Name: Domuz Periferik Kanından Kan Büyümesi Endotel Hücrelerinin (BOEC) Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Öğrenin domuz periferik kanından kan büyümesi endotel hücrelerinin (BOEC) karakterizasyonunu. Bu yöntem doku mühendisliği ve hücre terapisi araştırmalarında yüksek verimli endotelyal hücre üretimi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar NIH / NHLBI R00 HL129068'den fon almayı kabul etmek istiyorlar.

Tüm hayvan çalışmaları, Wisconsin Tıp Fakültesi ve Mayo Clinic'teki ilgili Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Bu çalışmada Yorkshire/Landrace/Duroc çapraz evcil domuzları (Sus domesticus), 40-80 kg, 3-6 aylık erkek ve dişi kullanılmıştır.
1. Domuz periferik kanının toplanması
<ol><li>Malzemeleri hazırlayın.<ol><li>Heparin çözeltisini steril salin içinde 100 U/mL'ye seyreltin.</li>
		<li>İki adet 50 mL konik tüpün ve iki adet 60 mL şırınganın her birine 3-4 mL heparin çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>Seyreltilmemiş heparin çözeltisini (1.000 U/mL) bir uzatma tüpüne çekin.</li>
		<li>Heparin dolgulu uzatma tüpünün bir ucuna 19 G'lık bir iğne ve diğer ucuna heparin içeren 60 mL'lik bir şırınga bağlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Bir domuzu Kurumsal politikalara göre uyuşturmak<ol><li>Anesteziyi indüklemek için IM atropin (0.05 mg / kg), tiletamin / zolazepam (2-5 mg / kg) ve ksilazin (2 mg / kg) enjeksiyonu uygulayın. NOT: Hayvan bilinçsiz olduğunda ve mandibuler kaslar sert olmadığında yeterli anestezi sağlanır.</li>
		<li>Hayvanı sırtüstü pozisyonda koyun ve stabilite sağlamak için her iki tarafa da yuvarlanmış havlular yerleştirin.</li>
		<li>Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere oftalmik bir merhem sürün.</li>
		<li>Anestezi sırasında battaniyeler, ısıtma pedleri ve / veya ısıtmalı prosedür masası dahil olmak üzere termal destek sağlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Femoral kasık bölgesini betadin ovma çözeltisi ile temizleyin.</li>
	<li>Femoral veni veya arteri 19 G iğne ile delin ve yavaşça (~ 1-2 mL / s) şırıngaya 50 mL kan çekin. NOT: Çok hızlı çizim yapmak hücrelere zarar verebilir.</li>
	<li>İğneyi yerinde bırakarak, hemen uzatma tüpünü bükün ve 60 mL şırınganın bağlantısını kesin</li>
	<li>Kanı yavaşça heparin içeren 50 mL konik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>50 mL konik tüpü sıkıca kapatın, karıştırmak için birkaç kez hafifçe ters çevirin ve buzun üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Kalan heparin içeren 60 mL şırıngayı uzatma tüpüne bağlayın, uzatma tüpünü açın ve yavaşça şırıngaya 50 mL daha kan çekin.</li>
	<li>İğneyi derhal arterden veya damardan çıkarın ve kalan kanı uzatma tüpünden yavaşça şırıngaya çekin.</li>
	<li>60 mL şırıngayı uzatma tüpünden ayırın ve kanı yavaşça kalan heparin içeren 50 mL konik tüpe aktarın.</li>
	<li>50 mL konik tüpü sıkıca kapatın, karıştırmak için birkaç kez hafifçe ters çevirin ve buzun üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Domuzun femoral kasık bölgesine basınç hemostazı uygulayın.</li>
	<li>Domuzu Kurumsal politikalara göre kurtarın. Sternal yatmayı sürdürmek ve düzenli konut / köpek kulübesi alanına geri dönmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı sürekli izleyin.</li>
</ol>2. Mononükleer hücrelerin izolasyonu
<ol><li>Kanı 1: 1 oranında fosfat tamponlu salin (PBS) ile dört adet 50 mL konik tüpte seyreltin. NOT: Bu çalışmanın, hücre kültürünün kirlenmesini önlemek için aseptik bir teknik kullanılarak bir hücre kültürü başlığında yapılması gerekir.</li>
	<li>Sekiz adet 50 mL konik tüpe 25 mL oda sıcaklığında kullanıma hazır yoğunluk gradyanı çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Çok yavaş pipet, tüpü pipet ucuna keskin bir açıyla tutarak 50 mL konik tüp içeren her yoğunluk gradyanı çözeltisinin iç kısmı boyunca 25 mL kan/salin çözeltisi haline getirin. NOT: Kan çözeltisi, yoğunluk gradyanı çözeltisinin üzerine nazikçe katman oluşturmalı ve iyi tanımlanmış bir arayüz sağlamalıdır.</li>
	<li>Tüpleri 560 x g ve oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca santrifüjleyin. NOT: En iyi sonuçlar için, mümkünse santrifüj frenini devre dışı bırakın.</li>
	<li>Her tüpten buffy kaplamayı (yoğunluk gradyanı çözeltisinin üstünde ve berrak plazmanın altında bulunan mononükleer hücrelerin bulutlu tabakası) dikkatlice toplamak ve iki yeni 50 mL konik tüpe eşit olarak dağıtmak için ince bir pipet kullanın. Tüpleri içeren yoğunluk gradyanı çözeltisini atın. NOT: Yoğunluk gradyanı çözeltisinin ve plazmanın mümkün olduğunca azını toplarken buffy katın mümkün olduğunca fazlasını toplayın.</li>
