Bir Döner Hücre Kültür Sistemi Kullanarak Simüle Edilmiş Mikrogravitede Lenfositlerin Kültürlenmesi

Bu teknik, uzay ortamının yönlerinin insan fizyolojisini moleküler düzeyde nasıl etkilediğini daha iyi anlamamıza yardımcı olmak için simüle edilmiş mikro yerçekiminin bağışıklık hücreleri üzerindeki etkilerini incelememizi sağlar. Bu teknik ekonomik olarak uygulanabilir ve hücre kültürünü uzaya göndermeye veya hücre kültürünü yeryüzündeki simüle edilmiş mikro yerçekimine maruz bırakmanın diğer yöntemlerine kıyasla kurulumu ve bakımı nispeten kolaydır. Taşma ve dökülmeyi önlemek için kapları doldururken yavaş gitmeniz önerilir.

İlk kabarcık çıkarıldıktan sonra, şırıngaları kullanarak damarların tamamen dolu olduğundan emin olun. Bu, tedavi boyunca büyük kabarcık oluşumu olasılığını en aza indirecektir. Kültür kaplarını plastik ambalajdan çıkararak başlayın.

Janttaki her bir damarı, kullanılan hücre tipine veya hattına, kontrol veya tedavide olup olmadığına ve diğer ilgili bilgilere göre etiketleyin. Kabı stabilize edin ve dolum portu kapağı mandalına veya O-ring'e dokunmadan dolum portunu dikkatlice açın. Kapağı, kap doldurulurken mandal veya O-ring yukarı bakacak şekilde bir etanol pedi üzerine yerleştirin.

Kapakları şırınga bağlantı noktalarından çıkarmayın. Steril bir serolojik pipet kullanarak kabı hücre kültürü için 10 mL uygun komple ortam ile yükleyin ve kapağı dikkatlice dolum portuna yerleştirin. Şırınga bağlantı noktası kapaklarının ve dolum portunun güvenli bir şekilde kapatıldığından emin olun.

Ardından, damarları hücre kültürü için hazırlamak için sonraki adımları gerçekleştirirken doldurulmuş kapları bir inkübatöre yerleştirin. Medya astarlanmış kapları inkübatörden alın. Bir şişe kontrolü için, yukarıda hazırlanan stoktan 10 mL hücre kültürüne sahip bir T25 süspansiyon kültürü şişesi yükleyin.

Şırıngaları yüklemek için kullanılacak ayrı bir 15 mL konik tüpe 10 mL stok hücre kültürü ekleyin. Şırınga bağlantı noktası kapaklarını tekneden çıkarmak için sökün ve stok durdurucularının açık konumda olduğundan emin olun. Kabı stabilize edin ve dolum portu kapağı mandalına veya O-ring'e dokunmadan dolum portunu dikkatlice açın.

Kapağı, kap doldurulurken mandal veya O-ring yukarı bakacak şekilde bir etanol pedi üzerine yerleştirin. Stopcock'ların açık konumda olduğundan emin olun. Ortam, serolojik bir pipet kullanılarak ortamın kaptan bir çöp konteynerine dökülmesiyle boşaltılabilir.

Alternatif olarak, vakum sistemine bağlı pipetinizin yanından steril bir cam kullanarak ortamı aspire edin. Bir pipet veya vakum sistemi kullanırken, oksijenasyon membranına dokunmadığınızdan emin olun, çünkü bu ona zarar verebilir ve kabı kullanılamaz hale getirebilir. Hazırlanan stok hücre kültürünü içeren 50 mL konik tüpü sıkıca kapatın ve içeriği iyice karıştırmak için birkaç kez hafifçe ters çevirin.

Taze steril serolojik pipet ile 50 mL tüpten 10 mL hücre kültürü stoğu çekin. Kabı alın ve eğin, böylece doldurma portu üste doğru olacaktır. Daha sonra hücre kültürü stoğunu dolum portundan kabın içine dikkatlice dağıtın.

Dökülmeyi önlemek için kabı tekrar aşağı doğru eğerken, kabı doldurma portunun ucuna kadar doldurun. Çok kırılgan olduğu için oksijenasyon membranına pipetle dokunmamaya dikkat edin. Gemi yüklendikten sonra, dolum portu kapağını O-ringine dokunmadan dikkatlice tekrar takın.

İlk 3 mL şırıngayı paketinden çıkarın ve gevşetmek için birkaç kez pompalayın. Daha sonra şırıngayı şırınga portlarından birine takın ve şırınganın tamamen bastırılmasını sağlayın. 10 mL aliquot hücre kültürü içeren 15 mL konik tüpü sıkıca kapatın ve içeriği iyice karıştırmak için birkaç kez hafifçe ters çevirin.

Benzer şekilde, ikinci 3 mL şırıngayı paketinden çıkarın ve birkaç kez pompalayın. Daha sonra bu şırıngayı 15 mL konik tüpten hücre kültürüne dikkatlice yarıya batırın ve bir miktar kültür hazırlayın. Şırıngayı tamamen tüpe geri dağıtarak ve 3 mL kültür çekerek hava kabarcıklarını en aza indirin.

Doldurulmuş şırıngayı kalan şırınga portuna takın ve şırıngaları ve dolum portunun etrafını bir etanol pedi ile dikkatlice sterilize edin. Oksijenasyon membranına etanol almayın. Kalan gemiler için işlemi tekrarlayın.

