Fotostatinler Kullanılarak Canlı Preimplantasyon Fare Embriyosundaki Mikrotübül Sitoiskeletinin Spatiotemporal Subcellular Manipülasyonu
30 Kasım 2021
Temel ve uygulamalı araştırmalarda yaygın olarak kullanılan tipik mikrotübül inhibitörleri, hücreler üzerinde geniş kapsamlı etkilere sahiptir. Son zamanlarda, fotostatinler, mikrotübüllerin anlık, geri dönüşümlü, mekansal olarak hassas manipülasyonunu yapabilen bir fotodeğiştirilebilir mikrotübül inhibitörleri sınıfı olarak ortaya çıkmıştır. Bu adım adım protokol, fotostatinlerin 3D canlı preimplantasyon fare embriyosunda uygulanmasını detaylandırır.
Bu protokol, canlı preimplantasyon fare embriyosuna fotostatinler uygulayan türünün ilk örneğidir ve diğer 3D fizyolojik sistemlerde ışıkla değiştirilebilir ilaçların kullanımını göz önünde bulundurur. Işık ile değiştirilebilir fotostatinler, mikrotübül büyümesinin uzay ve zamanda manipüle edilmesine ve kapalı bir duruma geri dönüştürülmesine izin verir. Deneyden önce fotostatinleri istemeden mavi ışığa maruz bırakmak, onları erken aktive edebilir.
Bu nedenle, numunelerinizi hazırlarken her zaman tamamen karanlık veya kırmızı ışık koşullarında çalışmanızı öneririz. Katı karanlık koşullarda, aydınlatma için sadece kırmızı ışık kullanarak, ultra saf suda PST-1P'nin stok ve ara çalışma çözümünü yapmaya başlayın. Metin yazısında açıklandığı gibi.
Daha sonra, 40 nihai konsantrasyona ulaşmak için PST-1P'yi taze KSOM'da seyreltin M.To oda slaytını canlı görüntüleme için hazırlayın, yarım küre şeklinde bir damlacık oluşturmak için bir kuyucuğun ortasına 10 L PST-1P ile muamele edilmiş KSOM ekleyin. Damlacığın buharlaşmasını önlemek için, yeterli mineral yağ ile örtün. Ardından, hazırlanan kültür kabını folyoya gevşek bir şekilde sarın veya ışığa maruz kalmamasını sağlamak için kültür kabını inkübatörde hava geçirmez olmayan opak bir kaba yerleştirin.
Embriyoları PST-1P ile muamele edilmiş KSOM damlasına aktardıktan sonra, embriyoların damlacığın merkezinde kümelendiğinden ve kabın dibine yerleştiğinden emin olun. Daldırma objektif lensi hazırlandıktan sonra, oda kızağını mikroskop üzerinde, bir çevre odasının içine monte edin. Tüm PST-1P'lerin inaktif trans-konfigürasyonda olduğundan ve embriyoların çanağın dibine batabileceğinden emin olmak için 37 C ve% 5 CO2'ye ve tamamen karanlıkta ayarlayın.
Objektif lensi daldırma ortamıyla temas halinde konumlandırmak için kırmızı ışıklı bir meşale kullanın. Ardından, ortamın damlacığının kenarını bulun ve hedefi doğrudan üzerine yerleştirin. Canlı tarama modunu ve 561 nm lazeri kullanarak, damlacık içindeki embriyoları bulun.
Tüm embriyonun bir z-yığınını elde etmek için başlangıç ve bitiş noktalarını ayarlamak için aşama denetleyicilerini ve canlı tarama modunu kullanın. Lazer güç ayarlarını sinyalinize göre maksimum% 5'e kadar ayarlayın. EB3-dDomates kuyruklu yıldızlarının görünümünü optimize etmek için sinyalinize göre dijital ofseti maksimum 0,900'e ayarlayın.
Arka plan gürültüsünü en aza indirin. İğne deliğini 2 m'ye ayarlayın. 512 x 512 piksel çözünürlüğü.