</ol>3. Hücrelerin yıkanması ve kaplanması
<ol><li>6 delikli bir plakayı fibronektin ile kaplayın.<ol><li>Steril suda 1 mg / mL'ye seyrelterek insan plazma fibronektininin stok çözeltisini yapın. Aliquotları -20 °C'de saklayın.</li>
		<li>3 mL PBS'de 600 μL fibronektin stok çözeltisini seyrelterek 3.6 mL çalışan bir fibronektin çözeltisi yapın.</li>
		<li>600 μL fibronektin çalışma çözeltisini 6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın ve eşit şekilde kaplanana kadar hafifçe sallayın.</li>
		<li>Fibronektinin kuyucukları kaplaması için 30 dakika bekleyin ve çözeltiyi her bir kuyucuktan nazikçe aspire edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Fibronektinin kaplanmasını beklerken, mononükleer hücreleri yıkayın<ol><li>Tüpleri 45 mL'ye kadar PBS ile doldurun</li>
		<li>Düşük frenle 560 x g ve 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj. Süpernatantı her iki tüpten de aspire edin.</li>
		<li>Her hücre peletini 25 mL PBS'de yeniden askıya alın.</li>
		<li>İkinci kez yıkamak için tekrarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Her hücre peletini 5 mL PBS içinde yeniden askıya alın ve her tüpe 15 mL% 0.8 amonyum klorür çözeltisi ekleyin. NOT: Bu adım, kalan kırmızı kan hücrelerini lize etmektir.</li>
	<li>10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Tüpleri PBS ile doldurarak hücreleri daha önce olduğu gibi yıkayın ve düşük frenle 560 x g ve 4 ° C'de 5 dakika santrifüj yapın. Süpernatantı her iki tüpten de aspire edin.</li>
	<li>Her hücre peletini 25 mL PBS'de tekrar askıya alın ve ikinci kez yıkamak için tekrarlayın.</li>
	<li>Her hücre peletini, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve 10.000 U/mL penisilin, 10 mg/mL streptomisin ve 25 μg/mL amfoterisin içeren 1x antibiyotik/antimikotik solüsyon ile desteklenmiş 6 mL EGM-2 kültür ortamında yeniden askıya alın. NOT: EGM-2 kültür besiyeri, 200 μL hidrokortizon, 2 mL insan fibroblast büyüme faktörü (hFGF-B), 500 μL vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), 500 μL insülin benzeri büyüme faktörünün rekombinant analoğu (R3 IGF-1), 500 μL askorbik asit, 500 μL insan epidermal büyüme faktörü (hEGF) ile desteklenmiş EBM-2 kültür ortamından oluşur, 500 mL başına 500 μL gentamisin/amfoterisin ve 500 μL heparin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunun 2 mL'sini fibronektin kaplı 6 delikli plakanın her bir kuyucuğuna yavaşça aktarın ve eşit şekilde kaplanana kadar hafifçe sallayın. NOT: Amaç, oluşacak endotel kolonilerinin sayısını en üst düzeye çıkarmak için mümkün olduğunca çok hücre tohumlamaktır.</li>
</ol>4. Hücre kültürü
<ol><li>Hücreleri 37 ° C,% 5 CO2 ve% 100 nemde inkübe edin.</li>
	<li>Ertesi gün, her bir kuyucuğa yavaşça 1 mL taze kültür ortamı ekleyin. NOT: Fibronektin kaplamaya gevşek bir şekilde yapışan hücreleri rahatsız etmemek için nazik olmak önemlidir.</li>
	<li>Ertesi gün, her bir kuyudan 1,5 mL kültür ortamını nazikçe aspire ederek ve 1,5 mL taze kültür ortamı ile değiştirerek yarım kültür ortamı değişikliği gerçekleştirin.</li>
	<li>Önümüzdeki 5 günün her birinde, her bir kuyucuk için nazikçe tam bir kültür ortamı değişikliği yapın (kuyu başına 2 mL taze kültür ortamı).</li>
	<li>Bundan sonra, kültür ortamını haftada üç kez yavaşça değiştirin.</li>
	<li>Hücre kültürlerini düşük güçlü (4x objektif) ışık mikroskobu altında düzenli olarak görselleştirin. NOT: Yapışkan kan büyümesi endotel hücresi (BOEC) kolonileri, kaplamadan 7-10 gün sonra kuyucuklarda görünmeye başlayacaktır. Yapışkan olmayan hücre tipleri orta değişikliklerle atılacak ve diğer yapışkan hücre tipleri BOEC kolonileri büyüdükçe yavaş yavaş dağılacaktır.</li>
	<li>BOEC'leri fibronektin kaplı bir T-75 şişesine ~% 70 -% 80 birleştiğinde geçirin ve haftada üç kez kültür ortamını değiştirmeye devam edin. NOT: Tohumlama yoğunluğu, kolonilerin bunun yerine bir T25 şişesine geçirilmesiyle kontrol edilebilir. Sonraki pasajlar fibronektin kaplama gerektirmez ve kültür ortamı değişiklikleri haftada iki kez azaltılabilir.</li>
	<li>1-3 pasajlarındaki hücreler deneyler için kullanılabilir veya dondurucu bir ortama aktarılabilir ve ileride kullanılmak üzere sıvı azotta saklanabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium%3A+II.+Representative+vascular+beds%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium%3A+I.+Structure%2C+function%2C+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms.</a> Circulation Research. 100 (2), 158-173 (2007).</li>
