Name: Çeşitli Böbrek Hastalığı Fare Modellerinde Polietilenimin Nanopartikülleri Kullanılarak Ekzojen Yapay Olarak Sentezlenmiş MiRNA Mimiklerinin Böbreğe Verilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Keşfedin, polietilenimin nanopartikülleri kullanarak fare böbrek hastalığı modellerinde miRNA taklitlerinin böbreğe verilmesi yöntemini. Bu teknik, hedef miRNA'nın aşırı ekspresyonunu sağlayarak hastalık ilerlemesini inhibe eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen JSPS KAKENHI (Hibe No. 21K08233) tarafından desteklenmiştir. Bu yazının taslaklarını düzenlediği için Edanza'ya (https://jp.edanz.com/ac) teşekkür ederiz.

Tüm hayvan deney protokolleri, Jichi Tıp Üniversitesi hayvan etik komitesi tarafından onaylanmış ve Jichi Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Kılavuzu'ndaki Deney Hayvanlarının Kullanımı ve Bakımı kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Burada, böbreğe miRNA taklit iletimini, UUO fareleri kullanılarak aşırı ekspresyonuna neden olduğunu gösterdik. Bu çalışma Jichi Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır [Onay No. 19-12 renal fibroz için, 17-024 akut böbrek enfeksiyonu (AKI) için ve 19-11 diyabetik nefropati için].
1. PEI-NPs-miRNA-mimik kompleksinin hazırlanması
NOT: Burada, bir fare için PEI-NPs-miRNA-miRNA-mimic13,14,15 ve PEI-NPs-control-miRNA'nın (negatif kontrol olarak) hazırlanması açıklanmaktadır.
<ol><li>Aşağıdaki öğeleri hazırlayın:<ol><li>10 μL doğrusal PEI-NP hazırlayın.</li>
		<li>100 μM konsantrasyonunda nükleaz içermeyen suda çözünmüş 50 μL yapay olarak sentezlenmiş miRNA'lar hazırlayın (50 μL nükleaz içermeyen suda çözünmüş 5 nmol miRNA).</li>
		<li>100 μM konsantrasyonunda nükleaz içermeyen suda çözünmüş 50 μL yapay olarak sentezlenmiş kontrol (hedef olmayan) miRNA'ları hazırlayın (50 μL nükleaz içermeyen suda çözünmüş 5 nmol miRNA).</li>
		<li>% 5 ve% 10 glikoz çözeltileri hazırlayın. 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinin ve bir vorteks karıştırıcının kullanılabilirliğini sağlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>10 μL PEI-NP'yi, 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 90 μL% 5 glikoz çözeltisi içinde çözün. Ardından, tüpü yavaşça vorteks edin ve aşağı doğru döndürün.</li>
	<li>Nükleaz içermeyen suda (100 μM konsantrasyonu) çözünmüş 50 μL yapay olarak sentezlenmiş miRNA'ları (5 nmol), 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde 50 μM% 10 glikoz çözeltisi ile karıştırın. Ardından, tüpü yavaşça vorteks edin ve aşağı doğru döndürün. Bu işlem,% 5 glikoz çözeltisi içinde çözünmüş miRNA verir.</li>
	<li>100 μL PEI-NP'leri %5 glikoz çözeltisinde ve 100 μL miRNA taklitini (5 nmol) %5 glikoz çözeltisinde karıştırın. Ardından, tüpü yavaşça vorteks edin ve aşağı doğru döndürün.</li>
	<li>Kararlı bir PEI-NPs-miRNA-mimik kompleksi hazırlamak için karışımı oda sıcaklığında (RT) 15 dakika inkübe edin. Bu çözelti, polimerdeki azotların (N) nükleik asitlerdeki fosfata (P) oranında PEI-NP'ler ve miRNA taklidi (5 nmol) içerir (N / P oranı) = 6 (Şekil 1). NOT: PEI-NPs-control-miRNA kompleksi, bu makalede açıklanan tüm böbrek hastalığı fare modelleri (UUO, diyabetik nefropati ve AKI) için 1.1-1.5 adımlarında açıklanan aynı işlem kullanılarak hazırlanabilir. PEI-NP-miRNA'lar-taklitlerinin bir enjeksiyon hacmi, N / P oranında = 6'da PEI-NP'lerle konjuge edilmiş 5 nmol miRNA-mimik ile aynıdır. Her bir PEI-NP-miRNA'nın enjeksiyon süresi ve sıklığı, uygulandığı hastalık modeline bağlıdır.</li>
</ol>2. Floresan mikroskopi kullanılarak kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla PEI-NP ile UUO farelerde miRNA taklitinin böbreğe önemli ölçüde verildiğinin doğrulanması
NOT: Burada, yapay olarak saflaştırılmış miRNA taklitinin böbreğe verilme yöntemi, çeşitli böbrek hastalıkları için terapötik yöntemlerin oluşturulmasını gösteren ayrıntılı olarak ele alınmıştır. Kısacası, UUO farelere, kuyruk damarı yoluyla 100 μL PEI-NP'ye eklenen siyanin3 karboksilik asit (Cy3) etiketli miRNA taklidi uygulandı. Böbreklere verilen doğum floresan mikroskobu ile doğrulandı. Bir fare için PEI-NPs-siyanin3 karboksilik asit (Cy3) etiketli miRNA taklidi (oligonükleotidler) tanımlanmıştır. Bu yöntem, UUO fareleri, diyabetik böbrek hastalığı fareleri ve IRI tarafından üretilen AKI fareleri gibi çeşitli fare modellerinde böbreğe miRNA taklidini önemli ölçüde verebilir. Burada, video gösterimi için bir UUO fare modeli kullandık. UUO'nun indüksiyon yöntemi daha önce başka bir yerde tanımlanmıştır13. UUO ameliyatından sonraki altı gün içinde bu protokolleri takip edin.
