Name: Üç Günlük Gelişmekte Olan Civciv Embriyosu Kullanılarak Hook İskemi-Reperfüzyon Modelinin Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: Öğrenin, üç günlük gelişmekte olan civciv embriyosunda Hook iskemi-reperfüzyon modelini oluşturmayı. Bu maliyet etkin ve tekrarlanabilir yöntem, inme patofizyolojisini araştırmak ve potansiyel tedavileri test etmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Videografi ve düzenleme sırasındaki eleştirel girişleri için Hari Shankar'a, seslendirme için Bay Baqer Hussain'e, video düzenleme için Bay Asghar Rizvi'ye, video çekimleri için Bay Mohammad Haider'e, deneyler sırasında yardım için Bay Mohammad Danish Siddiqui'ye şükranlarımızı sunmak istiyoruz.

Era's Lucknow Tıp Koleji ve Hastanesi Kurumsal Hayvan Etik Komitesi, bu deneylerin Hayvanlar Üzerinde Deneylerin Kontrol ve Gözetimi Komitesi (CPCSEA) uyarınca yapılması için resmi bir onay gerek olmadığını belirten yazılı bir feragatname yayınladı. Bununla birlikte, embriyonik sıkıntı potansiyelini en aza indirmek için Standart Çalışma Prosedürleri izlendi.
1. Tampon hazırlama (Tablo 1)
<ol><li>Ringer'ın çözümünü hazırlayın<ol>
<li>Ringer'ın çözümünü hazırlamak için, 0,72 g NaCl (123 mM), 0,017 g CaCl2 (1,53 mM), 0,037 g KCl (4,96 mM) 70 mL steril damıtılmış H2O'da son hacim 100 mL çözün. pH'ı 7,4'e ayarlayın. Tamamen çözünmesine ve otoklav olmasına izin verin. Ardından, 0,22 μm filtreden filtreleyin, tek kullanımlık miktarlarda (yaklaşık 10 mL) aliquot yapın ve oda sıcaklığında saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Normal salin hazırlayın (%0,9 Sodyum Klorür, NaCl).<ol>
<li>70 mL steril damıtılmış H2O'da, 0,9 g NaCl (154 mM) çözün. Sesi 100 mL'ye kadar yapın. 121 °C'de 15 dakika otoklav. Gerekirse pH'ı 0,1 N HCl veya 0,1 N NaOH ile 7,4'e ayarlayın. 15 mL steril santrifüj tüpünde 10 mL aliquot yapın ve oda sıcaklığında saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>%70 etanol (v/v) hazırlayın.<ol>
<li>70 mL saf etanol (Mol. wt. 46.07 g/L) ila 30 mL steril H2O karıştırın. Sterilizasyona gerek yoktur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1x Fosfat Tampon Salin (1x PBS) hazırlayın.<ol>
<li>0,144 g Na2HPO4·7H2O (5,37 mM), 0,8 g NaCl (136,8 mM), 0,2 g KCl (26,8 mM), 0,2 g KH2PO4 (14) ekleyerek 100 mL 1x PBS hazırlayın. 6 mM) ila 70 mL damıtılmış su. Çözün ve hacmi 100 mL'ye kadar yapın ve 121 °C'de 15 dakika boyunca otoklav yapın. Gerekirse 0,1 N HCl veya 0,1 N NaOH damlası ekleyerek pH'ı 7,4'e getirin. 15 mL steril santrifüj tüpünde 10 mL'lik aliquots yapın ve oda sıcaklığında saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Gün 1
<ol><li>Yumurta sterilizasyonu için gerekli tüm aletleri düzenleyin (%70 etanol, temizleme mendilleri, yumurta rafı ve OHP işaretleyici).</li>
	<li>Kağıt mendil mendil kullanarak 0 günlük yumurtaları % 70 etanol ile temizleyin. Sadece 0 günlük bir yumurta kullanın, çünkü yaşlı yumurtalar bir embriyoya yol vermeyebilir.</li>
	<li>Geçerli tarihi bir OHP işaretleyicisi ile yumurtalara yazın.</li>
	<li>Yumurtaları 36-37 ° C sıcaklığa ve% 60-65 nem seviyesine ayarlanmış bir yumurta inkübatörüne yerleştirin. Yumurtaları sonraki 24 saat kuluçkaya yatır.</li>
</ol>3. Gün 2
<ol><li>5-6 mL albümin çekilmesi için gerekli ekipmanı düzenleyin (keskin kenar makası, 5 mL şırınga, 18 G iğne, şırınga atar ve yapışkan bant).</li>
	<li>Cerrahi makası% 70 etanol ile silin veya% 70 etanol ile sildikten sonra bir otoklav kullanarak sterilize edin.</li>
	<li>Şimdi yumurtayı katmanlama için 37 °C yumurta inkübatöründen alın.</li>
	<li>Yumurtayı temiz bir yumurta rafı üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Yumurtanın kenarına küçük bir yapışkan bant parçası (boyut: yaklaşık 1 inç uzunluğunda x genişlik) takın.</li>
	<li>Keskin uçlu kenar makası kullanarak yumurta kabuğunun kenarında küçük bir delik açın. Yaklaşık 75° açıyla 5 mL şırınna yerleştirin. NOT: 5 mL şırınga 24 G x 1 iğne (steril) ile birlikte gelir, ancak 24 G x 1 iğneyi 18 G x 1,5 iğne (steril) ile değiştirmek iyidir. 18 G x 1,5 iğnenin genişliği 1,25 x 38 mm'dir. Bu nedenle, albümin çıkarılmasını kolaylaştıracaktır.</li>
	<li>İğneyi yumurta sarısı kesesine yerleştirdikten sonra yavaşça 5-6 mL albümin çekin. NOT: Bu, embriyoya üzerinde büyüyebileceği bir yatak sağlar. Albümin'i geri çekmek, bir pencere oluştururken albümin aşırı yayılmasını önler. Son olarak, 5-6 mL albümin ortadan kaldırılarak embriyonun pencereleme sırasında hasar görme riski azaltılır.</li>
	<li>Albümini çıkardıktan sonra, açıklığı yapışkan bantla yeniden yapıştırın ve yumurtaları 48 saat boyunca 37 ° C'de kuluçkaya bırakın.</li>
</ol>4. Gün 4
<ol><li>Protokolün bölüm 1'inde açıklandığı gibi Ringer'ın çözeltisini, %0,9 normal salin ve 1x PBS hazırlayın. Ardından, üç çözümü otomatik olarak örtün. Otoklavlamadan sonra, ilgili çözeltiyi oda sıcaklığına yerleştirin.</li>
	<li>Yumurtayı 37 °C yumurta inkübatöründen çıkar ve kabuğu dairesel bir şekle sok. Yumurta kabuğunü kesmeden önce kesilecek bölgeyi yapışkan bantla örtün. NOT: Pencere alanını yapışkan bantla örtmek, yumurta kabuğunun istenmeyen yerlere kırılmasını önler. Ancak, istenmeyen bir yere girerseniz, bölgeyi yapışkan bantla kapatın. Kesilecek yerlerin yapışkan bantla kaplanması kabuk parçalarının yumurta sarısı kesesine düşmesini önler.</li>
