CBir1 TCR Transgenik CD4⁺ T Hücrelerinin İmmün Yetmezlikçi Farelere Benimsenen Transferi ile Bağırsak İltihabının İndüksiyonu

İnflamatuvar bağırsak hastalığı veya IBD, bireylere ve topluma önemli bir sağlık ve finansal yük getirmektedir. Bu kolit modeli, IBD mekanizmalarını incelemek ve IBD tedavilerini değerlendirmek için faydalıdır. Bu immünodominant Cbir flagellin T hücreye özgü adoptif transfer kolit modeli, bağırsak bakteri antijenlerinin kolit indükleyen T hücreli yanıtları nasıl indüklet olduğuna dair içgörüler sağlar.

Fareyi ötenazi yaptıktan sonra, yaklaşık bir santimetrelik bir sol karın kesiği yapın ve cildi karın kas dokusundan çekin. Daha sonra karın kas dokusunda yaklaşık üç santimetrelik bir kesi yapın. Daha sonra, dalağını steril makas ve asalarla çıkarın.

Dalağını beş mililitre önceden soğutulmuş yıkama tamponu içeren bir kültür kabına yerleştirin. Dalağını iki steril cam kaydırağın pürüzlü yüzeyiyle öğütün. Hücre süspansiyonunu 100 mikrometrelik hücre süzgecinden geçirerek 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Cam kaydırakları ve kültür çanağı beş mililitre önceden soğutulmuş yıkama tamponu ile durulayın ve yıkama tamponunu tüpe aktarın. Hücre süspansiyonu santrifüj, süpernatan atmak ve dalak başına beş mililitre önceden ısıtılmış Tris amonyum klorür lizis tamponu ile hücreleri yeniden dirilt. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatır.

Tüpe 10 mililitre önceden soğutulmuş yıkama tamponu ekleyin. Ardından, hücre süspansiyonu santrifüj, üstnatan atmak ve önceden soğutulmuş izolasyon tampon 10 mililitre ile hücreleri yeniden dirilt. Hücreleri saymak için, hücre süspansiyonunun ve Trypan mavisinin her birini 10 mikrolitreyi iyice karıştırın ve bir slayta 10 mikrolitre yükleyin.

Ardından, uygulanabilir hücre numarasını elde etmek için slaydı otomatik hücre sayacına yerleştirin. Kalan hücre süspansiyonu santrifüj ve tüm süpernatant atın. Fare karşıtı CD4 manyetik parçacıklarını girdaplayın, doğrudan 10 milyon hücre başına 50 mikrolitre parçacık ekleyin ve hücre peletleriyle iyice karıştırın.

Karışımı dört santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya bırakın. Hücre partikül süspansiyonu steril bir toplama tüpüne aktarın. Tüpe 3,5 mililitre önceden soğutulmuş izolasyon tamponu ekleyin.

Tüpü oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca hücre ayırma mıknatısı üzerine yerleştirin. Daha sonra, üç mililitrelik bir transfer pipet ile süpernatantı dikkatlice emiş edin. Tüpü hücre ayırma mıknatısından çıkarın.

Daha sonra, hücreleri 3,5 mililitre önceden soğutulmuş izolasyon tamponu ile yeniden depolayın ve tüpü oda sıcaklığında dört dakika boyunca mıknatısın üzerine yerleştirin. Süpernatantı üç mililitre pipetle dikkatlice aspire edin. Son olarak, hücreleri önceden soğutulmuş bir mililitre önceden soğutulmuş FACS arabelleğine yeniden koyun.

Hücreleri alıcı farelere aktarmak için, Cbir1 TCR transgenik-naif CD4 pozitif T hücrelerini 1x PBS'de mililitre başına 5 milyon hücreye yeniden kullanın. Fareleri bir ısı lambası altında ısıtın ve fareyi bir fare kısıtlayıcı kullanarak kısıtlayın. Hücre süspansiyonunun 200 mikrolitresini farelerin kuyruk damarına intravenöz olarak enjekte edin.

Fareyi ötenazi ettikten sonra, yaklaşık bir santimetrelik ventral orta çizgi cilt kesiği yapın. Cildi karın kas dokusundan uzaklaştırın. Daha sonra karın kas dokusunda üç santimetrelik bir kesi yapın.

Daha sonra, koekumu tanımlayın ve tüm kolonu steril makas ve asalarla çıkarın. Kolonu önceden soğutulmuş PBS ile bir kültür tabağında ıslatın. Kolonu uzunlamasına inzivaya ayırın ve önceden soğutulmuş PBS ile durulayın.

Kolonun 1/3'ü uzunlamasına kesin. Kolon şeridini, lümen tarafı yukarı bakacak şekilde bir kağıt havluya yerleştirin. Kürdan kullanarak İsviçre'de yuvarlanma gerçekleştirin.

Kolon İsviçre'yi bir kasete yerleştirin ve kaseti 24 saat boyunca% 10 tamponlu formalin içine koyun. Otomatik bir işlemci ile kolonu susuz ve parafinle gömün. Daha sonra, bir mikrotom üzerinde beş mikrometre doku bölümlerini kesin.

Dokuyu slaytlara monte edin ve hematoksilin ve eozin lekeleme gerçekleştirin. Rag nakavt fareleri hücre sonrası transferden yaklaşık üç hafta sonra kilo vermeye başladı ve kiloları hücre transferden altı hafta sonra orijinal ağırlıklarının yaklaşık% 80 ila 85'ine ulaştı. Alıcı fareler hücre nakli sonrası altı hafta kısa kolon uzunluğu gösterdi.

Alıcı fareler, hücre sonrası transferden dört hafta sonra bağırsak lamina propriasında daha fazla hücre infiltrasyon gösterdi. Goblet hücre kaybı ve bağırsak epitel hücre hiperplazisi beş hafta hücre sonrası transfer, ayrıca kolon altı hücre transferi altı hafta submukozosunda mukozal erozyon ve inflamatuar hücre infiltrasyon gösterdi. Histopatolojik skorlar önemli ölçüde dört haftadan altı haftaya yükseldi.

Aynı zamanda, sadece PBS alan Rag nakavt farelerinde iltihap yoktu. Bu prosedür kullanılarak, kolonik sitokin düzeyleri ELISA ve qPCR tarafından belirlenebilir.