<li>Pober, J. S., Tellides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+blood+vessel+cells+in+human+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Participation of blood vessel cells in human adaptive immune responses.</a> Trends in Immunology. 33 (1), 49-57 (2012).</li>
<li>Navarro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+cell+protein+C+receptor%3A+its+role+in+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">The endothelial cell protein C receptor: its role in thrombosis.</a> Thrombosis Research. 128 (5), 410-416 (2011).</li>
<li>Hasstedt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecule+1%3A+a+novel+risk+factor+for+venous+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis.</a> Blood. 114 (14), 3084-3091 (2009).</li>
<li>Ormiston, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+culture+of+blood+outgrowth+endothelial+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53384(2015).</li>
<li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> Journal of Clinical Investigation. 105 (1), 71-77 (2000).</li>
<li>Martin-Ramirez, J., Hofman, M., Biggelaar, M. V. D., Hebbel, R. P., Voorberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+outgrowth+endothelial+cells+from+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood.</a> Nature Protocols. 7 (9), 1709-1715 (2012).</li>
<li>Gulati, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+origin+and+function+of+cells+with+endothelial+phenotype+obtained+from+adult+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood.</a> Circulation Research. 93 (11), 1023-1025 (2003).</li>
<li>Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+endothelial+cells%3A+utility+from+ambiguity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Blood endothelial cells: utility from ambiguity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (5), 1613-1615 (2017).</li>
<li>Medina, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitors%3A+A+consensus+statement+on+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitors: A consensus statement on nomenclature.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1316-1320 (2018).</li>
<li>Medina, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+endothelial+progenitor+cell+%28EPC%29+subtypes+reveals+two+distinct+cell+populations+with+different+identities%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Genomics%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities.</a> BMC Medical Genomics. 3, 18(2010).</li>
<li>Jiang, A., Pan, W., Milbauer, L. C., Shyr, Y., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+question+based+on+cross-platform+microarray+data+normalization%3A+are+BOEC+more+like+large+vessel+or+microvascular+endothelial+cells+or+neither+of+them%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioinformatics+and+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A practical question based on cross-platform microarray data normalization: are BOEC more like large vessel or microvascular endothelial cells or neither of them.</a> Journal of Bioinformatics and Computational Biology. 5 (4), 875-893 (2007).</li>
<li>Pan, W., Shen, X., Jiang, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-supervised+learning+via+penalized+mixture+model+with+application+to+microarray+sample+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Semi-supervised learning via penalized mixture model with application to microarray sample classification.</a> Bioinformatics. 22 (19), 2388-2395 (2006).</li>
<li>Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+identity%2C+phenotype%2C+and+fate+of+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (9), 1584-1595 (2008).</li>
<li>Fernandez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+outgrowth+endothelial+cells+from+hereditary+haemorrhagic+telangiectasia+patients+reveal+abnormalities+compatible+with+vascular+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Blood outgrowth endothelial cells from hereditary haemorrhagic telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions.</a> Cardiovascular Research. 68 (2), 235-248 (2005).</li>
<li>Critser, P. J., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+colony-forming+cell+role+in+neoangiogenesis+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Organ+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (1), 68-72 (2010).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+aortic+endothelial+cells+from+miniature+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59673(2019).</li>
<li>Chang Milbauer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+endothelial+systems+biology+of+sickle+stroke+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Genetic endothelial systems biology of sickle stroke risk.</a> Blood. 111 (7), 3872-3879 (2008).</li>