Ve piksel 3.15 sn'de bekleme süresi. Ve yakınlaştırmayı 2x olarak ayarlayın. Tüm organizmadaki mikrotübül büyüme alanlarını değerlendirmek için 1 m kesit aralıklarıyla tüm embriyonun bir z-yığınını edinin.
EB3-dDomates kuyruklu yıldızı izleme deneyleri için 3D z-stack görüntüsünü açın, yakınlaştırmayı üç kata çıkarın. Ve belirli bir hücre altı ilgi alanı etrafında dikdörtgen bir yatırım getirisi çizin. Ardından, ayarlanan parametreleri kullanarak 500 ms zaman aralığına sahip tek bir z düzleminin hızlandırılmış filmini edinin.
PST-1P'yi etkinleştirmek için 405 nm lazere geçin ve lazer %10 güce ayarlanmış, iğne deliği maksimum açılmış, piksel çözünürlüğü 512 x 512, piksel bekleme süresi 3,15 sn, üç kat yakınlaştırma, 500 ms'lik bir zaman aralığında üç kez yakınlaştırma ve elde edilecek 20 kare ile başka bir zaman atlaması elde edin. Aktivasyondan hemen sonra, 561 nm lazere geri dönün ve PST-1P'nin aktivasyonundan sonra EB3-dDomates kuyruklu yıldızlarının kaybını doğrulamak için daha önce gösterildiği gibi edinimi tekrarlayın. Şimdi, PST-1P'yi etkin olmayan trans-durumuna geri döndürmek için, 514 nm lazer kullanın ve ayarlanan parametrelerle başka bir zaman atlaması elde edin.
EB3-dDomates kuyruklu yıldızlarının geri kazanılmasını görselleştirmek için 561 nm lazere geri dönün ve edinimi tekrarlayın. Tedavi edilmemiş kontrol embriyolarında, 405 nm lazerle aydınlatmadan önce, EB3-dDomates sinyali, nükleer alan hariç, hücrenin tüm sitoplazmasında yüksekti. Aydınlatma sonrasında, sinyaldeki değişiklikler tespit edilmedi.
405 nm lazerin embriyo veya mikrotübül dinamiklerinde foto hasarına neden olmadığını gösterir. 16 hücreli evre embriyoların PST-1P tedavisi sırasında, katı karanlık koşullar altında, 3D görüntüde güçlü EB3-dDomates ekspresyonu tespit edildi ve inaktif PST-1P'nin karanlık koşullar altında mikrotübül polimerizasyonunun inhibisyonunu ortaya çıkarmadığını gösterdi. PST-1P'nin aktivasyonundan önce, tek bir z-düzleminin hızlandırılmış görüntülemesi, güçlü EB3-dDomates ekspresyonunu ve bir hücre altı bölgede mikrotübül polimerizasyonunu doğruladı.
405 nm ışık aktivasyonundan sonra, saniyeler içinde, EB3-dDomates kuyruklu yıldız sinyalinde bir azalma tespit edildi. Ve sinyalin geri kazanılması, 514 nm lazer kullanılarak PST-1P'nin devre dışı bırakılmasıyla sağlandı. EB3-dDomates ile mikro enjekte edilen ve PST-1P ile inkübe edilen embriyolar, blastosist aşamasına kadar gelişen normal embriyonik potansiyel gösterdi.
Ve mitoz sırasında normal mikrotübül dinamikleri. Aktif bir PST-1P'nin embriyoya toksisite olmadığını göstermek. Elde edilen hızlandırılmış filmlerde, EB3-dDomates etiketlemesi kuyruklu yıldız benzeri yapılar olarak ortaya çıktı ve büyüyen mikrotübül filamentlerinin izlenmesini sağladı.
Karanlık koşullarda tutulan PST-1P ile muamele edilmiş embriyolarda, bireysel EB3-dDomates kuyruklu yıldızları, erken fare embriyosunda sentrozomal olmayan bir mikrotübül organizasyon merkezi olarak işlev gören interfaz köprüsünden yayıldı. Bir t-yığını, interfaz köprüsü bölgesindeki EB3-dDomates kuyruklu yıldızlarını göstermektedir. PST-1P'nin aktivasyonunu takiben, EB3-dDomates kuyruklu yıldızları interfaz köprüsünün tabanında ve t-yığınında azaltıldı.