	<li>Pencerelemenin istendiği yerde keskin sivri kenar makası ile yumurta kabuğunda küçük bir delik oluşturun ve dairesel bir açıklık kesmeye başlayın. Bu işlem pencereleme olarak bilinir. NOT: Dairesel kesimin embriyoya herhangi bir yönden kolay erişim sağlayacak kadar büyük olduğundan emin olun. Gerekirse, embriyonun konumunu karşılamak için yumurta pozisyonunu değiştirin.</li>
	<li>Ardından, stereo zoom cerrahi mikroskop kullanarak sağ vitellin arterini (RVA) bulun. NOT: Tavuk embriyoları normalde torasik burulmaya (servikal fleksür vb.) geliştikçe, başın sol tarafının 72 saat aşamada sarısına karşı olması gibi. Daha kaudally, vitelline arterlerin vücuttan çıktığı yerde, embriyo çok fazla bükülmez ve vücudun bu kısmı yumurta sarısına doğru ventral tarafta uzanır. Yani, doğrudan, embriyonun hakkı araştırmacının sağındadır.</li>
	<li>RVA bulunduktan sonra, RVA'nın sol ve sağ taraflarında 26 G'lik bir iğne kullanarak iki küçük delik oluşturun (Şekil 2).</li>
	<li>Doppler kan akışı görüntüleme sondasını RVA'nın üstüne yerleştirin. Doppler kan akışı görüntüleme probunun iskemi bölgesinden 5 ± 1 mm uzakta ve RVA'nın distal ucuna doğru yerleştirildiklerinden emin olun. 2 dakika ve 30 s (veya istenirse daha uzun) için bir akı okuması alın. Bu normoksik faz okuması olacak.</li>
	<li>Bu arada burun plier ve dişli kastlar kullanarak omurilik iğnesinin kenarını kanca şeklinde manuel olarak kalıplayın (Şekil 3). Bunu, omurilik iğnesinin kenarını yaklaşık 1 mm bükerek yapın. Daha büyük bir boyut, I/R işlemi sırasında omurilik iğnesinin yerleştirilmesini ve çıkarılmasını daha zor hale getirecektir.</li>
	<li>Omurilik iğnesini bir mikromanipülatör kullanarak sağ vitellin arterinin tam altına yerleştirin. NOT: RVA'ya veya bitişik arterlere zarar vermemek için omurilik iğnesini çok dikkatli yerleştirin. En uygun teknik, omurilik iğnesinin özel tasarlanmış kancasını RVA deliğinin sağ tarafının tam üstüne ayarlamak ve ardından omurilik iğnesinin özel tasarlanmış kenarını, sağ delikten stereo zoom cerrahi mikroskop rehberliğinde bir mikromanipülatör yardımıyla yavaş yavaş yumurta sarısı kesesine yerleştirmektir. Omurilik iğnesinin kancası yumurta sarısı kesesine girdikten sonra, RVA'nın altındaki kancayı yavaş yavaş ayarlayın, böylece kenarı tam olarak sol deliğin altına yerleştirilir. Şimdi omurilik iğnesini kaldırma zamanı.</li>
	<li>Şimdi, mikromanipülatörün yardımıyla, Doppler kan akışı akısı arteriyel akışta minimum% 80'lik bir azalmaya işaret edene kadar arteri kademeli olarak kaldırın.</li>
	<li>Doppler akısında% 80 veya daha fazla bir düşüş elde edildikten sonra, omurilik iğnesini 5 dakika boyunca kaldırın (arteri yukarı çekerek). Bu, RVA'daki iskemi dönemi olacaktır. NOT: İskemi süresince Doppler akısının izlenmesi kritik öneme sahiptir. Önemli miktarda dalgalanma bulunursa, testleri sonlandırın.</li>
	<li>5 dakikalık iskemi döneminden sonra, normal kan akışı seviyelerini geri kazanmak için arteri yavaş yavaş serbest bırakın. Doppler kan akış ölçütüsü okumasının normoksi sırasında elde edilenlerle karşılaştırılabilir değerler görüntülediğine emin olun. Bu, RVA'daki reperfüzyon dönemi olacaktır (Şekil 4).</li>
	<li>I/R işleminden sonra embriyoya birkaç damla (2-3) 1x PBS uygulayın ve 2-3 dakika izleyin. NOT: 1x PBS kullanımı embriyonun kurumasını önlemeye yardımcı olur.</li>
	<li>Son olarak, pencereyi yapışkan bantla yeniden yerleştirin ve yumurtayı 5 saat 55 dakika boyunca yumurta inkübatörüne geri yerleştirin.</li>
	<li>5 saat 55 dakika sonra, yumurtayı yumurta inkübatörden alın, yumurta rafı üzerine yerleştirin, pencereyi yeniden açın ve aşağı akış tedavi protokolünü izleyin.</li>
</ol>5. Tedaviler
<ol><li>Arterlerin ilaçlar, aktivatörler veya inhibitörlerle tedavisi için, I/R işleminin 1 saat sonra RVA'yı kesin.</li>
	<li>Aşağı akış çalışmaları için, önce embriyoyu steril 90 mm Petri kabına yerleştirerek yumurta kabuğundan çıkarın.</li>
	<li>Embriyo Petri kabına salındıktan sonra, stereo zoom cerrahi mikroskobun rehberliğinde oküler iris kullanarak RVA'yı dışarı atın.</li>
	<li>RVA'nın eksizyon boyutunun 15 ± 1 mm'ye (gövdeden distal), atardamarın sol ve sağ tarafında 5 ± 1 mm'ye ve gövdeye doğru 2 ± 1 mm'ye kadar olduğundan emin olun. NOT: Eksilecek alanı ölçmek için bir cetvel kullanılabilir (isteğe bağlı).</li>
	<li>RVA'yı eksize ettikten sonra, 1x PBS içeren steril bir Petri kabında 1x PBS ile yıkayın.</li>
	<li>İstenilen tedaviler için, arteri 500 μL Ringer çözeltisi ile dolu 1,5 mL santrifüj tüpüne (sterilize edilmiş) yerleştirin. RVA'yı santrifüj tüpüne yerleştirin ve 5 saat 55 dakika boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. NOT: Tedavilere bağlı olarak, ringer'ın çözeltisini herhangi bir tedavi olmadan veya istenen ilaç, aktivatör veya inhibitör hacmi ve konsantrasyonu ile tedavi edin.</li>
	<li>5 saat 55 dk inkübasyondan sonra, RVA'yı 37 °C laboratuvar inkübatöründen çıkar ve istenen tedavilere devam edin.</li>
</ol>

