Granül Hücre Öncüsünde Birincil Seyuma Bağımlı Sinyal Yollarını İncelemek için Verimli ve Uygun Maliyetli Elektroporasyon Yöntemi
30 Kasım 2021
Burada, primer serebellar granül hücre öncüllerinin (GCP' ler) genetik manipülasyonu için uygun maliyetli, verimli ve uygulanabilir bir tekrarlanabilir in vitro elektroporasyon protokolü sunuyoruz. Ayrıca, bu protokol ayrıca birincil GCP hücrelerindeki birincil ekyuma bağımlı Kirpi sinyal yollarının moleküler çalışması için basit bir yöntem göstermektedir.
Bu protokol, primer granül hücre öncüsü kültürlerde primer ekium bağımlı sinyal yolunun moleküler çalışması için basit bir in vitro genetik modifikasyon yöntemini göstermektedir. Mevcut transeksiyon yönteminin maliyeti, düşük canlılığı ve düşük verimliliği nedeniyle, birincil GCP kültürlerinde ekyuma bağımlı sinyal yolunu araştırmak için basit, uygun maliyetli ve verimli bir elektroporasyon tekniği sunuyoruz. Başlamak için, kaplamalı kapak kaymaları içeren 24 kuyulu kültür plakasının her kuyusuna 0,5 mililitre kültür ortamı ekleyin ve karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede sıcak tutun.
Gerekli sayıda hücreyi steril 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200x G'de döndürün. Süpernatantı atın ve hücre peletini 200 mikrolitre Opti-MEM'de yeniden dirildi. Tüpte artık kültür ortamı olmadığından emin olmak için bu prosedürü iki kez tekrarlayın.
Elektroporasyon parametrelerini listelendiği gibi ayarlayın. Elektroporasyon reaksiyonunu iyice karıştırmak için hafifçe pipetleyin ve karışımın 100 mikrolitrelik tam hacmini iki milimetrelik boşluk cuvette'e aktarmak için uzun bir P200 pipet ucu kullanın. Cuvette haznenin içine girdikten sonra, elektroporatörnün omega düğmesine basın ve 100 mikrolitrelik hassas bir hacme bağlı olarak empedans değerini not edin.
Empedans değeri aralığı yaklaşık 30 ve 35 olmalıdır. Nabzı başlatmak için başlat düğmesine basın. Ölçülen geçerli değerleri okuma çerçevesinde gösterilen Joules olarak kaydedin.
Cuvette'i odadan çıkarın. Hemen cuvette içine önceden ısıtılmış kültür ortamının 100 mikrolitresini ekleyin ve iki ila üç kez yukarı ve aşağı pipetlenerek yeniden diriltin. Hücre süspansiyonu hemen önceden hazırlanmış 24 kuyu plakasına aktarın.
Hücreleri karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır. Ertesi gün floresan mikroskobu altındaki hücreleri gözlemleyin. Bu çalışmada, DMSO ve SAG ile tedavi edilen grupların elektroporasyon verimliliği karşılaştırılabilir olarak ortaya çıkmıştır.
Birincil siliyum işaretleyici Arl13b'nin immünostainasyonu, hem araç hem de SAG ile tedavi edilen gruplarda kültürün div-2'sinde GCP'nin siliasyon oranının olduğunu göstermektedir. Siliasyon oranı, div-2 post-electroporation'da hücre yüzeyinde birincil cilium taşıyan Pax6 eksprese edici GCP'lerin yüzdesini gösterir. Bu rakam, SAG sonrası 24 saat süren GCP hücrelerinin primer siyez akoneminde yumuşatılmış EGFP lokalizasyonunda önemli bir artış olduğunu ve birincil seyuma bağımlı kirpi sinyal yolunun derin bir aktivasyonunu göstermektedir.
Daha yüksek bir elektroporasyon verimliliği elde etmek için, kullanılan plazmidin yüksek saflığını sağlamalıdır ve plazmid elektroporasyon karışımında kalıntı kültür ortamı yoktur. Bu protokol, nöronlar ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreler de dahil olmak üzere transfect edilmesi zor olan birincil kültürler ve hücre tipleri üzerinde in vitro genetik modifikasyon deneyleri için doğrudan uygulanabilir ve faydalı olmalıdır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, primer serebellar granül hücre öncüllerinin (GCP'ler) genetik manipülasyonu için tasarlanmış, tekrarlanabilir bir in vitro elektroporasyon protokolü sunmaktadır. Çalışma, primer siliya bağımlı Hedgehog sinyal yolaklarının incelenmesi için hem uygun maliyetli hem de verimli bir yönteme odaklanmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Genetik manipülasyon
- Hücre sinyalizasyonu
Arka Plan
- Birincil serebellar granüler hücre öncülleri (GCP'ler), nöral gelişimin incelenmesi için kritik öneme sahiptir.
- Mevcut transfeksiyon yöntemleri genellikle verimsiz ve maliyetlidir.
- Primer silya, Hedgehog sinyal yolu da dahil olmak üzere çeşitli sinyal yolakları için hayati önem taşır.
- Elektroporasyon, bu zorluklar için potansiyel bir çözüm sunmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- GCP kültürü için etkili bir elektroporasyon tekniği sunmak.
- Primer siliyum bağımlı sinyal yolaklarının incelenmesini kolaylaştırmak.