<ol><li>Aşağıdaki öğeleri hazırlayın:<ol><li>2 μL PEI-NP ve 100 μL Cy3 etiketli çift sarmallı oligonükleotidler hazırlayın [Cy3 etiketli miRNA taklidi (1 nmol; 10 μM)].</li>
		<li>% 5 ve% 10 glikoz çözeltileri hazırlayın. 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinin ve bir vorteks karıştırıcının kullanılabilirliğini sağlayın.</li>
		<li>UUO farelerin kuyruk damarlarını izole etmek için kapakta küçük bir delik bulunan 50 mL'lik bir plastik santrifüj tüpü kullanın.</li>
		<li>Floresan mikroskobu için, optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği, bir kriyostat, sıvı azot, fosfat tamponlu salin (PBS), 27 G iğneli 1,0 mL şırıngalar ve silan kaplı cam hazırlayın. NOT: Floresein etiketli Lotus tetragonolobus lektin (proksimal tübül belirteci) ve 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), proksimal tübüllerin ve hücre çekirdeklerinin isteğe bağlı boyanması için hazırlanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>2 μL PEI-NP'yi 98 μL% 10 glikoz çözeltisi içinde 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde çözün. Ardından, tüpü yavaşça vorteks edin ve aşağı doğru döndürün.</li>
	<li>%10 glikoz çözeltisinde 100 μL PEI-NP'ye 100 μL Cy3 etiketli miRNA taklidi ekleyin (adım 2.2'de hazırlanmıştır). Ardından, tüpü yavaşça vorteks edin ve aşağı doğru döndürün.</li>
	<li>Stabil bir PEI-NPs-Cy3-labeled-miRNA-mimik kompleksi hazırlamak için karışımı RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>UUO fareyi anestezi olmadan 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve ardından kuyruğu kapaktaki hazırlanan delikten yerleştirin.</li>
	<li>1.0 mL'lik bir şırıngayı 27 G'lik bir iğne ile 200 μL PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimik kompleksi ile doldurun.</li>
	<li>27 G iğneli 1,0 mL şırıngayı kullanarak farenin kuyruk damarından PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimik (200 μL ) enjekte edin. NOT: Kuyruk damarını genişletmek ve enjeksiyon bölgesini dezenfekte etmek için kuyruk damarını etanol içine doymuş pamuk yünü (%70-%80) ile silin.</li>
	<li>200 μL PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimik kompleks enjeksiyonundan bir saat sonra, küçük hayvanlar için uygun bir anestezik cihaz kullanarak fareyi izofluran (% 4 -% 5) ile uyuşturun. Ayak parmağı sıkışma refleksinin yokluğunda anestezinin derinliğini onaylayın. Ameliyat boyunca anesteziyi izofluran (%3) ile sürdürün.</li>
	<li>Daha sonra, kalbi açığa çıkarmak için cerrahi makas ve forseps ile cilde, kaslara ve kaburgalara bir kesi yapın. Sağ atriyuma bir kesi yaptıktan sonra, böbrek rengi soluk sarıya dönüşene kadar (tüm fare vücudunun PBS ile perfüze edildiğini gösterir) vücut boyunca kan çekmek için PBS'yi sol ventriküle enjekte edin. NOT: Kardiyak perfüzyon, vücuttaki kanı etkili bir şekilde çıkarmak için yapılır.</li>
	<li>İzofluranı durdurun ve böbrekleri farelerden çıkarın ve PBS ile yıkayın. Bundan sonra, böbrek kapsüllerini böbreklerden çıkarın ve böbrekleri PBS ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Böbrek dokusu örneklerini OCT bileşiğine gömün ve sıvı azotta dondurun.</li>
	<li>Bölümleri hazırlamak için bir kriyostat kullanın (5 μm kalınlığında). Bölümleri silan kaplı cam slaytlara monte edin ve% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. NOT: Böbrek dokuları isteğe bağlı olarak proksimal tübüller için RT'de 2 saat boyunca floresein etiketli Lotus tetragonolobus lektin (2 mg / mL), ardından hücre çekirdekleri için 15 dakika boyunca RT'de DAPI (PBS'de 30 nM) ile boyanabilir.</li>
	<li>Slaytları PBS ile iki kez nazikçe yıkayın.</li>
	<li>Floresan boyamayı floresan mikroskobu ile 100x ve 400x büyütme ve uygun görüntüleme yazılımı ile görselleştirin.</li>
</ol>3. Kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla PEI-NP ile miRNA mimiğinin böbreğe verilmesini takiben hedef miRNA değişikliklerinin doğrulanması
<ol><li>Hedef miRNA değişimlerini doğrulamak için kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) gerçekleştirin. NOT: qRT-PCR18,19,20'nin ayrıntıları için daha önce yayınlanan makaleye bakın. Aşağıda verilen temsili sonuçları üretmek için kullanılan qRT-PCR sistemi üretici firma tarafından değiştirilmiştir. qRT-PCR, en son üreticinin protokolüne uygun olarak yapılmalıdır.</li>
</ol>