<ol><li>Fauzia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+Embryo%3A+A+Preclinical+Model+for+Understanding+Ischemia-Reperfusion+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Chick Embryo: A Preclinical Model for Understanding Ischemia-Reperfusion Mechanism.</a> Frontiers in Pharmacology. 21 (9), 1034(2018).</li>
<li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li>
<li>Raza, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effect+of+naringenin+is+mediated+through+suppression+of+NF-%CE%BAB+signaling+pathway+in+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effect of naringenin is mediated through suppression of NF-κB signaling pathway in experimental stroke.</a> Neuroscience. 29 (230), 157-171 (2013).</li>
<li>Raza, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hesperidin+ameliorates+functional+and+histological+outcome+and+reduces+neuroinflammation+in+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Hesperidin ameliorates functional and histological outcome and reduces neuroinflammation in experimental stroke.</a> Brain Research. 28 (1420), 93-105 (2011).</li>
<li>Raza, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silymarin+protects+neurons+from+oxidative+stress+associated+damages+in+focal+cerebral+ischemia%3A+a+behavioral%2C+biochemical+and+immunohistological+study+in+Wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Silymarin protects neurons from oxidative stress associated damages in focal cerebral ischemia: a behavioral, biochemical and immunohistological study in Wistar rats.</a> Journal of the Neurological Sciences. 15 (1-2), 45-54 (2011).</li>
<li>Fan, L., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AG490+protects+cerebral+ischemia%2Freperfusion+injury+via+inhibiting+the+JAK2%2F3+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">AG490 protects cerebral ischemia/reperfusion injury via inhibiting the JAK2/3 signaling pathway.</a> Brain and Behavior. 11 (1), 01911(2021).</li>
<li>Wu, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Mechanistic+Concepts+in+Ischemia+and+Reperfusion+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Current Mechanistic Concepts in Ischemia and Reperfusion Injury.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 46 (4), 1650-1667 (2018).</li>
<li>Collard, C. D., Gelman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology%2C+clinical+manifestations%2C+and+prevention+of+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury.</a> Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).</li>
<li>Allen, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+as+in+vitro+models+for+drug+screening+and+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Development+and+Industrial+Pharmacy%22%5BJournal%5D)">Cell lines as in vitro models for drug screening and toxicity studies.</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 31 (8), 757-768 (2005).</li>
<li>Schmeer, C., Gamez, A., Tausch, S., Witte, O. W., Isenmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins+modulate+heat+shock+protein+expression+and+enhance+retinal+ganglion+cell+survival+after+transient+retinal+ischemia%2Freperfusion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Statins modulate heat shock protein expression and enhance retinal ganglion cell survival after transient retinal ischemia/reperfusion in vivo.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (11), 4971-4981 (2008).</li>
<li>Huang, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+and+meta-analysis+of+acupuncture+for+improving+learning+and+memory+ability+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Complementary+and+Alternative+Medicine%22%5BJournal%5D)">A systematic review and meta-analysis of acupuncture for improving learning and memory ability in animals.</a> BMC Complementary and Alternative Medicine. 16 (1), 297(2016).</li>
<li>Sommer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke%3A+Experimental+models+and+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke: Experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).</li>
<li>Yang, W., Chen, J., Meng, Y., Chen, Z., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+targets+for+treating+ischemia-reperfusion+injury+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Novel targets for treating ischemia-reperfusion injury in the liver.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1302(2018).</li>
<li>Seabra, R., Bhogal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+research+using+early+life+stage+models%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">In vivo research using early life stage models.</a> In Vivo. 24 (4), 457-462 (2010).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiponectin+peptide+alleviates+oxidative+stress+and+NLRP3+inflammasome+activation+after+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+by+regulating+AMPK%2FGSK-3beta%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Adiponectin peptide alleviates oxidative stress and NLRP3 inflammasome activation after cerebral ischemia-reperfusion injury by regulating AMPK/GSK-3beta.</a> Experiments in Neurology. 329, 113302(2020).</li>
<li>Aboutaleb, N., Jamali, H., Abolhasani, M., Pazoki Toroudi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lavender+oil+%28Lavandula+angustifolia%29+attenuates+renal+ischemia%2Freperfusion+injury+in+rats+through+suppression+of+inflammation%2C+oxidative+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+and+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Lavender oil (Lavandula angustifolia) attenuates renal ischemia/reperfusion injury in rats through suppression of inflammation, oxidative stress and apoptosis.</a> Biomedicine and Pharmacotherapy. 110, 9-19 (2019).</li>
<li>Wallert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Tocopherol+preserves+cardiac+function+by+reducing+oxidative+stress+and+inflammation+in+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">alpha-Tocopherol preserves cardiac function by reducing oxidative stress and inflammation in ischemia/reperfusion injury.</a> Redox Biology. 26, 101292(2019).</li>
<li>Ashafaq, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catechin+hydrate+ameliorates+redox+imbalance+and+limits+inflammatory+response+in+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Catechin hydrate ameliorates redox imbalance and limits inflammatory response in focal cerebral ischemia.</a> Neurochemical Research. 37 (8), 1747-1760 (2012).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759(2008).</li>
<li>Abt, M. A., Grek, C. L., Ghatnekar, G. S., Yeh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+lung+metastasis+in+mouse+mammary+tumor+models+by+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53329(2016).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3923(2012).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathelicidin+aggravates+myocardial+ischemia%2Freperfusion+injury+via+activating+TLR4+signaling+and+P2X%287%29R%2FNLRP3+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cathelicidin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via activating TLR4 signaling and P2X(7)R/NLRP3 inflammasome.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 139, 75(2020).</li>
<li>Franke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NLRP3+inflammasome+drives+inflammation+in+ischemia%2Freperfusion+injury+after+transient+middle+cerebral+artery+occlusion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behaviour+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The NLRP3 inflammasome drives inflammation in ischemia/reperfusion injury after transient middle cerebral artery occlusion in mice.</a> Brain Behaviour and Immunity. 92, 223(2021).</li>
<li>Lawrence, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+factor+NF-kappaB+pathway+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), 001651(2009).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pterostilbene+attenuates+astrocytic+inflammation+and+neuronal+oxidative+injury+after+ischemia-reperfusion+by+inhibiting+NF-kappaB+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pterostilbene attenuates astrocytic inflammation and neuronal oxidative injury after ischemia-reperfusion by inhibiting NF-kappaB phosphorylation.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2408(2009).</li>
<li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sivelestat-loaded+nanostructured+lipid+carriers+modulate+oxidative+and+inflammatory+stress+in+human+dental+pulp+and+mesenchymal+stem+cells+subjected+to+oxygen-glucose+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering%3A+C+Materials+for+Biological+Applications%22%5BJournal%5D)">Sivelestat-loaded nanostructured lipid carriers modulate oxidative and inflammatory stress in human dental pulp and mesenchymal stem cells subjected to oxygen-glucose deprivation.</a> Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 120, 111700(2021).</li>
<li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+enhances+autophagy+in+stem+cells+through+Erk1%2F2+signaling+pathway+-+implications+for+neurotransplantations%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress enhances autophagy in stem cells through Erk1/2 signaling pathway - implications for neurotransplantations.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).</li>
<li>Ahmad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin-coated+polycaprolactone+nanoparticle-mediated+naringenin+delivery+rescue+human+mesenchymal+stem+cells+from+oxygen+glucose+deprivation-induced+inflammatory+stress%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Gelatin-coated polycaprolactone nanoparticle-mediated naringenin delivery rescue human mesenchymal stem cells from oxygen glucose deprivation-induced inflammatory stress.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (2), 683-695 (2019).</li>
<li>Guan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroprotective+effects+of+carvacrol+on+ischemia%2Freperfusion-induced+hippocampal+neuronal+impairment+by+ferroptosis+mitigation%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science%22%5BJournal%5D)">The neuroprotective effects of carvacrol on ischemia/reperfusion-induced hippocampal neuronal impairment by ferroptosis mitigation.</a> Life Science. 235, 116795(2019).</li>
<li>Jin, Z., Guo, P., Li, X., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+irisin+against+cerebral+ischemia%2F+reperfusion+injury+via+Notch+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+and+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of irisin against cerebral ischemia/ reperfusion injury via Notch signaling pathway.</a> Biomedicine and Pharmacotherapy. 120, 109452(2019).</li>
<li>Wainrach, S., Sotelo, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+study+of+the+developing+chick+embryo+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+fur+Zellforschung+und+mikroskopische+Anatomie%22%5BJournal%5D)">Electron microscope study of the developing chick embryo heart.</a> Zeitschrift fur Zellforschung und mikroskopische Anatomie. 55, 622-634 (1961).</li>
<li>Joshi, V. C., Wilson, A. C., Wakil, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+for+the+terminal+enzyme+of+the+stearoyl+coenzyme+A+desaturase+system+using+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Assay for the terminal enzyme of the stearoyl coenzyme A desaturase system using microsomes.</a> Journal of Lipid Research. 18 (1), 32-36 (1977).</li>
<li>Kain, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+embryo+as+an+expanding+experimental+model+for+cancer+and+cardiovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Dynamics%22%5BJournal%5D)">The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research.</a> Development Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).</li>
<li>Mann, R. A., Moore, K. L., Persaud, T. V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+in+the+u%7Ee+of+the+early+chick+embryo+88+a+teratological+model%5BTitle%5D)+AND+%22Teratology%22%5BJournal%5D)">Limitations in the u~e of the early chick embryo 88 a teratological model.</a> Teratology. 7, 22-23 (1973).</li>
<li>Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+English+and+Translation+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vitro models of ischemia-reperfusion injury.</a> Regenerative English and Translation Medicine. 4 (3), 142-153 (2018).</li>
<li>Ma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+cerebral+ischemia%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+and+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Animal models of cerebral ischemia: A review.</a> Biomedicine and Pharmacotherapy. 131, 110686(2020).</li>
<li>Bromage, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+ischaemic+conditioning+reduces+infarct+size+in+animal+in+vivo+models+of+ischaemia-reperfusion+injury%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Remote ischaemic conditioning reduces infarct size in animal in vivo models of ischaemia-reperfusion injury: a systematic review and meta-analysis.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 288-297 (2017).</li>
<li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).</li>
<li>Hogers, B., DeRuiter, M. C., Baasten, A. M., Gittenberger-de Groot , A. C., Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracardiac+blood+flow+patterns+related+to+the+yolk+sac+circulation+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Intracardiac blood flow patterns related to the yolk sac circulation of the chick embryo.</a> Circ Res. 76 (5), 871-877 (1995).</li>
<li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((angiogenesis-inflammation+cross+talk+in+diabetic+retinopathy%3A+novel+insights+from+the+chick+embryo+chorioallantoic+membrane%2Fhuman+vitreous+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">angiogenesis-inflammation cross talk in diabetic retinopathy: novel insights from the chick embryo chorioallantoic membrane/human vitreous platform.</a> Frontiers in Immunology. 11, 581288(2020).</li>
</ol>

Yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.

İskemi-reperfüzyon araştırmalarının amacı, hücre ölümünü önleyen ve iyileşmeyi teşvik eden terapötik stratejiler oluşturmaktır29,30. I/R araştırmalarındaki mevcut kısıtlamaların üstesinden gelmek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir I/R modeli üretmek için hook I/R civciv embriyo modeli tasarladık. Bilgimize göre, bizimki, stres sinyallerini (örneğin, oksidatif ve enflamatuar stres) incelemenin yanı sıra, rutin I /R deneyleri için 3 günlük civciv embriyosunda ol...

İskemi-reperfüzyon dokusu hasarı kalp krizi, iskemik inme, travma ve periferik vasküler hastalık dahil olmak üzere bir dizi patoloji ile bağlantılıdır1,2,3,4,5. Bunun nedeni öncelikle hastalığın ilerlemesinin kapsamlı bir şekilde anlaşılmaması ve etkili bir araştırma modelinin bulunmamasıdır. İskemik yaralanma, dokunun belirli bir bölgesine kan akışı kesildiğinde meydana gelir. Sonuç olarak, iskemik doku sonunda nekrotize edilir, ancak oran dokuya bağlı olarak değişir. Bu nedenle, kan akışının geri yüklenmesi hasarı azaltmaya yardımcı olabilir. Bununla birlikte, bazı durumlarda, reperfüzyonin sadece iskemiden daha fazla doku hasarına neden olduğu gözlenmiştir6,7,8. Bu nedenle, etkili bir terapötik müdahale geliştirmek için iskemi-reperfüzyonun moleküler ve hücresel mekanizmalarını anlamak gerekir. Şu anda, I/R yaralanmaları için etkili bir tedavi bilinmamektedir. Bu eşitsizlik, mevcut sorunu çözmek için in vitrodan in vivo modellere kadar yeni deneysel modellerin oluşturulmasına neden oldu9,10,11,12,13.
Civciv embriyoları (Gallus gallus domesticus), erişim kolaylığı, etik kabul edilebilirlik, nispeten büyüklük (diğer embriyolara kıyasla), düşük maliyetli ve hızlı büyümeleri nedeniyle araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır14. Omurilik iğnesi yardımıyla sağ vitellin arterini tıkayıp serbest bırakarak ovo I/R oluşturmak için 72 saat gelişimde bir civciv embriyosu kullandık. Adını Hook-I/R iskemi-reperfüzyon modeli koyduk (Şekil 1). Bu çalışmada kullanılan model, sıklıkla I/R hasarı15,16,17 ile ilişkili olan oksidatif ve enflamatuar yollar da dahil olmak üzere tüm aşağı akış süreçlerini doğru bir şekilde simüle edebilir.

