Üç Günlük Gelişmekte Olan Civciv Embriyosu Kullanılarak Hook İskemi-Reperfüzyon Modelinin Üretimi

Merhaba, ben Dr.Syed Shadab Raza, Hindistan'ın Lucknow kentindeki Era Üniversitesi Kampüsü Biyoteknoloji Bölümü'nde bulunan Kök Hücre ve Restoratif Nöroloji Laboratuvarı'nın baş araştırmacısıyım. Laboratuvarımda, iskemi-reperfüzyon bozukluklarının altında kalan patofizyolojik mekanizmayı ve bu süreçleri tersine çevirebilecek müdahaleleri anlamaya çalışıyoruz. Bu kapsamda iskemik inmenin in vitro ve in vivo modelini sıklıkla kullandırıyoruz.

Son zamanlarda, gelişen üç günlük civciv embriyosunda iskemik-reperfüzyon yaralanma modeli oluşturduk. Şimdi öğrencilerim size iskemi-reperfüzyon hasarının üç gün içinde civciv embriyosu geliştirerek nasıl çoğaltılacağını gösterecekler. Şimdi size üç günlük civciv embriyosunda iskemi-reperfüzyonun nasıl oluşturulacağını göstereceğiz.

Modelimiz uygun maliyetli, zaman etkili ve son derece tekrarlanabilir. Hadi başlayalım. İlk gün.

İlk gün için gereksinimler. Prosedür. Kağıt mendil mendil kullanarak sıfır gün yumurtasını % 70 etanol ile temizleyin. Daha sonra, geçerli günü, tarihi, OHP işaretleyicili yumurtalara yazın ve ardından yumurtaları 36 ila 37 derece Santigrat derece ve% 60 ila 65 nem oranına sahip bir yumurta inkübatörüne yerleştirin.

Yumurtaları 24 saat kuluçkaya yatır. İkinci gün. İkinci gün için gereksinimler. Prosedür.

Cerrahi makası %70 etanol veya ardından bir otoklav ile silin. 24 saatlik inkübasyondan sonra, yumurtayı katmanlama için inkübatörden çıkarın. Daha sonra, yumurtanın kenarına yaklaşık bir inç uzunluğunda ve genişliğinde küçük bir parça Sellotape takın ve ardından keskin uçlu kenar makasını kullanarak yumurta kabuğunun kenarına küçük bir delik açın ve ardından yaklaşık 75 derecelik açıyla beş mL şırınnanın yerleştirilmesini takip edin.

İğneyi yumurta sarısı çuvalına yerleştirdikten sonra yavaşça beş ila altı mL albümin çekin. Albümini çıkardıktan sonra, deliği Sellotape ile yeniden çıkarın ve yumurtayı önümüzdeki 48 saat boyunca 37 derecelik Santigrat yumurta inkübatörüne geri koyun. Dördüncü gün.

Dördüncü gün için gereksinimler. Prosedür. Bu yazıda verilen tablolara göre Ringer'ın çözeltisini, %0,9 normal salin ve bir X fosfat tampon salinini hazırlayın. Ardından üç çözümü otomatik olarak örtün.

Otoklavdan sonra, ilgili çözeltiler oda sıcaklığına yerleştirilecek. Daha sonra, yumurtayı 37 derecelik yumurta inkübatöründen çıkar. Şimdi, kabuğu kesmeden önce, pencere alanını Sellotape ile örtün.

Ve şimdi yumurta kabuğuna küçük bir delik açın ve dairesel bir açıklık kesmeye başlayın. Bu işlem pencereleme olarak bilinir. Yumurtanın konumunun embriyonun konumuna göre ayarlanması gerekebileceğinden, dairesel kesimin yeterince büyük olduğundan emin olun, böylece embriyoya herhangi bir yönden kolayca erişilebilir.

Şimdi, stereo zoom cerrahi mikroskobu kullanarak, doğru vitalline arteri veya RVA'yı bulun. Burada, ok embriyonun üç günlük gelişim aşamasını gösterir. RVA yer aldıktan sonra, 26 G iğnesi kullanılarak RVA'nın sol ve sağ taraflarında iki küçük delik açın.

