ayarlandıktan sonra, kullanılan maksimum gücü kaydedin.Petri kabının diğer segmentlerinde görüntüleme için kaydedilen maksimum güç ayarını kullanın. Görüntü entegrasyon süresi 60 saniye olan bir NADPH-FILM görüntüsü toplayın ve görüntünün, floresan ömrü bozunma eğrisi içindeki bir sitoplazma pikseli için 100 fotonun zirvesi gibi yeterli sayıda fotona sahip olup olmadığını kontrol edin. Foton sayısı çok düşükse, lazer gücünü veya görüntü alma süresini artırın.Flavin adenin dinükleotid veya FAD, görüntüleme için, çoklu foton lazeri 890 nanometreye ayarlayın ve lazerin yeni dalga boyunda mod kilitlemesini bekleyin. Lazer için güç kontrolünün başlangıçta sıfıra ayarlandığından emin olun. Bir emisyon filtresini 500 ila 600 nanometre olarak ayarlayın.Görüntü ayarlarını optimize etmek için, lazer gücünü 5 ila 10 miliwatt'a çıkararak ve kullanılan maksimum gücü kaydederek odaklama veya canlı görüntü şeklinde görüntülemeye başlayın. Sonraki görüş alanlarının FAD görüntülemesi için aynı güç ayarını kullanın. FAD-FILM görüntüsünü 60 saniyelik bir görüntü entegrasyon süresiyle toplayın ve görüntünün floresan ömrü bozunma eğrisi içinde yeterli foton olup olmadığını kontrol edin.Foton sayısı çok düşükse, lazer gücünü veya görüntü alma süresini artırın ve görüntülemeyi, her görüntü iki FOV uzağında aralıklı olarak dört ila beş görüş alanı veya FOV için tekrarlayın. 80 milimolar sodyum siyanür çözeltisi yapmak için, 25 mililitre PBS içinde 130.24 miligram sodyum siyanür çözün. Kültür kabından, çanakta dört milimolar bir siyanür konsantrasyonu elde etmek için 100 mikrolitre sodyum siyanür çözeltisi ile değiştirmek üzere 100 mikrolitre kültür ortamını aspire edin.Hücrelerin siyanür çözeltisi ile reaksiyona girmesine izin vermek için hücreleri beş dakika boyunca bir inkübatöre koyun. Siyanür maruziyetinden sonra, daha önce açıklandığı gibi hücrelerin NADPH ve FAD görüntülerini elde edin. Çalışma, üreden ölçülen cihaz yanıt fonksiyonunu veya IRF'yi kullanarak floresan ömür boyu parametrelerini hesapladı.Parametrelerin, segmentasyon için kullanılan her hücrenin sitoplazmasının pikselleri boyunca ortalaması alındı. Arka plan gürültüsünü ortadan kaldırmak için tek tek hücreler tanımlandı ve maskelendi. Daha sonra, çekirdek tanımlandı ve hücre maskesine yansıtıldı.Ayrıca, hücreler, tipik hücrelerin boyutuna uymayan maskeli alanları çıkarmak için filtrelendi. NADPH ve FAD'ın çoklu foton floresan ömür boyu görüntülemesi, siyanür tedavisinden önce ve sonra hücre morfolojisinin ve metabolizmasının görselleştirilmesine izin verdi. Siyanür tedavisi ile NADPH ömrünün azaldığı, siyanür tedavisi sonrası FAD ömrünün arttığı gözlenmiştir.Temsili kutu grafiği, MCF7 hücrelerinin optik redoks oranının siyanür işleminden sonra azaldığını göstermiştir. Siyanür maruziyeti, MCF7 hücrelerinin genlik ağırlıklı NADPH ömrünü azalttı. Kısa ve uzun ömürler NADPH için azaldı, ancak NADPH alfa biri için arttı.FAD için, MCF7 hücrelerinin genlik ağırlıklı ömrü, siyanür maruziyetinden sonra artmıştır. Hem kısa hem de uzun ömürler FAD için arttı, ancak FAD alfa için azaldı. Numunelere giden yeterli lazer gücüne sahip olmak önemlidir, ancak unutmayın, çok fazla güç hücrelere zarar verebilir.Otofloresan görüntüleme hücrelere zarar vermediğinden, aynı numunelerde sonraki biyokimyasal testler kullanılabilir.

autofluorescence-imaging-to-evaluate-cellular-metabolism

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bozulma ve geri dönüşüm için maya vakuol asidik lümen organelleri teslim izlemek için sağlam bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yöntem, genetik olarak kodlanmış çift emisyon floresan pH biyosensör ve floresan mikroskobu kullanarak tek tek hücrelerin görselleştirme hedef organellerin özel etiketleme dayanmaktadır.

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Mitokondriyal füzyon zamanla mitokondriyal ağ üzerinden photoconverted matris hedefli YFP dengelenme izleme ölçüldü. Şimdiye kadar, sadece bir hücre bir anda bir saat uzun kinetik analizine tabi olabilir. Biz aynı anda böylece veri toplama işlemini hızlandıracak, birden çok hücre ölçen bir yöntem sunuyoruz.