<table><tbody><tr><td>(-80& derece; C) dondurucu</td><td>Haier,</td><td></td> Çin-1.5mL <td></td></tr><tr><td>Santrifüj tüpü</td><td>TARSONS, Hindistan</td><td>500010X</td><td></td></tr><tr><td>100mm Petri kabı (steril)</td> <td>Tarsons, Hindistan</td><td>460050</td><td></td></tr><tr><td>18G İğne (18G ve kez; 1.5 (1.25&kez; 38mm)</td><td>Ramsons, Hindistan</td><td>13990</td><td></td></tr><tr><td>1mL Şırınga</td><td></td> <td>DISPO VAN-26G</td><td></td></tr> <tr><td>İğne (26G ve kez; 1/2 (10.45x13mm)</td><td>DISPO VAN, Hindistan</td><td>30722D</td><td></td></tr><tr><td>37&deg; Ayarlanabilir nem yüzdesi ile C yumurta kuluçka makinesi</td><td>Gentek, Hindistan</td><td>GL-100</td><td></td></tr><tr><td>37 & derece; C laboratuvar inkübatörü</td><td>SCIENCE TECH, Hindistan</td><td>CB 101-14</td><td></td></tr><tr><td>3-Metiladenin (3-MA)</td> <td>Sigma Aldrich, ABD</td><td>M9281</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Mera Pipeti</td><td>TARSONS, Hindistan</td><td>940050</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Beher</td><td>TARSONS,</td> <td>Hindistan-5</td><td></td></tr> <tr><td>mL Şırınga</td><td>DISPO VAN, Hindistan</td><td>IP53</td><td></td></tr><tr><td>%70 etanol</td><td>Merck Millipore, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Yapışkan bant / Çello bandı</td><td>Gündoğumu,</td> <td>Hindistan-Ambra1</td><td></td></tr> <tr><td>astarları</td><td>Uygulamalı Biyosistemler, Foster şehir, ABD</td><td>Hs00387943_m1</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare IgG</td><td>Hücre Sinyal Teknolojisi, ABD</td><td>7076S</td> Anti-Tavşan IgG Jackson İmmüno-Araştırma Laboratuvarları<td></td></tr><tr><td></td>, ABD <td>711-035-152</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atg7 Ar-Ge</td><td> D Systems, ABD</td><td>MAB6608</td><td></td></tr><tr><td>Atg7 primerleri</td><td>Applied Biosystems, Foster city, ABD</td><td>Hs00893766_m1</td><td></td></tr><tr><td>Otoklav Torbası</td><td>Tarsons, Hindistan</td><td>550022</td><td></td></tr><tr><td>Otoklav Makinesi</td><td>Yerel yapım, Lucknow,</td><td></td> Hindistan-Beclin-1 <td></td></tr><tr><td></td><td>Proteintech, ABD</td><td>66665-1-IG</td><td></td></tr><tr><td>Beta Aktin</td><td>ImmunoTag, ABD</td><td>ITT07018</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin Himedia</td><td>, Mumbai, Hindistan</td><td>TC194</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>Himedia, Mumbai, Hindistan</td><td>GRM534</td><td></td></tr><tr><td>Katalaz</td><td>ImmunoTag, ABD</td><td>ITT5155</td><td></td></tr><tr><td>Temizleme mendilleri</td><td>Kimberly-Clark, Hindistan</td><td>370080</td><td></td></tr><tr><td>Bölünmüş Kaspaz3</td><td>ImmunoTag, ABD</td><td>ITT07022</td><td></td></tr><tr><td>di-Sodyum hidrojen fosfat heptahidrat</td><td>Himedia, Mumbai, Hindistan</td><td>GRM39611</td><td></td></tr><tr><td>Doppler kan akış ölçer</td><td>Moors enstrümanı, Birleşik Krallık</td><td>moorVMS-LDF1</td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td>Yumurta rafı</td> - Yumurta rafı - <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>GAPDH</td></tr> <tr><td></td><td>ImmunoTag, ABD</td><td>M1000110</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH primerleri</td><td>Uygulamalı Biyosistemler, Foster şehir, ABD</td><td></td><td></td>Hs02758991_g1</tr><tr><td>Glycine</td><td>Himedia, Mumbai, Hindistan</td><td>MB013</td><td></td></tr><tr><td>Böbrek tepsisi</td><td>HOSPITO-LC3A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>/B</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi, ABD</td><td>4108S</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Rankem laboratuvarları, Mumbai, Hindistan</td><td>M0252</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Narishige, Japonya</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>N-asetil-L-sistein (NAC)</td> <td>Sigma Aldrich, ABD</td><td>A7250</td><td></td></tr><tr><td>Naringenin</td><td>Sigma Aldrich, ABD</td><td>67604-48-2</td><td></td></tr><tr><td>NF-k ve beta;</td><td>Thermo Fisher Scientific, ABD</td><td>51-0500</td><td></td></tr><tr><td>NLRP3</td><td>ImmunoTag, ABD</td><td>ITT07438</td><td></td></tr><tr><td>Burun pensesi</td><td>Yerel yapım, Lucknow,</td> <td>Hindistan-Oküler</td><td></td></tr> <tr><td>forseps</td><td>Çalmak, Almanya</td><td>52106-40</td><td></td></tr><tr><td>Oküler iris</td><td>Tufft Cerrahi Aletler, Jaipur, Hindistan</td><td>Sert Yaş Vannas Mikro Makas Açılı 8CM / 3 1/8 "</td><td></td></tr><tr><td>OHP işaretleyici kalem</td><td>Camlin,</td><td></td> Hindistan-ORP-150 <td></td></tr><tr><td></td><td>ImmunoTag, ABD</td><td>ITT08329</td><td></td></tr><tr><td>Sivri keskin kenarlı makas</td><td>Çalma, Almanya</td><td>52132-11</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Himedia, Mumbai, Hindistan</td><td>MB043</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik susuz</td><td>Himedia, Mumbai, Hindistan</td><td>MB050</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü</td><td>Abcam, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>Ab65621</td><td></td></tr><tr><td>SOD-1</td><td>ImmunoTag, ABD</td><td>ITT4364</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Fisher Scientific, Mumbai, Hindistan</td><td>27605</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>Himedia, Mumbai, Hindistan</td><td>GRM886</td><td></td></tr><tr><td>Omurga iğnesi 25GA; 3,50 INÇ (90,51 X 90mm)</td><td>Ramson, Hindistan</td><td>GS-2029</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Zoom cerrahi mikroskop</td><td>Olympus, Japonya</td><td>SZ2-STU3</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga ıskarta</td><td>BIOHAZARD</td><td>882210</td><td></td></tr><tr><td>Dişli forseps</td><td>Çalma, Almanya</td><td>52102-30</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>G Biosciences, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>RC1217</td><td></td></tr><tr><td>Tris Hidroklorik Asit</td><td>Himedia, Mumbai, Hindistan</td><td>MB030</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>G Biosciences, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>RC1227</td><td></td></tr><tr><td>Beyaz Leghorn Tavuk 0 günlük yumurtalar</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Z-Val-Ala-Asp (OMe) -FMK</td><td>MP Biomedicals, LLC, ABD</td><td>FK009</td><td></td></tr></tbody></table>

