Drosophila Embriyolarında Lipid İçeren Organellerin Sitoiskelete Bağımlı Ticaretinin Görselleştirilmesi

Erken Drosophila embriyosunda, birçok organel büyük ölçekli harekete uğrar. Protokolümüz, hücre kültürü için geliştirilen floresan boyaları kullanarak bu hareketin nasıl izleneceğini açıklar. Floresan proteinleri ile karşılaştırıldığında, ticari olarak temin edilebilen floresan problar daha parlaktır ve spektrumun daha geniş bir aralığını kapsar.

Multipleks birlikte etiketlemeye izin verirler ve herhangi bir genetik arka planda kullanılabilirler. Embriyoların ne kadar süre kurutulacağını bilmek pratik ve deneme yanılma gerektirir, böylece enjeksiyon sırasında patlar veya kurur ve gelişmeyi durdururlar. Başlamak için, kılcal damarı iğne çektirme makinesindeki kılcal bir tutucuya yerleştirerek ve kanat somunları kullanarak sabitleyerek enjeksiyon iğnelerini hazırlamaya başlayın.

Kılcal damarın merkezini ısıtma elemanı ile hizalayın. Üreticinin talimatlarına göre, iğne çektirme makinesinde uygun ayarları seçin. Diseksiyon mikroskobu kullanarak, kalite kontrol testini gerçekleştirin.

İğnelerin macununa yatay olarak bastırın, iğne uçları havada asılı olarak durun. İğneleri kapakla örtün ve kullanana kadar saklayın. Bir mikropipete bağlı iğne yükleme uçlarını kullanarak, hava kabarcıklarını yakalamadan enjeksiyon çözeltisinin bir mikrolitresini uca çekin.

Eldiven kullanarak, iğneyi ucu uzağa bakacak şekilde bir elinizde tutun ve yükleme ucunu içine yerleştirin. Sıvıyı iğne ucunun yanına dağıtın, pipeti çıkarın ve sıvı uca akana kadar iğneyi dikey olarak tutun. Boyaların ağartılmasını önlemek için iğne uçlarına zarar vermeden kabı alüminyum folyo ile örtün.

Bir transfer pipeti veya bir mikropipetter kullanarak, dikdörtgen bir kapak kaymasının ortasına küçük bir damla heptan yapıştırıcı yerleştirin ve buharlaşmasına izin verin. Koryonu mekanik olarak çıkarmak için, yumurta kabuğunu şeffaf hale getirmek için uygun şekilde yaşlandırılmış embriyo plakasını ince bir halokarbon yağı tabakası 27 ile örtün. Embriyo aşamasını doğrulamak ve bölünme aşamalarındaki embriyoları seçmek için trans aydınlatmalı bir diseksiyon mikroskobu altında plakayı görüntüleyin.

İnce cımbız kullanarak, dorsal uzantıları tutarak istenen aşamadaki bir embriyoyu alın ve çift taraflı bantla kaplı hazırlanmış cam slayda aktarın. Embriyoyu banda yerleştirin ve yağ transferini en aza indirin. Embriyoyu, doğrudan dürtmeden cımbız ucunun yan tarafıyla dürterek bandın yüzeyi boyunca yavaşça yuvarlayın.

Koryon banda yapışana ve çatlayana kadar embriyoyu yuvarlamaya devam edin. Koryon çatladıktan sonra, embriyoyu banda yapışmış kalan koryondan ayırmak için yuvarlamaya devam edin. Embriyoyu, banttan daha az yapışkan olan koryonun üzerine geri yuvarlayın.

Embriyoyu, transfer için cımbızlara yapışana kadar cımbızla hafifçe ovalayın. Daha sonra, embriyoyu kapak kaymasına aktarın ve embriyoyu yerinde tutmak için tutkalla temas ettirin, cımbızdan ayırın. Embriyonun kapak kayması üzerindeki yönünü ayarlayın.