Beyaz ışığın PST-1P'yi erken etkinleştirebileceğini unutmayın. Bu yüzden görünürlük için sadece kırmızı ışık kaynaklarını kullanın. Yeşil ışık ayrıca PST-1P'yi devre dışı bırakır, bu nedenle lütfen yeşil floresan etiket işaretleyicileri kullanmaktan kaçının.
Bu teknik, hücre göçünü ve doku oluşumunu incelemek için mikrotübül büyümesini hedeflemek için drosophila, amip, fareler ve çoklu in vitro sistemlerde kullanılmıştır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, canlı implantasyon öncesi fare embriyolarında mikrotübülleri manipüle etmek için fotostatonların kullanımını tanıtmaktadır. Fotostatonların erken aktivasyonunu önlemek için örneklerin hazırlanması sırasında ışık koşullarının önemine vurgu yapmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Gelişimsel Biyoloji
Arka Plan
- Mikrotübül inhibitörleri araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır.
- Fotostatınler, foto-anahtarlanabilir yeni bir mikrotübül inhibitörü sınıfıdır.
- Mikrotübül dinamiklerinin hassas mekansal ve zamansal kontrolüne olanak sağlarlar.
- 3D fizyolojik sistemlere uygulanması özgün bir yaklaşımdır.
Çalışmanın Amacı
- Yaşayan implantasyon öncesi fare embriyolarına fotostatinler uygulamak.
- Işıkla anahtarlanabilir ilaçlar kullanarak mikrotübül büyümesinin manipülasyonunu araştırmak.
- Karanlık koşullarda fotostatin kullanımı için protokoller oluşturmak.
Kullanılan Yöntemler
- Ultrapure su içerisinde PST-1P stok ve çalışma çözeltilerinin hazırlanması.
- Deneylerin tam karanlıkta veya kırmızı ışık altında yürütülmesi.
- Mikrotübülleri manipüle etmek için ışıkla anahtarlanabilir fotostatinlerin uygulanması.
- Işığa maruz kalmanın fotostatin aktivasyonu üzerindeki etkilerinin izlenmesi.
Ana Sonuçlar
- Canlı embriyolarda mikrotübül dinamiğinin başarılı bir şekilde manipüle edilmesi.
- Deneylerde ışık koşullarının öneminin ortaya konması.
- 3D sistemlerde fotostatların kullanımı için yeni bir protokol oluşturulması.
- Mikrotübül büyümesinin tersine çevrilebilir kontrolüne ilişkin içgörüler sağlanması.
Sonuçlar
- Fotostatini̇ler, mikroti̇bülerin hassas manipülasyonu için etkilidir.
- Karanlık koşullarda çalışmak, deneyin başarısı için kritik öneme sahiptir.
- Bu yöntem, çeşitli biyolojik bağlamlarda mikrotübül dinamiğinin incelenmesi için yeni yollar açmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Mikrotübül dinamiğinin hassas spatiotemporal kontrolü, hücre içi fenotiplere yönelik sitoskeletal katkıları izole ederek erken aşama hedef doğrulamada mekanistik risk azaltmaya olanak tanır. Bu yaklaşım, global sitotoksisiteye yol açmadan geri dönüşümlü, subcellular perturbasyonlara imkan vererek fenotipik taramalarda öngörüsel güvenilirliği destekler. Embriyolar gibi 3D fizyolojik sistemlerdeki uygulamalar, sitoskeletal yolakları hedefleyen adayların risk azaltılması sürecinde translasyonel uygunluğu artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Işıkla kontrol edilen, geri döndürülebilir inhibisyon aracılığıyla fenotipik analizlerde mikrotübül bağımlı mekanizmaların sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Canlı 3D modellerde hücre altı hedef doğrulaması için toksik olmayan, fotosanaçlanabilir bir araç sunar.