Üç günlük gelişmekte olan civciv embriyosu kullanılarak hook İskemi-reperfüzyon modelinin Üretimi

Generation of Hook Ischemia-Reperfusion Model using a Three-Day Developing Chick Embryo

Miyokard enfarktüsü, inme ve periferik vasküler hastalık gibi iskemi ve reperfüzyon (I/R) bozuklukları hastalık ve ölümün önde gelen nedenlerinden birkaçıdır. Birçok in vitro ve in vivo model şu anda hastalık veya hasarlı dokularda I/R mekanizmasını incelemek için mevcuttur. Bununla birlikte, bugüne kadar, I/R mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasını ve daha hızlı ilaç taramasını sağlayacak ovo I/R modelinde hiçbir şey bildirilmemiştir. Bu makalede, I/R gelişim ve tedavi mekanizmalarını anlamak için 3 günlük civciv embriyosunda omurilik iğnesi özelleştirilmiş kanca kullanılarak yapılan I/R modellemesi açıklanmaktadır. Modelimiz DNA, RNA ve protein seviyelerindeki anomalileri araştırmak için kullanılabilir. Bu yöntem basit, hızlı ve ucuzdur. Mevcut model bağımsız olarak veya mevcut in vitro ve in vivo I/R modelleri ile birlikte kullanılabilir.

Modelimizin etkinliğini değerlendirmek için Doppler Kan Akışı Görüntüleme tekniği kullanılmıştır. Kısacası, yarattığımız başarıyı belirlemek için kontrol grubundan gelen verileri RVA grubundan gelen verilerle karşılaştırdık. Şekil 4A , kontrol hayvanıyla ilişkili tipik bir akıyı tasvir ederken, Şekil 4B...

Bu makalede, I/R gelişimini ve tedavisini daha iyi anlamak için omurilik iğnesi özelleştirilmiş kanca kullanılarak 3 günlük civciv embriyosunda iskemi-reperfüzyon (I/R) modellemesi açıklanmaktadır. Bu model basit, hızlı ve ucuzdur.

Üç Günlük Gelişmekte Olan Civciv Embriyosu Kullanılarak Hook İskemi-Reperfüzyon Modelinin Üretimi

Ischemia and reperfusion (I/R) disorders, such as myocardial infarction, stroke, and peripheral vascular disease, are a few of the leading causes of ...