Ardından, Doppler kan akışı görüntüleme probunun RVA'ya ayarını yapın. Doppler kan akışı görüntüleme probu iskemi bölgesinden beş artı eksi bir milimetre ve RVA'nın distal ucunun üçte ikisi yerleştirilmelidir. Akı okumasını istediğiniz gibi 30 saniye ila iki dakika boyunca alın.

Bu, normoksi faz okumasını yapacaktır. Şimdi omurilik iğnesinin kenarını manuel olarak kalıplayarak kenara bir burun plier ve ardından diş tosları yardımıyla bir kanca şekli verin. Şimdi, bir mikro manipülatör kullanarak, omurilik iğnesini sağ vitalline arterinin hemen altına yerleştirin.

Omurilik iğnesini kaldırmaya hazırsın. Şimdi mikro manipülatörün yardımıyla, Doppler kan akışı akışı arteriyel akışta minimum% 80 azalma gösterene kadar arteri yavaşça kaldırın. Doppler akısında% 80 veya daha fazla bir düşüş elde edildikten sonra, omurilik iğnesini yukarı doğru kaldırarak beş dakika boyunca arteri çekerek bırakın.

Bu iskemi dönemi olacak. Beş dakikalık bu iskemik zamanlamadan sonra, normal kan akış seviyelerini geri kazanmak için mikro manipülatör yardımıyla atardamarı yavaşça serbest bırakın. Şimdi Doppler kan akış ölçer normoksi sırasında gözlemlenenlere benzer okumalar göstermelidir.

Bu, RVA'daki reperfüzyon dönemi olacaktır. I/R işleminden sonra embriyoya iki, üç damla 1X PBS uygulayın. Son olarak, pencereyi Sellotape ile yeniden yerleştirin ve ardından yumurtayı beş saat 55 dakika boyunca yumurta inkübatörüne geri yerleştirin.

Beş saat 55 dakika sonra yumurtayı yumurta inkübatörden çıkarıp yumurta tepsisine yerleştirin ve pencereyi yeniden açın. Tedavi gereksinimleri. Prosedür. Atardamarların ilaçlar, aktivatörler veya inhibitörlerle tedavisi için, RVA bir saatlik I/R işleminden sonra eksüze edilmelidir.

Embriyoyu kabuktan çıkararak steril bir 100 mm Petri kabına çıkarın. Embriyo Petri kabına salındıktan sonra, stereo zoom cerrahi mikroskop rehberliğinde oküler iris kullanarak RVA'yı dışarı atın. RVA'nın eksizyon boyutu gövdeden 15 artı eksi bir milimetre distal ve gövdeye doğru iki artı eksi bir milimetre olmalıdır.

RVA'yı excised sonra, yeni, steril petri kabında 1X PBS ile yıkayın. İstenilen tedaviler için, arteri Ringer çözeltisinin 500 mikrolitresi ile doldurulmuş sterilize edilmiş 1,5 mililitre santrifüj tüpüne koyun. Ve atardamarı santrifüj tüpüne yerleştirdikten sonra, beş saat boyunca 37 derecelik Santigrat laboratuvar inkübatörüne koyun.

Beş saatlik inkübasyondan sonra, RVA'yı 37 derecelik Santigrat laboratuvar inkübatöründen çıkar ve istenen tedavilere devam edin. Ve şimdi, sonuçları sunmak için. iskemik arterlerde iskemik reperfüzyon araştırmalarında modelimizin faydasını doğrulamak için, önce oksijen düzenleyici proteinler 150 veya ORP150, sitoplazmik süperoksit dismutaz bir veya SOD1 ve katalazın faaliyetlerine baktık.

I/R ile tedavi edilen RTA'lar, kontrol grubuna kıyasla ORP150, sitoplazmik SOD1 ve katalaz aktivitesinin arttığını göstermiştir, ancak mevcut rakamda da görüldüğü gibi, N-asetil-L-sistein veya bir ROS quencher olan NAC ile takviye, I/R grubunda oksidatif stresi azaltmıştır. Bu modelin enflamatuar araştırmalar için yararını belirlemek için, I/R-tedavi edilen RA'larda kontrol RVA'larına karşı I/R-1 beta ve TNF-alfa ifadesine baktık. Her iki interlökün de kontrol grubuna kıyasla Hook-I/R grubunda aşırı eksprese edildiği tespit edildi.