<ol><li>Mohr, A. M., Mott, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+microRNA+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Overview of microRNA biology.</a> Seminars in Liver Disease. 35 (1), 3-11 (2015).</li>
<li>Bushati, N., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">microRNA functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).</li>
<li>Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNAs+in+diabetic+nephropathy%3A+From+biomarkers+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Diabetes+Reports%22%5BJournal%5D)">microRNAs in diabetic nephropathy: From biomarkers to therapy.</a> Current Diabetes Reports. 16 (3), 35(2016).</li>
<li>Yheskel, M., Patel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+microRNAs+in+polycystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Therapeutic microRNAs in polycystic kidney disease.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (4), 282-289 (2017).</li>
<li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li>
<li>Dykxhoorn, D. M., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+silent+revolution%3A+RNA+interference+as+basic+biology%2C+research+tool%2C+and+therapeutic%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The silent revolution: RNA interference as basic biology, research tool, and therapeutic.</a> Annual Review of Medicine. 56, 401-423 (2005).</li>
<li>Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+silent+treatment%3A+siRNAs+as+small+molecule+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs.</a> Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).</li>
<li>Stewart, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-delivered+stable+gene+silencing+by+RNAi+in+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells.</a> RNA. 9 (4), 493-501 (2003).</li>
<li>Deng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klotho+gene+delivery+ameliorates+renal+hypertrophy+and+fibrosis+in+streptozotocin-induced+diabetic+rats+by+suppressing+the+Rho-associated+coiled-coil+kinase+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Klotho gene delivery ameliorates renal hypertrophy and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats by suppressing the Rho-associated coiled-coil kinase signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (1), 45-54 (2015).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressor+of+cytokine+signaling+%28SOCS%29+2+attenuates+renal+lesions+in+rats+with+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Suppressor of cytokine signaling (SOCS) 2 attenuates renal lesions in rats with diabetic nephropathy.</a> Acta Histochemica. 116 (5), 981-988 (2014).</li>
<li>Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+risks+related+to+the+use+of+adeno-associated+virus-based+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors.</a> Current Gene Therapy. 3 (6), 545-565 (2003).</li>
<li>Lukashev, A. N., Zamyatnin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+gene+therapy%3A+Current+state+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry.+Biokhimiia%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for gene therapy: Current state and clinical perspectives.</a> Biochemistry. Biokhimiia. 81 (7), 700-708 (2016).</li>
<li>Morishita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+microRNA-146a+with+polyethylenimine+nanoparticles+inhibits+renal+fibrosis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Delivery of microRNA-146a with polyethylenimine nanoparticles inhibits renal fibrosis in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 3475-3488 (2015).</li>
<li>Ishii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+in+diabetic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%3A+The+Journal+of+Laboratory+and+Clinical%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease.</a> Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. 237, 31-52 (2021).</li>
<li>Aomatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+in+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%3A+The+Journal+of+Laboratory+and+Clinical%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling in acute kidney injury.</a> Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. (21), 00283-00288 (2021).</li>
<li>Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Gopferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine-based+non-viral+gene+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems.</a> European Journal of Pharmceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).</li>
<li>Swami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+and+highly+efficient+nonviral+DNA%2FsiRNA+delivery+system+based+on+PEI-bisepoxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A unique and highly efficient nonviral DNA/siRNA delivery system based on PEI-bisepoxide nanoparticles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 835-841 (2007).</li>
<li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+microRNA+expression+in+the+kidneys+of+immunoglobulin+a+nephropathic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Detection of microRNA expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), e61535(2020).</li>
<li>Yanai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+evaluation+of+microRNA+expressions+in+mouse+kidney+with+unilateral+ureteral+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR evaluation of microRNA expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61383(2020).</li>
<li>Aomatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+detection+method+for+microRNAs+in+the+kidney+of+an+ischemic+kidney+injury+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A quantitative detection method for microRNAs in the kidney of an ischemic kidney injury mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), e61378(2020).</li>
<li>Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+anti-fibrotic+activity+of+plasmid+DNA+expressing+small+interference+RNA+for+TGF-beta+type+II+receptor+for+a+mouse+model+of+obstructive+nephropathy+by+cationized+gelatin+prepared+from+different+amine+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%3A+Official+Journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 110 (3), 610-617 (2006).</li>
<li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+renal+tubulointerstitial+fibrosis+by+small+interfering+RNA+targeting+heat+shock+protein+47%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Suppression of renal tubulointerstitial fibrosis by small interfering RNA targeting heat shock protein 47.</a> American Journal of Nephrology. 28 (1), 34-46 (2008).</li>
<li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+transfer+of+hepatocyte+growth+factor+to+skeletal+muscle+prevents+changes+in+rat+kidneys+after+5%2F6+nephrectomy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%3A+Official+Journal+of+the+American+Society+of+Transplantation+and+the+American+Society+of+Transplant+Surgeons%22%5BJournal%5D)">In vivo gene transfer of hepatocyte growth factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy.</a> American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2 (9), 828-836 (2002).</li>
<li>Hamar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+interfering+RNA+targeting+Fas+protects+mice+against+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (41), 14883-14888 (2004).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenon+preconditioning+protects+against+renal+ischemic-reperfusion+injury+via+HIF-1alpha+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Xenon preconditioning protects against renal ischemic-reperfusion injury via HIF-1alpha activation.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (4), 713-720 (2009).</li>
<li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNA+knockdown+of+connective+tissue+growth+factor+by+ultrasound-targeted+microbubble+destruction+improves+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNA knockdown of connective tissue growth factor by ultrasound-targeted microbubble destruction improves renal fibrosis.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (12), 2926-2937 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Bu makalede sunulan protokolü kullanarak, PEI-NP'ler, hedef miRNA'ların aşırı ekspresyonunu indüklemek için böbreğe miRNA taklitleri verebilir ve bu da renal fibroz, diyabetik böbrek hastalığı ve AKI dahil olmak üzere çeşitli böbrek hastalıklarının in vivo fare modellerinde tedavi etkilerine neden olabilir.
PEI-NP kompleksini ve miRNA taklidini hazırlama yöntemi çok basittir. PEI-NP'lerin pozitif yüklü yüzeyi, 13,14,15,16,17 karıştırıldığında miRNA taklidini<su...