Merhaba, ben Dr.Syed Shadab Raza, Hindistan'ın Lucknow kentindeki Era Üniversitesi Kampüsü Biyoteknoloji Bölümü'nde bulunan Kök Hücre ve Restoratif Nöroloji Laboratuvarı'nın baş araştırmacısıyım. Laboratuvarımda, iskemi-reperfüzyon bozukluklarının altında kalan patofizyolojik mekanizmayı ve bu süreçleri tersine çevirebilecek müdahaleleri anlamaya çalışıyoruz. Bu kapsamda iskemik inmenin in vitro ve in vivo modelini sıklıkla kullandırıyoruz.Son zamanlarda, gelişen üç günlük civciv embriyosunda iskemik-reperfüzyon yaralanma modeli oluşturduk. Şimdi öğrencilerim size iskemi-reperfüzyon hasarının üç gün içinde civciv embriyosu geliştirerek nasıl çoğaltılacağını gösterecekler. Şimdi size üç günlük civciv embriyosunda iskemi-reperfüzyonun nasıl oluşturulacağını göstereceğiz.Modelimiz uygun maliyetli, zaman etkili ve son derece tekrarlanabilir. Hadi başlayalım. İlk gün.İlk gün için gereksinimler. Prosedür. Kağıt mendil mendil kullanarak sıfır gün yumurtasını % 70 etanol ile temizleyin. Daha sonra, geçerli günü, tarihi, OHP işaretleyicili yumurtalara yazın ve ardından yumurtaları 36 ila 37 derece Santigrat derece ve% 60 ila 65 nem oranına sahip bir yumurta inkübatörüne yerleştirin.Yumurtaları 24 saat kuluçkaya yatır. İkinci gün. İkinci gün için gereksinimler. Prosedür.Cerrahi makası %70 etanol veya ardından bir otoklav ile silin. 24 saatlik inkübasyondan sonra, yumurtayı katmanlama için inkübatörden çıkarın. Daha sonra, yumurtanın kenarına yaklaşık bir inç uzunluğunda ve genişliğinde küçük bir parça Sellotape takın ve ardından keskin uçlu kenar makasını kullanarak yumurta kabuğunun kenarına küçük bir delik açın ve ardından yaklaşık 75 derecelik açıyla beş mL şırınnanın yerleştirilmesini takip edin.İğneyi yumurta sarısı çuvalına yerleştirdikten sonra yavaşça beş ila altı mL albümin çekin. Albümini çıkardıktan sonra, deliği Sellotape ile yeniden çıkarın ve yumurtayı önümüzdeki 48 saat boyunca 37 derecelik Santigrat yumurta inkübatörüne geri koyun. Dördüncü gün.Dördüncü gün için gereksinimler. Prosedür. Bu yazıda verilen tablolara göre Ringer'ın çözeltisini, %0,9 normal salin ve bir X fosfat tampon salinini hazırlayın. Ardından üç çözümü otomatik olarak örtün.Otoklavdan sonra, ilgili çözeltiler oda sıcaklığına yerleştirilecek. Daha sonra, yumurtayı 37 derecelik yumurta inkübatöründen çıkar. Şimdi, kabuğu kesmeden önce, pencere alanını Sellotape ile örtün.Ve şimdi yumurta kabuğuna küçük bir delik açın ve dairesel bir açıklık kesmeye başlayın. Bu işlem pencereleme olarak bilinir. Yumurtanın konumunun embriyonun konumuna göre ayarlanması gerekebileceğinden, dairesel kesimin yeterince büyük olduğundan emin olun, böylece embriyoya herhangi bir yönden kolayca erişilebilir.Şimdi, stereo zoom cerrahi mikroskobu kullanarak, doğru vitalline arteri veya RVA'yı bulun. Burada, ok embriyonun üç günlük gelişim aşamasını gösterir. RVA yer aldıktan sonra, 26 G iğnesi kullanılarak RVA'nın sol ve sağ taraflarında iki küçük delik açın.Ardından, Doppler kan akışı görüntüleme probunun RVA'ya ayarını yapın. Doppler kan akışı görüntüleme probu iskemi bölgesinden beş artı eksi bir milimetre ve RVA'nın distal ucunun üçte ikisi yerleştirilmelidir. Akı okumasını istediğiniz gibi 30 saniye ila iki dakika boyunca alın.Bu, normoksi faz okumasını yapacaktır. Şimdi omurilik iğnesinin kenarını manuel olarak kalıplayarak kenara bir burun plier ve ardından diş tosları yardımıyla bir kanca şekli verin. Şimdi, bir mikro manipülatör kullanarak, omurilik iğnesini sağ vitalline arterinin hemen altına yerleştirin.Omurilik iğnesini kaldırmaya hazırsın. Şimdi mikro manipülatörün yardımıyla, Doppler kan akışı akışı arteriyel akışta minimum% 80 azalma gösterene kadar arteri yavaşça kaldırın. Doppler akısında% 80 veya daha fazla bir düşüş elde edildikten sonra, omurilik iğnesini yukarı doğru kaldırarak beş dakika boyunca arteri çekerek bırakın.Bu iskemi dönemi olacak. Beş dakikalık bu iskemik zamanlamadan sonra, normal kan akış seviyelerini geri kazanmak için mikro manipülatör yardımıyla atardamarı yavaşça serbest bırakın. Şimdi Doppler kan akış ölçer normoksi sırasında gözlemlenenlere benzer okumalar göstermelidir.Bu, RVA'daki reperfüzyon dönemi olacaktır. I/R işleminden sonra embriyoya iki, üç damla 1X PBS uygulayın. Son olarak, pencereyi Sellotape ile yeniden yerleştirin ve ardından yumurtayı beş saat 55 dakika boyunca yumurta inkübatörüne geri yerleştirin.Beş saat 55 dakika sonra yumurtayı yumurta inkübatörden çıkarıp yumurta tepsisine yerleştirin ve pencereyi yeniden açın. Tedavi gereksinimleri. Prosedür. Atardamarların ilaçlar, aktivatörler veya inhibitörlerle tedavisi için, RVA bir saatlik I/R işleminden sonra eksüze edilmelidir.Embriyoyu kabuktan çıkararak steril bir 100 mm Petri kabına çıkarın. Embriyo Petri kabına salındıktan sonra, stereo zoom cerrahi mikroskop rehberliğinde oküler iris kullanarak RVA'yı dışarı atın. RVA'nın eksizyon boyutu gövdeden 15 artı eksi bir milimetre distal ve gövdeye doğru iki artı eksi bir milimetre olmalıdır.RVA'yı excised sonra, yeni, steril petri kabında 1X PBS ile yıkayın. İstenilen tedaviler için, arteri Ringer çözeltisinin 500 mikrolitresi ile doldurulmuş sterilize edilmiş 1,5 mililitre santrifüj tüpüne koyun. Ve atardamarı santrifüj tüpüne yerleştirdikten sonra, beş saat boyunca 37 derecelik Santigrat laboratuvar inkübatörüne koyun.Beş saatlik inkübasyondan sonra, RVA'yı 37 derecelik Santigrat laboratuvar inkübatöründen çıkar ve istenen tedavilere devam edin. Ve şimdi, sonuçları sunmak için. iskemik arterlerde iskemik reperfüzyon araştırmalarında modelimizin faydasını doğrulamak için, önce oksijen düzenleyici proteinler 150 veya ORP150, sitoplazmik süperoksit dismutaz bir veya SOD1 ve katalazın faaliyetlerine baktık.I/R ile tedavi edilen RTA'lar, kontrol grubuna kıyasla ORP150, sitoplazmik SOD1 ve katalaz aktivitesinin arttığını göstermiştir, ancak mevcut rakamda da görüldüğü gibi, N-asetil-L-sistein veya bir ROS quencher olan NAC ile takviye, I/R grubunda oksidatif stresi azaltmıştır. Bu modelin enflamatuar araştırmalar için yararını belirlemek için, I/R-tedavi edilen RA'larda kontrol RVA'larına karşı I/R-1 beta ve TNF-alfa ifadesine baktık. Her iki interlökün de kontrol grubuna kıyasla Hook-I/R grubunda aşırı eksprese edildiği tespit edildi.Antienflamatuar bir ilaç olan Naringenin takviyesi, IL1-beta ve TNF-alfa seviyelerini önemli ölçüde azalttı. Daha sonra, Batı blotting yoluyla NLRP3 ve NF-kappa beta ifadesini inceledik. Bu analiz, RVA'da üretilen I/R'ye yanıt olarak NLRP3 inflamazomunun yanı sıra NF-kappa betasının aktivasyonuna dair kanıtlar keşfetti.Önceki sonuçlara benzer şekilde, Naringenin NLRP3 ve NF-kappa beta ifadesini azalttı. Bu sonuçlar, modelimizin enflamatuar değişiklikleri araştırmak için kullanılabileceğini göstermiştir. Daha sonra, I/R'nin apoptoz ve otofaji yolları üzerindeki etkisini inceledik.İlk olarak, A rakamında, bölünmüş caspase-3 ifadesine erişdik. Kontrol grubuna göre I/R grubunda bölünmüş kaspaz-3'ün gelişmiş bir ekspresyonunu gözlemledik, ZVADFMK alan I/R grubu ise fısta-3 ekspresyonunda azalma gösterdi. Otofaji için benzer şekilde, I/R grubu yüksek protein seviyeleri LC3, memeli hücrelerinde otofajinin önemli bir düzenleyicisi olan otofagozom belirteci Beclin-1 ve bazal otofaji için gerekli bir protein olan ATG-7'yi kontrol grubuna göre sergilerken, otofaji inhibitörü olan 3-ma alan gruplar, yukarıdaki üç otofaji proteininin ifadesinde bir azalma gösterdi. B'den D'ye kadar olan rakamlardan da görüldüğü gibi E rakamı, Hook aracılı I/R'nin ambra-1 ve ATG-7 mRNA seviyeleri üzerindeki etkisini göstermektedir.Bu sonuçlar önceki sonuçlarla uyumluydu, yani I/R ile tedavi edilen RTA'larda ambra-1 ve ATG-7 için ilgili kontrollere kıyasla gelişmiş mRNA ekspresyolü gözlendi. Ancak, I/R grubuna 3-ma eklendiğinde sonuçlar tersine çevrildi. Mevcut rakam, dna'daki değişiklikleri incelemek için modelimizin etkinliğini temsil ediyor.I/R-tedavi grubunda kontrol grubuna göre yoğun bir DNA smear gözlemledik. Ancak NAC'nin I/R RVA grubuna takviyesi sonucu tersine çevirdi. Modelimizin diğer modellerin aksine ne kadar etkili olduğunu incelemek için, hook-I/R modelimiz ve MCAO modeli tarafından oluşturulan verileri mevcut deneyde karşılaştırdık.Özetlemek gerekirse, apoptotik proteinin ekspresyözü, bölünmüş kaspaz-3, otofaji proteinleri, Beclin-1 ve ATG-7 ve enflamatuar interlökinler, TNF ve IFN, I/R ile tedavi edilen RVA'larda kontrol edilen RVA'lardan daha yüksek olması gerekiyordu. İlginçtir ki, Hook-I/R modeli, ister enflamatuar stres ister hücresel ölüm yolları için analiz olsun, MCAO modeli tarafından elde edilenlere çok benzeyen sonuçlar verdi. Modelimiz, mevcut modellere tek başına veya paralel olarak rutin iskemi-reperfüzyon deneyleri için kullanılabilir.Bununla birlikte, iskemi reperfüzyonunu taklit ederken, RVA'nın sağ ve sol tarafında delikler açma sırasında ve ayrıca RVA'yı tıkarken veya serbest bırakırken, herhangi bir artere veya damara zarar vermemesi için en yüksek önlem alınmalıdır. Batı şişkinliği, QRT-PCR analizörü gibi rutin moleküler biyolojide, kimyasal asitler ve görüntüleme teknikleri, üç gün içinde gelişen civciv embriyosu ile ilişkili patofizyolojiyi ilişkilendirmek için doğaçlama yapılabilir. Bu model DNA, RNA ve protein seviyelerinde moleküler mekaniği incelemek için verimli bir şekilde kullanılabilir.Size gösterdiğimiz gibi, üç gün içinde gelişen civciv embriyosunda I/R modellemesi, modelimizin I/R araştırmaları alanında yeni yollar açacağına inanıyoruz. Bu çalışma ile deneyleriniz için en iyisini diliyorum. Teşekkürler.