<li>Wei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+endothelial+cell+gene+expression+by+African+Americans+versusCaucasian+Americans%3A+a+possible+contribution+to+health+disparity+in+vascular+disease+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">Differential endothelial cell gene expression by African Americans versusCaucasian Americans: a possible contribution to health disparity in vascular disease and cancer.</a> BMC Medicine. 9 (1), 2(2011).</li>
<li>Hasstedt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecule+1%3A+a+novel+risk+factor+for+venous+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%2C+The+Journal+of+the+American+Society+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis.</a> Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 114 (14), 3084-3091 (2009).</li>
<li>Milbauer, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+outgrowth+endothelial+cell+migration+and+trapping+in+vivo%3A+a+window+into+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy.</a> Translational Research. 153 (4), 179-189 (2009).</li>
<li>Matsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+gene+therapy+for+hemophilia+A+that+enhances+safe+delivery+and+sustained+in+vivo+factor+VIII+expression+from+lentivirally+engineered+endothelial+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Ex vivo gene therapy for hemophilia A that enhances safe delivery and sustained in vivo factor VIII expression from lentivirally engineered endothelial progenitors.</a> Stem Cells. 25 (10), 2660-2669 (2007).</li>
<li>De Meyer, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+correction+of+von+Willebrand+disease+type+3+blood-derived+endothelial+cells+with+lentiviral+vectors+expressing+von+Willebrand+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Phenotypic correction of von Willebrand disease type 3 blood-derived endothelial cells with lentiviral vectors expressing von Willebrand factor.</a> Blood. 107 (12), 4728-4736 (2006).</li>
<li>Bodempudi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+outgrowth+endothelial+cell-based+systemic+delivery+of+antiangiogenic+gene+therapy+for+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors.</a> Cancer Gene Therapy. 17 (12), 855-863 (2010).</li>
<li>Dudek, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+inhibition+of+tumour+angiogenesis+by+endothelial+cell-based+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Systemic inhibition of tumour angiogenesis by endothelial cell-based gene therapy.</a> British Journal of Cancer. 97 (4), 513-522 (2007).</li>
<li>Moubarik, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+late+outgrowth+endothelial+progenitor+cells+as+cell+therapy+product+for+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 7 (1), 208-220 (2011).</li>
<li>Pislaru Sorin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+forces+enable+rapid+endothelialization+of+synthetic+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts.</a> Circulation. 114 (1), 314(2006).</li>
<li>Satyananda, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+of+immune+modulation+in+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">New concepts of immune modulation in xenotransplantation.</a> Transplantation. 96 (11), 937-945 (2013).</li>
<li>Klymiuk, N., Aigner, B., Brem, G., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+pigs+as+organ+donors+for+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation.</a> Molecular Reproduction and Development. 77 (3), 209-221 (2010).</li>
<li>Ryczek, N., Hryhorowicz, M., Zeyland, J., Lipiński, D., Słomski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas+technology+in+pig-to-human+xenotransplantation+research%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas technology in pig-to-human xenotransplantation research.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3196(2021).</li>
<li>Cooper, D. K., Koren, E., Oriol, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered pigs.</a> Lancet. 342 (8872), 682-683 (1993).</li>
<li>Cozzi, E., White, D. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+transgenic+pigs+as+potential+organ+donors+for+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans.</a> Nature Medicine. 1 (9), 964-966 (1995).</li>
<li>Phelps, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+alpha+1%2C3-galactosyltransferase-deficient+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs.</a> Science. 299 (5605), New York, N.Y. 411-414 (2003).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