miRNA'lar, proteinlere çevrilmeyen küçük kodlamayan RNA'lar (21-25 baz), birçok hedef mesajcı RNA'yı (mRNA'lar) istikrarsızlaştırarak ve çeşitli böbrek hastalıklarında translasyonlarını inhibe ederek inhibe eder 1,2. Bu nedenle, ekzojen yapay olarak sentezlenmiş miRNA taklitleri veya inhibitörleri kullanan gen tedavisi, birçok böbrek hastalığının gelişimini inhibe etmek için potansiyel yeni bir seçenektir 3,4,5.
Gen terapisi için miRNA taklitleri veya inhibitörlerinin vaadine rağmen, hedef organlara teslimat, in vivo deneylerin klinik potansiyellerini geliştirmeleri için büyük bir engel olmaya devam etmektedir. Yapay olarak sentezlenen miRNA taklitleri veya inhibitörleri serum RNaz tarafından derhal bozunmaya maruz kaldıklarından, in vivo6 sistemik uygulama üzerine yarı ömürleri kısalır. Ek olarak, miRNA taklitçilerinin veya inhibitörlerinin plazma zarını ve transfektan sitoplazmasını geçme etkinliği genellikle uygun vektörler olmadan çok daha düşüktür 7,8. Bu kanıtlar, böbrek için miRNA taklitlerinin veya inhibitörlerinin dağıtım sisteminin geliştirilmesinin, klinik ortamlarda kullanımlarını sağlamak ve çeşitli böbrek hastalıkları olan hastalar için yeni bir tedavi seçeneği haline getirmek için gerekli olduğunu göstermektedir.
Viral vektörler, eksojen miRNA taklitlerini veya inhibitörlerini böbreğe iletmek için taşıyıcı olarak kullanılmıştır 9,10. Biyogüvenlik ve transfeksiyon etkinliği için geliştirilmiş olmalarına rağmen, viral vektörler hala interferon yanıtına ve / veya genetik instabiliteye neden olabilirler11,12. Bu endişelerin üstesinden gelmek için, böbrek hastalığının birkaç fare modelinde viral olmayan bir vektör olan polietilenimin nanopartiküllerini (PEI-NP'ler) kullanarak böbrek için bir miRNA taklit dağıtım sistemi geliştirdik13,14,15.
PEI-NP'ler, miRNA taklitleri de dahil olmak üzere oligonükleotidleri böbreğe etkili bir şekilde iletebilen doğrusal polimer bazlı NP'lerdir ve uzun vadeli güvenlikleri ve biyouyumlulukları nedeniyle viral olmayan vektörlerin hazırlanmasında tercih edilir13,16,17.
Bu çalışma, tek taraflı üreter obstrüksiyonu (UUO) ile üretilen renal fibrozis model farelerde kuyruk ven enjeksiyonu yoluyla PEI-NP'lerle sistematik eksojen miRNA taklitçiliğinin etkilerini göstermektedir. Ek olarak, diyabetik böbrek hastalığı model farelerde (db/db fareler: C57BLKS/J Iar -+Lepr db/+Leprdb) ve renal iskemi-reperfüzyon hasarı (IRI) tarafından üretilen akut böbrek hasarı model farelerde kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla PEI-NP'lerle sistematik ekzojen miRNA mimik verilmesinin etkilerini gösterdik.