- transfeksiyona dirençli hücre tiplerinde genetik manipülasyon sonuçlarını iyileştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Deneyde primer GCP'lerin in vitro kültürleri kullanılmıştır.
- Elektroporasyon protokolü, etkili genetik modifikasyon için spesifik parametreler içermektedir.
- Çalışmada herhangi bir multiomik yaklaşımdan bahsedilmemiştir.
- Kritik adımlar arasında hücrelerin yeniden süspansiyonu ve elektroporasyon sırası yer almaktadır.
- Siliyasyon oranlarını ve sinyal yolu aktivasyonunu değerlendirmek için immün boyama kullanılmıştır.
Ana Sonuçlar
- Protokol, işlem görmüş GCP'lerde Hedgehog sinyal yolunun aktivasyonunda anlamlı bir artış olduğunu göstermiştir.
- İmmünboyama, elektroporasyon sonrası GCP'lerde belirgin bir siliyalizasyon oranı artışı ortaya koymuştur.
- Çalışma, elektroporasyonun geleneksel yöntemlere kıyasla verimliliğine dair bilgiler sağlamıştır.
- Yüksek plazmit saflığının, elektroporasyon başarısı için kritik olduğu sonucuna varılmıştır.
Sonuçlar
- Bu çalışma, primer GCP'lerde genetik manipülasyon için değerli bir protokol sunmaktadır.
- Bulgular, primer silium bağımlı sinyalizasyon mekanizmalarının anlaşılmasını geliştirmektedir.
- Gelecekteki uygulamalar, transfeksiyonu zor olan çeşitli hücre tiplerini kapsayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Primer granül hücre öncüllerinin (GCP'ler) etkin genetik manipülasyonu, nörogelişimsel ve hastalık yollarının temelini oluşturan siliyuma bağımlı sinyal mekanizmalarının aydınlatılması için gereklidir. Bu elektroporasyon protokolü, yüksek transfeksiyon verimliliği ve hücre canlılığı sağlayarak, hastalıkla ilişkili sistemlerde Hedgehog yolu dinamiklerinin güçlü bir şekilde sorgulanmasına olanak tanır. Yöntem, sinyal yolu modülatörleri için erken keşif ve hedef doğrulamada öngörücü güveni desteklemektedir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Primer GCP'lerde cilium-bağımlı Hedgehog sinyallemesinin fonksiyonel genetik sorgulamasını sağlar.
- Yolak bileşenlerinin lokalizasyonunun doğrudan görselleştirilmesine izin vererek mekanistik risk azaltmayı destekler.
- Hastalıkla ilgili hücrelerde sinyal düğümlerinin yeniden üretilebilir manipülasyonu aracılığıyla hedef doğrulamayı kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Yolak modülatörlerinin sonraki aşamalardaki taramaları için valide edilmiş primer hücre sistemleri hazırlar.
- Kantitatif analiz çıktıları için yüksek transfeksiyon verimliliği (~80-90%) ve tekrarlanabilirlik sağlar.
- Transfeksiyonu zor olan nöronal modeller için ölçeklenebilir ve maliyet etkin analiz geliştirilmesine olanak tanır.
Translasyonal ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel süreklilik için in vitro bulguları hastalıkla ilgili hücresel fenotiplerle hizalar.
- Sinyal proteinlerinin lokalizasyonunun dinamik takibini sağlayarak biyobelirteç keşfini destekler.
- Güçlü mekanistik veriler sağlayarak preklinik ilerlemede biyolojik riski azaltır.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu protokol, genetik manipülasyon ile primer nöronal sistemlerdeki kantitatif yolak analizini birbirine bağlayarak, erken keşif ve hedef doğrulama aşamalarına entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Primer GCP'lerde hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturulmasını kolaylaştırır.
- Tarama: Analiz hazırlığı ve kantitatif okumalar için tekrarlanabilir, yüksek verimli transfeksiyon sağlar.
- Analitik: İmmünboyama ve floresan mikroskopi yoluyla siliyalizasyon oranlarının ve yolak aktivasyonunun ölçülmesine olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: In vitro mekanistik bilgileri hastalıkla ilgili hücresel bağlamlarla ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Zorlayıcı primer hücre tiplerinde genetik modifikasyon için geniş kapsamlı uygulanabilir bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Yolak çalışmalarında öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Genetik manipülasyonu yüksek tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlikle standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Güçlü erken aşama veriler sağlayarak go/no-go kararlarını ve sermaye verimliliğini geliştirir.
- Portföy Etkisi: Sinyal yolak hedeflerinin ve modülatörlerin riskle uyumlu önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Primer nöronal kültür ve elektroporasyon tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Analiz için elektroporasyon cihazlarına ve floresan mikroskobuna erişim gereklidir.
- Plazmid saflığı ve besiyeri uzaklaştırma protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Protokol optimizasyonu ile transfeksiyona dirençli diğer primer hücre tiplerine uyarlanabilir.
- Verimlilik, elektroporasyon parametrelerinin ve numune hazırlığının hassas kontrolüne bağlıdır.
Biopharma SSS
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Day In Vitro (DIV) 0: Electroporation for Overexpression of Hedgehog Receptor: pEGFP-Smo
2:28
Results: Assessment of Overexpression Efficiency and the Effects of SAG Treatment on Primary Cilium-Dependent Hedgehog Signaling Pathway
3:23
Conclusion