Son damar için 50 mL konik tüpte biraz yetersiz bir hücre kültürü kalırsa, kalan miktarı şırıngaları yüklemek için kullanılan 15 mL konik tüpten geri kazanın. Hücrelerin ve kabarcıkların şırıngalardan damarlara göçünü sınırlamak için şırınga portu stopcocklarının kapalı olduğundan emin olun. Gemiyi baş aşağı çevirin ve ilk kabarcıkları toplamak için birkaç kez yan tarafa vurun.

Kabı yukarı bakacak şekilde hızlı bir şekilde geri çevirin ve ardından hafif bir açıyla uzağa bakın, böylece kabarcıkların tümü kabın yukarı tarafına doğru yüzer. Limanın altındaki kabarcıkları boş şırıngayla manevra yapın ve limana girmeye başlamalarını izleyin. Şırınga portu stopcock'larının her ikisini de açın.

Kabarcıkları boş şırıngaya doğru yüzmeye teşvik etmek için gemiye yavaşça vurun. Oksijenasyon zarının patlamaması için kaptaki basıncı korumak için tam şırıngayı dikkatlice bastırırken, boş şırınga ile daha büyük kabarcıkları yavaşça emer. Tüm kabarcıkların çıkarıldığından emin olmak için bu işlemi birkaç kez tekrarlayın.

Kabarcıklar etkili bir şekilde çıkarıldığında, şırınga portu stopcock'larını kapatın. Daha sonra kabarcıkların çıkarılmasına izin vermek için tedavi sırasında şırıngaları açık tutun ve her iki şırıngadaki hacmin yaklaşık olarak eşit olmasını sağlayın. Dönen tabanın ve şerit kablonun yüzeyini %70 etanol ile dikkatlice silin.

Şerit kablonun güç kaynağına bağlı olduğundan emin olun. Dönen tabanı inkübatöre yerleştirin ve şerit kablosunu tabana takın. Güç kaynağını inkübatörün yakınına, ancak dışına yerleştirin.

SMG arıtma kabını, kap dişlerini dönen mandala dizerek ve dönen mandalı tabanda saat yönünün tersine yavaşça çevirerek takın. Geminin güvenli bir şekilde takıldığından emin olun. Su tepsisini otoklav RO suyuyla doldurarak inkübatörü yaklaşık% 100 nemde tutun.

İnkübatörün dönme hızını, hücrelerin çökeltme hızına uyacak şekilde ayarlayın, böylece hücreler ortamdan düşmez. Tedaviyi kurmanın ilk gününde, metin makalesinde açıklandığı gibi birkaç saatte bir kabarcık oluşumunu kontrol edin. Kabarcıkları, istenen tedavi uzunluğunun sonuna kadar ileriye doğru günde en az bir kez çıkarın.

Planlanan işlem süresi geçtikten sonra, dönüşü durdurun ve aparatı sökün. Cihazın dönen mandalını saat yönünde çevirirken kabı yavaşça sabit tutarak arıtma kabını çıkarın. Kontrol şişesini, kontrol ve arıtılmış kabı steril bir biyolojik güvenlik kabinine getirin.

Kontrol şişesi hariç her bir kabı alın ve aşağı bakacak şekilde çevirin. Sonra tüm hücreleri süspansiyona getirmek için yavaşça vurun. Ardından, kabı dolum portu ile dibe doğru kendi tarafına çevirin ve etkili aspirasyon için hücreleri dolum portuna doğru yönlendirmek için tekrar vurun.

Her gemiyi ayrı ayrı tutun. Şırıngaları iki porttan sökün ve biyolojik tehlike atıklarına dağıtın. Şırınga portlarındaki tapaları açın.

Doldurma portu kapağını dikkatlice çıkarın ve steril bir 10 mL serolojik pipet kullanarak içeriği çizin ve kabı boşaltırken eğin. Tüm kontrol ve tedavi gruplarının içeriklerini ayrı ayrı etiketlenmiş 15 mL konik tüplere dağıtın. Her tüpü kapatın ve düzgün bir şekilde karıştırıldıklarından emin olmak için birkaç kez yavaşça ters çevirin.

Daha sonraki deneysel testlere hazırlanmak için elde edilen hücre kültürünün konsantrasyonunu ve canlılığını belirlemek için tercih edilen yöntemi kullanın. NK-92 hücre hattı başlangıç canlılığı ve oturma yoğunlukları, ortaya çıkan son canlılık ve son konsantrasyonlarla karşılaştırıldı. 72 saatlik bir SMG tedavisinden sonra, iki negatif ve pozitif sonuç örneği karşılaştırıldı.

Karşılaştırma için, kullanılan NK-92 hücre hattının optimal konsantrasyon aralığı, mililitre başına 0.3 ila 1.2 milyon hücre arasındaydı ve yaklaşık iki ila üç günlük bir iki katına çıkma süresi vardı. SMG tedavi grubunda proliferasyon, kontrol ve tedavi gruplarında yaklaşık olarak eşitti. Bu parametreler aşağı akış deneysel başarısı için gerekliydi ve iki kontrol grubundan elde edilen hücreler aşağı akış deneysel tahlillerinde benzer şekilde gerçekleştirildi.

Tedavi boyunca, özellikle simüle edilmiş mikro yerçekimine maruz kalan hücre kültüründe, kabarcık oluşumunu izlemek ve hesaba katmak çok önemlidir. Büyük kabarcık oluşumu, gemi içindeki akışkan dinamiklerinde bozulmaya neden olabilir ve bu, simüle edilmiş mikro yerçekimi durumunu esasen olumsuz yönde etkileyecektir.