Antienflamatuar bir ilaç olan Naringenin takviyesi, IL1-beta ve TNF-alfa seviyelerini önemli ölçüde azalttı. Daha sonra, Batı blotting yoluyla NLRP3 ve NF-kappa beta ifadesini inceledik. Bu analiz, RVA'da üretilen I/R'ye yanıt olarak NLRP3 inflamazomunun yanı sıra NF-kappa betasının aktivasyonuna dair kanıtlar keşfetti.

Önceki sonuçlara benzer şekilde, Naringenin NLRP3 ve NF-kappa beta ifadesini azalttı. Bu sonuçlar, modelimizin enflamatuar değişiklikleri araştırmak için kullanılabileceğini göstermiştir. Daha sonra, I/R'nin apoptoz ve otofaji yolları üzerindeki etkisini inceledik.

İlk olarak, A rakamında, bölünmüş caspase-3 ifadesine erişdik. Kontrol grubuna göre I/R grubunda bölünmüş kaspaz-3'ün gelişmiş bir ekspresyonunu gözlemledik, ZVADFMK alan I/R grubu ise fısta-3 ekspresyonunda azalma gösterdi. Otofaji için benzer şekilde, I/R grubu yüksek protein seviyeleri LC3, memeli hücrelerinde otofajinin önemli bir düzenleyicisi olan otofagozom belirteci Beclin-1 ve bazal otofaji için gerekli bir protein olan ATG-7'yi kontrol grubuna göre sergilerken, otofaji inhibitörü olan 3-ma alan gruplar, yukarıdaki üç otofaji proteininin ifadesinde bir azalma gösterdi. B'den D'ye kadar olan rakamlardan da görüldüğü gibi E rakamı, Hook aracılı I/R'nin ambra-1 ve ATG-7 mRNA seviyeleri üzerindeki etkisini göstermektedir.

Bu sonuçlar önceki sonuçlarla uyumluydu, yani I/R ile tedavi edilen RTA'larda ambra-1 ve ATG-7 için ilgili kontrollere kıyasla gelişmiş mRNA ekspresyolü gözlendi. Ancak, I/R grubuna 3-ma eklendiğinde sonuçlar tersine çevrildi. Mevcut rakam, dna'daki değişiklikleri incelemek için modelimizin etkinliğini temsil ediyor.

I/R-tedavi grubunda kontrol grubuna göre yoğun bir DNA smear gözlemledik. Ancak NAC'nin I/R RVA grubuna takviyesi sonucu tersine çevirdi. Modelimizin diğer modellerin aksine ne kadar etkili olduğunu incelemek için, hook-I/R modelimiz ve MCAO modeli tarafından oluşturulan verileri mevcut deneyde karşılaştırdık.

Özetlemek gerekirse, apoptotik proteinin ekspresyözü, bölünmüş kaspaz-3, otofaji proteinleri, Beclin-1 ve ATG-7 ve enflamatuar interlökinler, TNF ve IFN, I/R ile tedavi edilen RVA'larda kontrol edilen RVA'lardan daha yüksek olması gerekiyordu. İlginçtir ki, Hook-I/R modeli, ister enflamatuar stres ister hücresel ölüm yolları için analiz olsun, MCAO modeli tarafından elde edilenlere çok benzeyen sonuçlar verdi. Modelimiz, mevcut modellere tek başına veya paralel olarak rutin iskemi-reperfüzyon deneyleri için kullanılabilir.

Bununla birlikte, iskemi reperfüzyonunu taklit ederken, RVA'nın sağ ve sol tarafında delikler açma sırasında ve ayrıca RVA'yı tıkarken veya serbest bırakırken, herhangi bir artere veya damara zarar vermemesi için en yüksek önlem alınmalıdır. Batı şişkinliği, QRT-PCR analizörü gibi rutin moleküler biyolojide, kimyasal asitler ve görüntüleme teknikleri, üç gün içinde gelişen civciv embriyosu ile ilişkili patofizyolojiyi ilişkilendirmek için doğaçlama yapılabilir. Bu model DNA, RNA ve protein seviyelerinde moleküler mekaniği incelemek için verimli bir şekilde kullanılabilir.

Size gösterdiğimiz gibi, üç gün içinde gelişen civciv embriyosunda I/R modellemesi, modelimizin I/R araştırmaları alanında yeni yollar açacağına inanıyoruz. Bu çalışma ile deneyleriniz için en iyisini diliyorum. Teşekkürler.