BOEC'ler çeşitli bilimsel ve terapötik yaklaşımlarda kullanılabilecek güçlü bir araçtır 7,8,16. BOEC'ler, vasküler hastalıkların ve kanserin gelişiminden sorumlu anahtar faktörleri aydınlatmak için EC gen ekspresyonunu analiz etmek için kullanılmıştır 5,19,20,21. BOEC'ler ayrıca vasküler rejenerasyon v...

Endotel oldukça karmaşık, dinamik bir yapıdır ve vasküler duvarın hayati bir bileşenidir. Dolaşımdaki kan ve çevresindeki dokular arasında fiziksel bir arayüz sağlamak için kan damarlarının iç yüzeyini hizalar. Bu heterojen yapının anjiyogenez, inflamasyon, vazoregülasyon ve hemostaz gibi çeşitli işlevleri yerine getirdiği bilinmektedir 1,2,3,4. İnsan göbek damarı endotel hücreleri, endotel hücrelerinin işlevselliğini değerlendirmek için yaygın olarak çalışılan bir hücre tipidir. Bununla birlikte, hastaya özgü parti değişkenliği, tutarsız fenotip ve minimum ayrılma verimliliği, tüm bu özellikleri geliştirebilecek bir hücre kaynağının belirlenmesi ihtiyacını ortaya koymaktadır5.
Primer endotel hücrelerinin homojen bir popülasyonunu elde etmek teknik olarak zor olabilir ve primer endotel hücreleri yüksek proliferatif kapasiteye sahip değildir6. Bu nedenle, vasküler rejenerasyonu incelemek ve patofizyolojik süreçleri değerlendirmek için, çeşitli gruplar periferik kandan türetilen farklı endotel hücreleri tiplerini elde etmeye ve değerlendirmeye çalışmışlardır, örneğin endotel progenitör hücreleri (EPC'ler) veya kan büyümesi endotel hücreleri (BOEC'ler)6,7,8,9 . İğ şeklindeki erken EPC'ler hematopoetik kök hücrelerden (HSC'ler) kaynaklanır ve olgun endotel hücreleri üretmek için sınırlı büyüme potansiyeline ve sınırlı anjiyojenik yeteneğe sahiptir. Ayrıca, enflamatuar monositlere çok benzerler. Ek olarak, işlevsel, çoğalan, olgun endotel hücrelerine daha da farklılaşma kapasiteleri hala tartışmalıdır 6,7,9,10. Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) sürekli kültürü, geç büyüme EPC'leri, BOEC'ler veya endotel kolonisi oluşturan hücreler (ECFC'ler) olarak bilinen ikincil bir hücre popülasyonuna yol açabilir6,7,9,10. Medina ve ark. 2018'de, EPC'lerin sınırlamalarını, isimlendirmelerinin belirsizliğini ve EPC'ler11 altında sürekli olarak gruplandırılmış birçok farklı hücre tipiyle genel bir uyum eksikliğini kabul etmiştir. Buna karşılık, BOEC'ler vasküler onarım, sağlık ve hastalık ve hücre tedavisindeki rolleri ile tanınmıştır. Bu hücrelerin daha fazla araştırılması ve terapötik kullanımı, bu hücre tiplerini dolaşımdaki progenitör hücrelerden tutarlı bir şekilde türetmek için protokollere dayanacaktır.
BOEC'ler gibi primer hücreler, yüksek proliferatif olgun endotel hücreleri elde etmek için bir vekil olarak kullanılabilir6. BOEC'ler fenotipik olarak erken EPC'lerden farklıdır ve parke taşı morfolojisi ve aderens kavşaklarının ve kaveoların ekspresyonu gibi tipik endotel özellikleri sergiler12. Hebbel ve ark.13,14,15 tarafından yapılan gen profillemesi, BOEC'lerin veya ECFC'lerin mikrovasküler ve büyük damar oluşumunu teşvik ettikleri için gerçek endotel hücreleri olduğunu bulmuştur. Bu nedenle, BOEC'ler patofizyolojik süreçleri ve genetik çeşitliliği değerlendirmek için bir araç olarak kullanılabilir16. Ayrıca vasküler rejenerasyon için hücre tedavisi için mükemmel bir hücre kaynağı olarak kabul edilirler17. Bu nedenle, bu yüksek proliferatif hücreleri tutarlı bir şekilde türetmek için standartlaştırılmış bir protokol gereklidir.
BOEC'ler insan patofizyolojik ve genetik varyasyonunu incelemek için güçlü bir araç sağlarken, daha homojen bir BOEC kaynağı daha sağlam ve güvenilir deneysel ve terapötik sonuçlar sağlayabilir. Üstün homojenlik, benzer koşullarda yetiştirilen genetik olarak benzer hayvanlardan elde edilen ksenojenik hücre kaynakları kullanılarak elde edilebilir18. Ksenojenik hücre kaynakları konakçı immün yanıtını ortaya çıkarmaya eğilimli olsa da, immünomodülasyon stratejileri, hücreler de dahil olmak üzere immünouyumlu hayvanlar ve hayvansal ürünler üretmek amacıyla geliştirilmektedir. Özellikle domuzlar, bol miktarda periferik kan kaynağıdır ve insanlarla anatomik ve fizyolojik benzerlikler nedeniyle tıbbi cihazları ve diğer terapileri incelemek için yaygın olarak kullanılır. Bu nedenle, bu çalışma, domuz periferik kanından yüksek proliferatif BOEC'lerin izolasyonu ve genişlemesi için protokolü rafine etmektedir. Aşağıda ayrıntılı olarak açıklanan protokol, nispeten küçük bir kan hacminden çok sayıda BOEC elde etmek için basit ve güvenilir bir yöntemdir. Kültürler, tek bir kan örneğinden milyonlarca hücre üretmek için birkaç pasajla genişletilebilir.