<table><tbody><tr><td>Çekirdeğe boyama için 4',6-diamidino-2-fenilindol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D-1306</td><td></td></tr><tr><td>Tampon RPE</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Yıkama tamponu 2</td></tr><tr><td>Tampon RWT</td><td>Qiagen</td><td>1067933</td><td>Yıkama tamponu 1</td></tr><tr><td>Kontrol-miRNA-taklit (yapay olarak sentezlenmiş miRNA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Atanmadı</td><td>5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3' (anlamlı) 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3&prime; (anlam karşıtı)</td></tr><tr><td>Cy3 etiketli çift sarmallı oligonükleotidler</td><td>Takara Bio Inc.</td><td></td><td></td>MIR7900</tr><tr><td>Floresein etiketli Lotus tetragonolobus lektin</td><td>Vektör Laboratuvarları A.Ş</td><td>. FL-1321</td><td></td></tr><tr><td>İn vivo-jetPEI</td><td>Polyplus</td><td>101000021</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp qRT-PCR için optik 96 kuyulu reaksiyon plakası</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316813</td><td>96 kuyulu reaksiyon plakası</td></tr><tr><td>MicroAmp Optik Yapışkan Film</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>96 oyuklu reaksiyon plakası</td></tr><tr><td>miRNA-146a-5p taklidi için yapışkan film (yapay olarak sentezlenmiş miRNA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> 5'-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3&prime <td>atanmamış</td><td>; (anlamlı) 5'-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3&prime; (anlam karşıtı)</td></tr><tr><td>miRNA-146a-5p primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00001638</td><td>Qiagen qRT-PCR kitlerini değiştirdiği için mevcut değil (Mayıs 2021'den itibaren miScript miRNA PCR sisteminden miRCURY LNA miRNA PCR Sistemine)</td></tr><tr><td>miRNA-181b-5p taklidi (yapay olarak sentezlenmiş miRNA)</td><td>Gen tasarımı</td><td>5'-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3'</td> <td>atanmadı</td></tr><tr><td>miRNA-181b-5p primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00006083</td><td>Qiagen qRT-PCR kitlerini değiştirdiği için mevcut değil (Mayıs 2021'den itibaren miScript miRNA PCR sisteminden miRCURY LNA miRNA PCR Sistemine)</td></tr><tr><td>miRNA-5100-mimik (yapay olarak sentezlenmiş miRNA)</td><td>Gen tasarımı</td><td>5'-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3&prime</td> <td>atanmadı</td>;</tr><tr><td>miRNA-5100-primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00042952</td><td>Qiagen qRT-PCR kitlerini değiştirdiği için mevcut değil (Mayıs 2021'den itibaren miScript miRNA PCR sisteminden miRCURY LNA miRNA PCR Sistemine)</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini kiti</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>2.0 mL'lik bir toplama tüpünde membran bağlantılı spin kolonu</td></tr>, <tr><td>miScript II RT kiti</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>Qiagen, qRT-PCR kitlerini değiştirdiği için mevcut değil (Mayıs 2021'den itibaren miScript miRNA PCR sisteminden miRCURY LNA miRNA PCR Sistemine)</td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR kiti</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>Qiagen, qRT-PCR kitlerini değiştirdiği için mevcut değil (Mayıs 2021'den itibaren miScript miRNA PCR sisteminden miRCURY LNA miRNA PCR Sistemine)QIA</td></tr> <tr><td>parçalayıcı</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>2.0 mL'lik bir toplama tüpünde</td></tr> <tr><td>biyopolimer spin kolonlarıQIAzol Lizis Reaktifi</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Fenol/guanidin bazlı lizis reaktifi</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Flex Gerçek Zamanlı PCR sistemi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>Gerçek zamanlı PCR cihazı</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Yazılım sürümü 1.2.1.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>Gerçek zamanlı PCR cihaz yazılımı</td></tr><tr><td>RNaz içermeyen su</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>RNU6-2 primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td>Qiagen qRT-PCR kitlerini değiştirdiği için mevcut değil (Mayıs 2021'den itibaren miScript miRNA PCR sisteminden miRCURY LNA miRNA PCR Sistemine)</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT (Optimal Kesme Sıcaklığı Bileşiği)</td><td>Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.</td><td>Atanmadı</td><td></td></tr></tbody></table>