Paralel Konfokal Mikroskop kullanarak birden fazla Hücre Kinetik Veri Kazanılması A Daha hızlı, Yüksek Çözünürlük, MTPA-GFP tabanlı Mitokondrial Füzyon Deneyi

Biyomoleküllerin in vivo çalışmaları, biyolojik bağlamda moleküler işlevi anlamak için çok önemlidir. Burada, DNA veya proteinler gibi floresan biyomoleküllerin canlı mikroorganizmalara içselleştirilmesine izin veren yeni bir yöntemi açıklıyoruz. Floresan mikroskobu ile kaydedilen in vivo verilerin analizi de sunulmakta ve tartışılmaktadır.

Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem

Biz Förster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı readouts kullanarak protein etkileşimleri tahlil için otomatik floresans ömrü görüntüleme (Flim) kullanan açık kaynak kodlu bir yüksek içerik analizi (HCA) aleti sunuyoruz. Bu openFLIM-HCA cihaz için veri toplama yazılımı μManager yazılır ve veri analizi FLIMfit üstlenilmiştir tarafından kontrol edilir.

Otomatik Flüoresans Ömrü Görüntüleme Mikroskopi kullanmak Open Source Yüksek İçerik Analizi

Burada, otofajiyi objektif, kantitatif ve istatistiksel olarak sağlam bir şekilde ölçmek için, 3 autofagy markörün parlak detaylı görüntülerini karşılaştıran ve LC3 nokta sayımı ile birlikte lokalizasyonunu niceleyen analitik bir özelliğe sahip multispektral görüntüleme akış sitometrisi kullanılmıştır.

Multifektral Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanılarak LC3, p62 ve LAMP1 Birlikte Lokalizasyonu Ölçülerek Otofajik Fluxın Değerlendirilmesi

Bu teknik, floresan tabanlı canlı görüntüleme kullanarak HeLa hücrelerindeki mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini görselleştirmek ve nicel olarak ölçmek için etkili bir iş akışını tanımlar.

HeLa hücrelerinde canlı görüntüleme kullanılarak mitokondriyal membran potansiyelinin ve süperoksit seviyelerinin floresan bazlı ölçümü

Burada, takip çok parametreli canlı hücre mikroskobu gerçekleştirmek için farklı çok hücreli sferoid oluşturma yöntemlerini açıklıyoruz. Floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM), hücresel otofloresan, boyama boyaları ve nanopartiküller kullanılarak, canlı üç boyutlu (3D) kanser ve kök hücre türevli sferoidlerde hücre metabolizması, hipoksi ve hücre ölümünün analizi için yaklaşım gösterilmiştir.

Çok Hücreli Sferoidlerin Üretimi ve Çok Parametreli Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM)

Etiketsiz optik görüntüleme modalitelerini birleştiren çok modlu bir platform kullanarak, hücresel dinamikleri ve metabolizmayı görselleştirmek ve ölçmek için bir protokol geliştirdik. Çoklu foton floresansı, ikinci harmonik üretimi ve uyarılmış Raman saçılma mikroskobu yoluyla görüntüleme yoluyla, hücresel ve moleküler çevreye bütünsel bir genel bakış oluşturabiliriz.

Hücresel metabolizmayı incelemek için multimodal optik görüntüleme platformu

Bu protokol, lazer ışık kaynağının nasıl oluşturulacağı, bir doku örneğinin nasıl hazırlanacağı, görüntüleme yapılacağı ve verilerin nasıl analiz edileceğine ilişkin ayrıntılar da dahil olmak üzere Eşzamanlı Etiketsiz Otofloresan Çoklu Harmonik (SLAM) mikroskobik teknik için adım adım bir kılavuz sunar. SLAM, doku mikro ortamını araştırmak için dört tamamlayıcı etiketsiz kontrastı ölçerek doğrusal olmayan mikroskobu geliştirir.

Eş Zamanlı Etiketsiz Otofloresan Çoklu Harmonik Mikroskopi

Onlar kendi ana mikroçevresinin geliştikçe birçok biyolojik ve klinik durumlarda hücresel süreçleri incelemek için avantajlıdır. Burada montaj ve hücre kültürü, hayvan çalışmaları ve klinik hasta çalışmaları, gerçek zamanlı görüntüleme sağlayacak bir düşük maliyetli, fiber-optik mikroskop kullanımını tanımlamak.

Yüksek çözünürlüklü Fiber-optik Mikroendoskopi In situ Hücresel Görüntüleme

Öğrenin NAD(P)H ve FAD otofloresan görüntülemeyi hücresel metabolizmayı değerlendirmek için. Bu etiketsiz, yıkıcı olmayan yöntem canlı örneklerde ve zaman kursu çalışmalarında kullanılabilir.

Hücresel Metabolizmayı Değerlendirmek için Otofloresan Görüntüleme

Daha fazla video keşfet