<table><tbody><tr><td>19 G iğne</td><td>Covidien</td><td>1188818112</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik tüpler</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu plaka</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>60 mL şırınga</td><td>Covidien</td><td>8881560125</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum klorür çözeltisi (%0.8)</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>07850</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik/antimikotik çözelti (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-253-839</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 kültür ortamı</td><td>Lonza Walkersville</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Uzatma tüpü</td><td>Hanna İlaç Tedarik A.Ş.</td><td>03382C6227</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Atlas Biologicals</td><td>F-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque 1077</td><td>Cytiva</td><td>17144003</td><td>Yoğunluk gradyan çözeltisi</td></tr><tr><td>Heparin sodyum enjeksiyonu (1.000 birim / mL)</td><td>Pfizer</td><td>00069-0058-01</td><td></td></tr><tr><td>İnsan plazma fibronektini</td><td>Gibco</td><td>33016-015</td><td></td></tr><tr><td>Buz</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pipet seti</td><td>Eppendorf</td><td>2231300004</td><td></td></tr><tr><td>Steril su</td><td>Gibco</td><td>15230-162</td><td></td></tr><tr><td>İnce pipet</td><td>Celltreat Scientific</td><td>229280</td><td></td></tr></tbody></table>

domuz periferik kanından kan büyümesi endotel hücrelerinin (boec) karakterizasyonu