generation-hook-ischemia-reperfusion-model-using-three-day-developing

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Ovo elektroporasyon Civciv kuş embriyonun genetik manipülasyon sağlayan bir tekniktir. Bu tekniğin yaygın uygulamalar genlerin fonksiyonel analiz ve olası artırıcı unsurları içerir. Bu video HH 10 civciv embriyosunda nöral tüp elektroporasyon göstermektedir. Enjeksiyon tekniği ve uygun yumurta taşıma tartışılmıştır.

HH Sahne 10 Tavuk Embriyolar Ovo Electroporations

Bu makalede, biz uzun vadeli sağlamak için basit bir yöntem...

Bir Eski-ovo</emGörüntüleme ve Mikrocerrahi Uygulamaları için uygundur> Tavuk Embriyo Kültürü Sistemi

İlk kez burada, gelişmekte olan kalpte ex ovo hemodinamiği değiştirmek için tekrarlanabilir bir bantlama prosedürü sunuyoruz. Bu, çıkış yolunun (OFT) kısmen daraltılmasıyla elde edilir.

Bir roman<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Yapıştırma Tekniği bir Embriyonik tavuk Sistemde İntrakardiyak hemodinamiği Alter

Bu yöntemde, embriyonik kalp dokuları cerrahi olarak microdissected, ayrışmış, fluorescently etiketli ve ana bilgisayar embriyonik dokuların implante vardır. Bu kişi veya doku düzeyinde gelişimsel organizasyon ektopik hemodinamik koşullar ve/veya değiştirilmiş parakrin/juxtacrine ortamlar altında eğitimi için bir platform sağlar.

Embriyonik Cardiomyocytes kuş embriyo implantasyonu Vivo için Mikroenjeksiyon tabanlı sistem

Bu protokol, kontrastlı ultrason görüntüleme ve mikrokabarcık aracılı ilaç dağıtımını incelemek için 5 ila 8 günlük tavuk embriyolarının ve bunların koryoallantoik membranının (CAM) in vivo bir model olarak nasıl elde edileceği ve kullanılacağına dair üç yöntemi açıklamaktadır.

Kontrastlı Ultrason Görüntüleme ve Mikrokabarcık Aracılı İlaç Dağıtım Çalışmaları için Tavuk Ex Ovo Embriyolarının ve Korioallantoik Membran Damarlarının In Vivo Model Olarak Hazırlanması

Bu, kanser metastazının baskılayıcılarını veya sürücülerini taramak için etkili bir yöntemdir. Bir ifade kütüphanesi ile transdüklenen hücreler, metastatik koloniler oluşturmak için tavuk chorioallantoic membran vaskülatürüne enjekte edilir. İnvazivliği azalmış veya artmış koloniler, fenotiplerini doğrulamak için ekscised, genişletilmiş, reenjected ve son olarak, yüksek verim sıralaması kullanılarak analiz edilir.

Hızlı ve Nicel Intravital Chick Chorioallantoic Membran Modeli Kullanılarak Metastatik Regülatörlerin Keşfi

Tavuk embriyoları, klasik bir gelişim modeli olarak, laboratuvarımızda çeşitli çevresel kirleticilere maruz kalmanın ardından gelişimsel kardiyotoksioksiklikleri değerlendirmek için kullanılır. Bu yazıda maruz kalma yöntemleri ve kurulan morfolojik/fonksiyonel değerlendirme yöntemleri açıklanmıştır.

Gelişimsel Kardiyotoksikliklerin Değerlendirilmesinde Tavuk Embriyosunun Güçlü Bir Araç Olarak Kullanılması

Mevcut protokol, ovo'daki embriyonik bir civcivin korneasının yaralanmasında yer alan farklı adımları göstermektedir. Rejenere veya tamamen restore edilmiş kornealar, yaralama prosedürünü takiben çeşitli hücresel ve moleküler teknikler kullanılarak rejeneratif potansiyel açısından analiz edilebilir.

Embriyonik Yaralı Civciv Kornealarında İzsiz Doku Rejenerasyonunun İncelenmesi

Burada, insan yumurtalık dokusu için bir civciv koryoallantoik membran (CAM) ksenogreftleme modeli geliştirmek için bir protokol açıklıyoruz ve tekniğin etkinliğini, greft revaskülarizasyon zaman çerçevesini ve 6 günlük bir greftleme süresi boyunca doku canlılığını gösteriyoruz.

Yumurtalık Dokusu Transplantasyonunu İncelemek İçin Bir Araç Olarak Civciv Korioallantoik Membran (CAM) Modeli

Burada, kuş embriyosunda sol atriyal ligasyon (LAL) modelinin yürütülmesi için ayrıntılı bir görsel protokol sunuyoruz. LAL modeli, hipoplastik sol kalp sendromunu taklit ederek duvar kesme gerilimi yükünü değiştiren intrakardiyak akışı değiştirir. Bu zor mikrocerrahi modelinin zorluklarının üstesinden gelmek için bir yaklaşım sunulmaktadır.

Erken Vasküler Gelişim Sırasında Değişen Hemodinamik Yükleme için Bir Model Olarak Kuş Embriyosunda Sol Atriyal Ligasyon

Burada, insan beyni organoidlerini çoklu olgunlaşma aşamalarında civciv koryoallantoik membranına (CAM) aşılamak için bir protokol sunuyoruz. Beyin organoidleri, kılavuzsuz standartlaştırılmış protokoller izlenerek büyütüldü.

Erken Güdümsüz İnsan Beyni Organoid Nörovasküler Niş İzin Veren Civciv Embriyo Korioallantoik Membran Modellemesi

Öğrenin, üç günlük gelişmekte olan civciv embriyosunda Hook iskemi-reperfüzyon modelini oluşturmayı. Bu maliyet etkin ve tekrarlanabilir yöntem, inme patofizyolojisini araştırmak ve potansiyel tedavileri test etmek için kullanılır.

Üç Günlük Gelişmekte Olan Civciv Embriyosu Kullanılarak Hook İskemi-Reperfüzyon Modelinin Üretimi

Daha fazla video keşfet