- Öngörücü Değer: Karmaşık biyolojik bağlamlardale sitoskeletal değişkenleri izole ederek hipotez testlerini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Tekrarlanabilir bileşik taramaları için standartlaştırılmış, ışık kontrollü mikrotübül pertürbasyon sistemlerinin hazırlanmasını kolaylaştırır.
- Operasyonel Değer: Karanlık koşullarda işlem ve hassas ışık aktivasyon parametreleri aracılığıyla analiz hazırlığını sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: Sitoskeletal hedef etkileşim çalışmaları için organoidler ve blastoidler gibi 3D modeller genelinde platformun yeniden kullanımını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Memeli embriyolarında hastalıkla ilişkili hücre iskeleti manipülasyonunu göstererek preklinik model geçerliliğini destekler.
- Operasyonel Değer: Geri döndürülebilir ve yıkıcı olmayan mikrotübül modülasyonu aracılığıyla keşif aşamasından preklinik aşamaya süreklilik sağlar.
- Risk Azaltma: Gelişmekte olan embriyolarda aktif fotostatinlerin toksik olmadığını onaylayarak güvenlik profillemesindeki mekanistik belirsizliği azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef hipotez testi için keşif biyolojisine entegre edilir, hücre iskeleti hedefleri için assay geliştirmeyi mümkün kılar ve 3D sistemlerde geri döndürülebilir mikrotübül manipülasyonu aracılığıyla translasyonel araştırmaları destekler.
- Keşif Biyolojisi: Canlı embriyolarda mikrotübül dinamiklerinin hassas ve geri döndürülebilir şekilde sorgulanmasına olanak tanıyarak mekanistik risk azaltmayı destekler.
- Tarama: Belirlenmiş ışık aktivasyon/deaktivasyon protokolleri ve hücre altı ROI hedeflemesi aracılığıyla analiz standardizasyonunu sağlar.
- Analitik: Mikrotübül polimerizasyon dinamiklerini ölçmek için EB3-dTomato kuyruklu yıldız takibi yoluyla kantitatif okumalar sunar.
- Translasyonel Araştırma: İşlem sonrası kanıtlanmış blastokist oluşumu ve normal mitoz ile preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Fotostatini, 3D fizyolojik sistemlerde hücre iskeleti hedef doğrulaması için yeniden kullanılabilir bir foto-anahtarlanabilir platform olarak konumlandırır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Geri dönüşümlü, spasyotemporal mikrotübül pertürbasyonu aracılığıyla hedef doğrulamada öngörülebilir güvenilirlik.
- Operasyonel Değer: Sıkı ışık koşulu yönetimi ve tanımlanmış lazer parametreleri yoluyla standardizasyon ve tekrarlanabilirlik.
- Stratejik Değer: Fenotipik taramada hedef dışıle cytoskeletal etkilerin azaltılmasıyla iyileştirilmiş karar verme (go/no-go) süreçleri.
- Portföy Etkisi: Embriyo bazlı modellerde toksik olmayan, geri dönüşümlü modülasyon kullanılarak cytoskeletal hedeflerin risk ayarlı önceliklendirilmesi.
Uygulama Hususları
- Canlı hücre konfokal mikroskopisi ve fotokomütasyonlu bileşiklerin kullanımı konusunda uzmanlık gerektirir.
- 405 nm (aktivasyon), 514 nm (deaktivasyon) ve 561 nm (görüntüleme) dalga boylarına kapasiteli lazer sistemleri gereklidir.
- PST-1P'nin erken aktivasyonunu önlemek için ışık maruziyeti protokollerinin ekipler arası standartlaştırılması gerekir.
- EB3-dTomato etiketlemesi veya eşdeğer mikrotübül artı uç takip raporlayıcıları için adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Yeşil ışıktan ve fotostatini deaktivasyon yapabilecek floresan etiketlerden kaçınmak gibi pratik sınırlamaları kapsar.