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

Endotel, anjiyogenez, hemostaz, inflamasyon ve homeostaz gibi birçok fizyolojik fonksiyonda önemli rol oynayan dinamik entegre bir yapıdır. Endotel ayrıca ateroskleroz, hipertansiyon ve diyabet gibi patofizyolojilerde de önemli bir rol oynamaktadır. Endotel hücreleri kan ve lenfatik damarların iç astarını oluşturur ve yapı ve fonksiyonda heterojenlik gösterir. Çeşitli gruplar, hematopoetik kök hücrelerden veya olgun kan büyümesi endotel hücrelerinden (veya endotel kolonisi oluşturan hücrelerden) türetilen endotel progenitör hücrelerine odaklanarak insan periferik kanından türetilen endotel hücrelerinin işlevselliğini değerlendirmiştir. Bu hücreler tedavi ve hastalık modellemesi için otolog bir kaynak sağlar. Ksenojenik hücreler, benzer koşullarda yetiştirilen genetik olarak benzer hayvanların kullanılmasıyla elde edilen kullanılabilirlikleri ve homojenlikleri nedeniyle alternatif bir terapötik kaynak sağlayabilir. Bu nedenle, domuz periferik kanından yüksek proliferatif kan büyümesi endotel hücrelerinin izolasyonu ve genişlemesi için sağlam bir protokol sunulmuştur. Bu hücreler, ksenotransplantasyonda inflamatuar ve pıhtılaşma yanıtlarını araştırmak için kardiyovasküler doku mühendisliği, hücre tedavisi, hastalık modelleme, ilaç taraması, endotel hücre biyolojisinin incelenmesi ve in vitro ko-kültürler gibi sayısız uygulama için kullanılabilir.

Kültürlenmiş hücrelerin morfolojisi, kültürün başlangıcından BOEC kolonileri gözlenene kadar gözlendi (Şekil 1). Daha küçük bir yapışkan hücre popülasyonu kültür kaplarına yapışmaya ve büyümeye başlarken, yapışkan olmayan hücreler kültür ortamı değişiklikleriyle uzaklaştırıldı (Şekil 1B). Koloniler ilk olarak 6. günde, merkezi bir noktadan radyal olarak dışa doğru çoğalan endotel benzeri hücrelerin bir koleksiyonu olarak ortaya çıkmıştır (Şe...

Domuz Periferik Kanından Kan Büyümesi Endotel Hücrelerinin (BOEC) Karakterizasyonu

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

Protokol, çeşitli doku mühendisliği, hücre tedavisi ve hastalık modelleme araştırmaları için kullanılabilecek oldukça proliferatif kan büyümesi endotel hücreleri sağlar. Bu teknik, tek bir kan alımından sürekli olarak birçok hücre verir. Bu tekniğin başarılı olması için, hücrelerin mümkün olan en kısa sürede kültür ortamına ve inkübatör ortamına hızlı bir şekilde sokulması çok önemlidir.İlk olarak, heparin çözeltisini steril salin içinde mililitre başına 100 birime seyreltin. İki adet 50 mililitrelik konik tüpün ve iki adet 60 mililitrelik şırınganın her birine üç ila dört mililitre heparin çözeltisi ekleyin. Daha sonra, mililitre heparin çözeltisi başına seyreltilmemiş 1.000 üniteyi bir uzatma tüpüne çekin.Heparin dolgulu uzatma tüpünün bir ucuna 19 gauge iğne ve uzatma tüpünün diğer ucuna heparin içeren 60 mililitrelik bir şırınga bağlayın. Daha sonra, anestezi uygulanmış bir domuzun femoral kasık bölgesini bir Betadine ovma çözeltisi ile temizleyin. Femoral veni veya arteri 19 gauge iğne ile delin ve saniyede bir ila iki mililitrede, şırıngaya yavaşça 50 mililitre kan çekin.İğneyi yerinde bırakarak, hemen uzatma tüpünü bükün ve 60 mililitrelik şırınganın bağlantısını kesin. Kanı

characterization-blood-outgrowth-endothelial-cells-boec-from-porcine

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Endotel progenitör hücrelerin koloni oluşturan (ECFCs) vasküler homeostazı ve onarım çalışması için bir gelecek vaat eden bir araçtır.

İzolasyon ve Büyük Ölçekli Genişleme Yetişkin İnsan Endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler

Yalıtma ve kalp kapakçığı endotel hücreleri (VEC) saf kültür popülasyonları için bir yöntem sağlar. VEC tüberkülü veya broşürün her iki taraftan da izole edilmiş ve hemen şu olabilir, altta yatan interstisyel hücre (VIC) izolasyonu basittir.

Kapak Endotel Hücreleri İzolasyon

Kan ile temas eden otolog hücre ve test biyouyumluluk biyomalzemeler tohumlama titanyum için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, cerrahi implantasyon dakika içinde domuz venae kava numaralı seribaşı endotel progenitör hücrelerin ve titanyum tüpler, kullanır. Bu teknik, diğer birçok implante biyomedikal cihazlar için uyarlanabilir.