Embriyoların beş ila 12 dakika kurumasına izin verin, kapak kaymasını embriyolarla birlikte kurutma odasına yerleştirip kapatın. Kapak kaymasını odadan çıkarın ve daha fazla kurumayı önlemek için embriyoları kaplayan bir damla halokarbon yağı 700 koyun. Onları diseksiyon kapsamı altında inceleyin ve embriyolar uygun şekilde kurutulmuşsa mikroenjeksiyona devam edin.

4X hedefini ışık yoluna yerleştirin ve mikroskoptaki odak düğmesini kullanarak embriyoları odağa ayarlayın. Aşama kontrollerini kullanarak embriyoları yatay olarak görüş alanının merkezine taşıyın. Embriyoları görüş alanının kenarında tutun ve iğneyi düşürmeye hazırlanırken uzaklaşın.

Aynı odak düzleminde kalarak, iğne ucunu indirin ve embriyolarla birlikte görüş alanında görünür olmasını sağlayın. Enjeksiyon çözeltisinin bir kısmını halokarbon yağı 700'e dağıtarak iğnenin çalışıp çalışmadığını kontrol edin. Başarılı olursa, iğne ucunun yakınındaki yağda bir çözelti kabarcığı görünecektir.

Aşama kontrollerini kullanarak, uç embriyoyu nazikçe delip içine girene kadar embriyoyu iğne ucuna doğru hareket ettirin. Aynı zamanda, iğne ucunun bulunduğu yerde geçici bir berrak nokta görünene kadar enjeksiyon çözeltisinin akışına başlayın, bu da embriyoya başarılı bir çözelti transferini gösterir. Kapak kaymasını slayt tutucuyu kullanarak konfokal mikroskop üzerinde sabitleyin.

Kapak kayması kırılgan olduğundan dikkatli olun. Konfokal mikroskoptaki epifloresan fonksiyonunu kullanarak embriyoları 40X hedefi ile inceleyin ve devam etmeden önce embriyodaki floro 4'ün görünür olduğundan emin olun. Canlı görüntüleme için, sinsitiyal aşamalarda, görüntü boyutunu 512 x 512 piksel, satır ortalaması üç ve kare hızını saniyede 0,1 kare olarak ayarlayın.

BODIPY 493 503 boyası enjekte edildikten sonra, iğne ucunun yerleştirildiği yerde lokalize edildi ve daha sonra enjeksiyon bölgesine bitişik olarak dağıldı. 24 dakika sonra, boya embriyonun orta noktasından yayılmıştır. Organel hareketliliği, embriyoya BODIPY 493 503 ve LysoTracker Red enjekte edilerek izlendi.

Parçacık görüntüsü velosimetri analizi, embriyonik içeriğin, sitoplazmanın embriyonun içine aktığı embriyonun merkezi bölgesinde birleştiğini ortaya koydu. ER-Tracker Green kullanılarak ER'nin etiketlenmesi, nükleer zarfın canlı bir çözünürlüğünü sağlayarak ana hücre döngüsü aşamalarının görselleştirilmesine izin verir. Embriyo, blastoderm aşamasında MitoView 633 ile enjekte edildi ve dört saat sonra görüntülendi.

Resim, germ bandı uzantısında bir embriyonun nöroektodermal hücresini göstermektedir. Hücreselleştirici bir embriyoya, lipit damlacıklarının mikrotübüller boyunca çift yönlü hareket ettiğini gösteren BODIPY 493 503 ve SiR Tubulin karışımı enjekte edildi. Embriyo kısmen kurutulmalıdır, böylece sıvı enjekte edilebilir.

Çok az kurutma, enjekte edildiğinde embriyonun sızmasına neden olur, çok fazla kuruma embriyoyu öldürür. Hareketli organellerin videoları, çeşitli görüntü analiz teknikleriyle karakterize edilebilir. Partikül izleme, bireysel organellerin davranışını ortaya çıkarır, parçacık görüntüleme velosimetrisi yığın akışını ortaya çıkarır.