Çeşitli böbrek hastalığı fare modellerinde polietilenimin nanopartikülleri kullanılarak ekzojen yapay olarak sentezlenmiş mirna mimiklerinin böbreğe verilmesi

Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models

mikroRNA'lar (miRNA'lar), proteinlere çevrilmeyen küçük kodlamayan RNA'lar (21-25 baz), çeşitli böbrek hastalıklarında dengelerini bozarak ve translasyonlarını inhibe ederek birçok hedef mesajcı RNA'yı (mRNA) inhibe eder. Bu nedenle, miRNA ekspresyonunun eksojen yapay olarak sentezlenmiş miRNA taklitleri ile değiştirilmesi, birçok böbrek hastalığının gelişimini inhibe etmek için potansiyel olarak yararlı bir tedavi seçeneğidir. Bununla birlikte, serum RNAaz, sistematik olarak uygulanan eksojen miRNA taklitlerini in vivo olarak derhal bozduğundan, miRNA'nın böbreğe verilmesi bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, eksojen miRNA taklitlerini RNAaz tarafından bozulmaya karşı koruyabilen ve bunları böbreğe önemli ölçüde iletebilen vektörler gereklidir. Birçok çalışma, böbreğe eksojen miRNA taklitleri veya inhibitörleri vermek için viral vektörler kullanmıştır. Bununla birlikte, viral vektörler interferon yanıtına ve / veya genetik instabiliteye neden olabilir. Bu nedenle, viral vektörlerin gelişimi, eksojen miRNA taklitlerinin veya inhibitörlerinin klinik kullanımı için de bir engeldir. Viral vektörlerle ilgili bu endişelerin üstesinden gelmek için, polietilenimin nanopartiküllerinin (PEI-NP'ler) kuyruk damarı enjeksiyonunu kullanarak böbreğe miRNA taklitleri vermek için viral olmayan bir vektör yöntemi geliştirdik, bu da böbrek hastalığının birkaç fare modelinde hedef miRNA'ların önemli ölçüde aşırı ekspresyonuna yol açtı.

Aşağıda tarif edilen renal fibrozis, diyabetik nefropati ve AKI için hedef miRNA'lar, gen terapisi uygulamaları için mikrodizi, qRT-PCR ve / veya veritabanı araştırmasına dayanarak seçildi. Daha fazla ayrıntı için, önceki yayınlarabakın 13,14,15.
Renal fibrozis farelerinde PEI-NP'ler kullanılarak miRNA-146a-5p-mimik verilmesi ve etkileri13 F...

Burada, çeşitli böbrek hastalığı fare modellerinde viral olmayan bir vektörün kuyruk damarı enjeksiyonu ve polietilenimin nanopartikülleri yoluyla böbreğe yapay olarak sentezlenmiş dışsal miRNA taklitleri veriyoruz. Bu, böbrekte hedef miRNA'nın önemli ölçüde aşırı ekspresyonuna yol açtı ve birkaç fare modelinde böbrek hastalığının ilerlemesini engelledi.

Çeşitli Böbrek Hastalığı Fare Modellerinde Polietilenimin Nanopartikülleri Kullanılarak Ekzojen Yapay Olarak Sentezlenmiş MiRNA Mimiklerinin Böbreğe Verilmesi

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by ...

Bu yöntem, mikroRNA'nın böbreğe tedavisinde anahtar soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir, bu da bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu tekniğin temel avantajı, interferon yanıtına veya genetik instabiliteye neden olmadan mikroRNA taklitlerinin böbreğe tedavisini mümkün kılmasıdır. 10 mikrolitre PEI-NP'yi, 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde 90 mikrolitre% 5 glikoz çözeltisi içinde çözerek başlayın.Sonra tüpü yavaşça vorteks edin ve aşağı doğru döndürün. 100 mikromolar nükleaz içermeyen suda çözünmüş 50 mikrolitre yapay olarak sentezlenmiş miRNA'yı, 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde 50 mikromolar% 10 glikoz çözeltisi ile karıştırın. Tüpü yavaşça vorteks edin ve aşağı doğru döndürün.Bu işlem,% 5 glikoz çözeltisi içinde çözünmüş miRNA verir. Daha sonra 100 mikrolitre PEI-NP'yi% 5 glikoz çözeltisinde ve% 5 glikoz çözeltisinde 100 mikrolitre miRNA taklidi karıştırın. Tüpü yavaşça vorteks edin ve aşağı doğru döndürün.Kararlı bir PEI-NP miRNA taklidi kompleksi hazırlamak için karışımı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. İki mikrolitre PEI-NP'yi, 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde 98 mikrolitre% 10 glikoz çözeltisi içinde çözün. Tüpü yavaşça vort

delivery-exogenous-artificially-synthesized-mirna-mimic-to-kidney

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu videoda, nükleik asit transfeksiyonu için fare böbreğinin renal pelvisine plazmitlerin hidrodinamik enjeksiyonu protokolünü sunuyoruz. Bu teknik, plazmitleri doku hasarına neden olmadan belirli bölgeye zorla iten yüksek hidrostatik basınç ilkesini kullanarak plazmitlerin organa spesifik olarak verilmesine izin verir.

Hidrodinamik Renal Pelvis Enjeksiyonu: DNA'yı Murin Modelinin Böbrek Hücrelerine Doğrudan Verme Tekniği

Bu makalede, formalin içerisinde tespit edilmiş böbrek bölümlerinde microRNA ifade Renkölçer tespiti için optimize edilmiş bir in situ hibridizasyon protokolü tarif eder.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Formalin Sabit Böbrek Dokular Hibridizasyon

Bu iletişim kuralı yoluyla renal pelvis transgene özellikle böbrek ifadede üretmek için fare böbrek içine plazmid DNA enjekte yöntemi açıklanır.

Hidrodinamik Renal Pelvis enjeksiyon böbrek proteinlerin Non-viral ifade

Bu iletişim kuralı bir tam böbrek iş-up glomerular hastalığı fare modellerinde yürütülmesi gereken açıklar. Yöntemler glomerular hastalığı tüm fare modelleri uygulanabilir glomerular işlevinin ayrıntılı işlevsel, yapısal ve mekanik analiz için olanak sağlar.

Fare modelleri Glomerular hastalığı böbrek fonksiyonlarının değerlendirilmesi

Bu makale, kantitatif gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak akut böbrek hasarı olan bir fare modelinin böbreklerinde mikroRNA ekspresyonunu tespit etmek için bir protokol sunmaktadır. Bu protokol, iskemik böbrek hasarı fare modelini ve mikroRNA örneklerinin dikkatli bir şekilde çıkarılmasını vurgular.

İskemik Böbrek Hasarı Fare Modelinin Böbrekteki MikroRNA'ları için Kantitatif Bir Tespit Yöntemi

Tek taraflı üreteral obstrüksiyonu (UUO) olan farelerin böbreklerinde mikroRNA ekspresyonunu kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ile değerlendirmek için bir yöntem tanımladık. Bu protokol UUO ile farelerde ve diğer patolojik durumlar bağlamında böbrek mikroRNA ekspresyon profillerinin incelenmesi için uygundur.

Fare Böbreğinde Tek Taraflı Üreteral Obstrüksiyonile MikroRNA Ekspresyonlarının Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR Değerlendirilmesi

mikroRNA'lar IgA nefropatisinin patogenezinde rol oynarlar. Bir IgA nefropati fare modelinin (HIGA fareleri) böbreklerindeki mikroRNA ekspresyon seviyelerini tespit etmek için güvenilir bir yöntem geliştirdik. Bu yeni yöntem, IgA nefropatisinde miRNA tutulumunu kontrol etmeyi kolaylaştıracaktır.

İmmünoglobulin A Nefropatik Farelerin Böbreklerinde MikroRNA Ekspresyonunun Tespiti

Bu makalede, faredeki infrarenal abdominal aort içine yerleştirilen bir kateter aracılığıyla tek bir böbreğe hedefli doğum için bir yöntem açıklanmaktadır.

Böbrek Atardamarı Ile Böbreğe Doğrudan İlaç Verilmesi

Bu çalışmada, yaşa bağlı böbrek yetmezliği olan farelerin böbrek ve serumundaki mikroRNA ekspresyonunu kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ile değerlendirmek için bir yöntem sunuyoruz.

Kantitatif Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonunun Böbrekte ve Serumda Yaşa Bağlı Böbrek Yetmezliği Olan Farelerin Serumunda Değerlendirilmesi

Burada, onkojenik nükleik asitlerin terapötik susturulması için klinik olarak uygulanabilir bir yaklaşım sağlayarak, RNA oligomerlerini taşıyan manyetik demir oksit nanopartiküllerinin hayvan modellerinde metastatik meme kanserine in vivo olarak verilmesi için protokolü açıklıyoruz.

Murin Meme Kanseri Metastazlarında Nanoilaç Birikiminin İzlenmesi

Bu rapor, fare böbreğine etkili ve güvenli gen transferi için renal pelvis yoluyla AAV vektörlerinin lokalize enjeksiyon yöntemini detaylandırmaktadır.

Adeno ilişkili virüs vektörlerinin yavaş retrograd renal pelvis enjeksiyonu yoluyla fare böbreğine etkili ve güvenli gen iletimi

Keşfedin, polietilenimin nanopartikülleri kullanarak fare böbrek hastalığı modellerinde miRNA taklitlerinin böbreğe verilmesi yöntemini. Bu teknik, hedef miRNA'nın aşırı ekspresyonunu sağlayarak hastalık ilerlemesini inhibe eder.

Çeşitli Böbrek Hastalığı Fare Modellerinde Polietilenimin Nanopartikülleri Kullanılarak Ekzojen Yapay Olarak Sentezlenmiş MiRNA Mimiklerinin Böbreğe Verilmesi (Video) | JoVE Journal

Çeşitli Böbrek Hastalığı Fare Modellerinde Polietilenimin Nanopartikülleri Kullanılarak Ekzojen Yapay Olarak Sentezlenmiş MiRNA Mimiklerinin Böbreğe Verilmesi

Daha fazla video keşfet