Otolog Endotelyal progenitör Hücre-Yayımlama Teknoloji ve Büyük Hayvan Modeli Kardiyovasküler Cihazlar için Biyouyumluluk Testleri

Steril bir sürekli akış devresi, laminer akış kayma gerilmesi tabi yapışık hücrelere için bir yöntem tarif. Hücrelerin yapışma, morfoloji, şeffaf oda ile devre metaboliti analizi ve gelecek deneyler ya da kültür için kayma maruz kaldıktan sonra hasat hücreleri için alınan numuneler incelenmiştir olabilir.

Laminer Akış Kesme Stres altında endotel progenitör hücrelerin değerlendirin Paralel plakalı Akış Odası ve Sürekli Akış Devre

Endotel koloni oluşturan hücreleri (ECFCs) intrensek göstermeyen sağlam klonal bir proliferatif potansiyeli olan endotel hücreleri...

Endotel Colony Forming Hücrelerinin Fenotipik ve Fonksiyonel Karakterizasyonu İnsan Göbek Kordonu Kanı türetilen

Bu videoda, tek adımlı kollajenaz sindirimi kullanılarak bir domuz modelinin abdominal aortundan endotel hücrelerinin izolasyonunu gösteriyoruz. Endotel hücreleri, daha sonraki aşağı akış uygulamaları için kültürlenebilir.

Domuz Aort Endotel Hücresi (pAEC) İzolasyonu: Hasat Edilen Domuz Abdominal Aortundan Endotel Hücrelerini İzole Etmek İçin Enzim Tabanlı Bir Yöntem

Bu protokol, küçük bir yetişkin periferik kan hacminden kan büyümesi endotel hücrelerinin (BOEC'ler) güvenilir bir şekilde oluşturulmasına ve karakterizasyonuna izin verir. BOEC'ler, vasküler bozuklukları olan hastalardan alınan endotel hücreleri için bir vekil olarak ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin üretimi için bir substrat olarak kullanılabilir.

İnsan çevresel kanından üretilmesi ve kültür Blood üremesi Endotel Hücreleri

Hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC) henüz küçük bazı endotel hücreleri kan yapıcı olmaya belirtmek hangi işlemi hakkında bilinen, gelişim sırasında uzman (hemogenic) endotel hücreleri kaynaklanıyor. Bu fare embriyonik dokulardan hemogenic endotel hücreleri ve HSPC eşzamanlı izolasyonu sağlayan bir akış-sitometri göre bir yöntem ortaya koymaktadır.

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

Bu iletişim kuralının amacı göbek kordon kanı endotelyal progenitor hücrelerini izole etmektir. Bazı uygulamalar bu hücreler bir biyomarker hastaların kardiyovasküler riski ile iskemik hastalıklar, tedavi tanımlamak için kullanmayı içerir ve oluşturma doku Mühendisliği vasküler ve kalp kapak oluşturur.

Yalıtım endotelyal Progenitor Hücre insan göbek kordon kanı

Biz bütün, anticoagulated kan çalışma ve koagülasyon analizini sağlayan bir vitro modeli mevcut. Anticoagulation sistemi sağlıklı endotel hücreleri doğal anticoagulation etkisi bağlıdır ve endotel hücre aktivasyonu pıhtılaşma içinde sonuçlanır.

Endotel hücreleri kullanarak 3D hücre kültürü ve sigara anticoagulated tam kan antikoagülan ve anti-enflamatuar özellikleri değerlendirilmesi

Bu protokol, insan pluripotent ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden kendi kendini organize eden kan damarlarının oluşumunu tanımlar. Bu kan damarı ağları, perisitler, düz kas aktini ve sürekli bir bazal membran ile çevrili geniş ve bağlı bir endotel ağı sergiler.

Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Kan Damarı Organoidlerinin Üretimi

Öğrenin domuz periferik kanından kan büyümesi endotel hücrelerinin (BOEC) karakterizasyonunu. Bu yöntem doku mühendisliği ve hücre terapisi araştırmalarında yüksek verimli endotelyal hücre üretimi sağlar.

Domuz Periferik Kanından Kan Büyümesi Endotel Hücrelerinin (BOEC) Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet