Farelerde Terminal H-refleks Ölçümleri
16 Haziran 2022
Spastisitenin Hoffmann refleksine (H-refleksi) dayanarak ve periferik sinirlerin elektriksel stimülasyonu kullanılarak klinik olarak değerlendirilmesi kanıtlanmış bir yöntemdir. Burada, fare ön pençesinde H-refleks ölçümü için bir terminal ve doğrudan sinir stimülasyonu için bir protokol sağlıyoruz.
H-refleksi, nöro devrelerin bütünlüğünün elektrofizyolojik olarak doğrulanmasını sağlar. Farelerde H-refleksini doğrudan ön pençenin sinirlerinde ölçmek için bir terminal protokolü sunuyoruz. Geleneksel oldukça sinir-spesifik olmayan transkutanöz kayıtlardan farklı olarak, sonuçlar fareler ve ölçüm günleri arasında daha az değişkendir.
Hastalardaki H-refleks kayıtlarına benzer şekilde, hassas nicelleştirme, omurilik yaralanması ve inme gibi hastalık modellerinde elektrofizyolojik karakterizasyona izin verdiği için. Protokol, farelerde cerrahi ekipmanlarla çalışmada sağlam deneysel beceriler gerektirir.
Sinirleri bağ dokusundan ve kan damarlarından nasıl ayıracağınızdan emin değilseniz, önce pratik yapın. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan doktora öğrencisi Frederique Wieters tarafından yapılacak. Başlamak için, yetişkin anestezi uygulanan 8 ila 16 haftalık C57 siyah / 6J fareyi kapalı ısıtma yastığına yerleştirin ve fare sakinleşene, nefes almaya kararlı olana ve refleksler yok olana kadar bekleyin.
Fareyi sırt üstü çevirin. Ardından, ön pençeleri bantla sabitleyin. Bandı, ölçüm elektrotları ön ayaklara kolayca yerleştirilecek şekilde konumlandırın.
Bir farenin sıcaklığını ölçmek için bir rektal prob yerleştirin ve bantla sabitleyin. Gözlerin kurumasını önlemek için göz merhemi uygulayın. Cildi cımbızla kaldırırken kürkü bir çift ince, yuvarlak makasla dikkatlice çıkarın.
Daha sonra, bir çift ince, yuvarlak makasla ön pençenin ventroposterior ekseni boyunca deride bir santimetrelik bir kesi yapın. Bağ dokusunu dikkatlice çıkarın ve altındaki kas ve siniri açığa çıkarın. Daha sonra medyan siniri değerlendirmek için forseps kullanarak maruz kalan pektoralis profundus kasını çıkarın.
Az miktarda kan ve doku sıvısını yumuşak doku kağıdı ile çıkarın. Daha sonra, sinir demetini ortaya çıkarmak için meme veya aksiller kası yukarıdan aşağıya doğru dikkatlice kesin. Sinir demetini bağ ve kas dokusundan yaklaşık 1,5 santimetre uzunluğunda serbest bırakın.
Ön pençenin ulnar ve median sinirini bükülmüş bir cam pipet kullanarak dikkatlice ayırın. Üst sinir ulnar sinir, alt sinir ise median sinirdir. Uyarıcı kanca elektrotlarını paralel olarak 0,5 ila bir milimetre mesafede düzenleyin ve çift kancayı sinire yakın konumlandırmak için bir mikromanipülatör kullanın.
Ulnar siniri stimülasyon kancası elektrotlarına kaldırmak için cam kancayı kullanın. Ardından, elektrodu sinirle geri çekin ve diğer sinirlerden ayırın. Kaslar arasındaki karışmayı azaltmak için elektrotları pençenin uzun ekseni boyunca yerleştirin.
Sinire bağlı elektrot kancalarını yüzeysel olarak kurutun ve bitişik dokudan elektrik yalıtımı sağlamak için bir şırınga kullanarak petrol jölesi uygulayın. H-refleksini ölçmek için, elektromiyografi elektrotlarını kas içine doğru ön pençeye yerleştirin. Ardından, referans elektrotunu minyatür bir timsah klipsi tarafından tutulan arka bacakta deri altından yerleştirin.
Stimülatör açıldığında, ön pençenin küçük seğirmeleri olarak başarılı bir stimülasyon gözlemleyin. M-dalgasını ortaya çıkarmak için minimum stimülasyon akımı ve ön pençedeki küçük görünür seğirmeler 10 ila 50 mikroamper arasındadır. Sinir stimülasyonunu her biri 0.2 milisaniye uzunluğundaki darbelerle 15 kez gerçekleştirin.
Uyaran kümeleri arasında iki dakikalık duraklamalarla, frekans 0.1, 0.5, 1.0, 2.0'dan 5 hertz'e yükseltilir. Hoffman refleksini ve kas tepkisini ölçmek için yollarda kurulan kaydın bir örneği burada gösterilmiştir. H-ve M-dalgası genlikleri arasındaki oran değerlendirildi.
Uyaran ve ilgili stimülasyon artefaktı sıfır milisaniyeye ayarlandı, bunu doğrudan M-dalgası ve ardından H-dalgasını temsil eden daha küçük tepe noktası izledi. M-dalgası stimülasyondan yaklaşık iki milisaniye sonra ve H dalgası omurilikten daha uzun geçiş süresi nedeniyle altı ila sekiz milisaniye sonra meydana gelir. Sinirlerin ayrılmasının yanı sıra, elektrota ve ayrıca iki kanca arasına petrol jölesi uygulanması kritik öneme sahiptir.
Bu bir terminal deneyidir. Laboratuvarımızda bu teknik, transkutanöz H-refleks kayıtlarına yeni bir altın standart referans sağlamıştır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, terminal ve doğrudan sinir stimülasyonu kullanarak fare ön patisindeki Hoffmann refleksinin (H-refleksi) miktarının belirlenmesi için bir protokol sunmaktadır. Bu yöntem, farklı fareler ve deney günleri arasında daha tutarlı sonuçlar sağlayarak geleneksel transkütan kayıtların ötesine geçer ve omurilik yaralanması ile inme gibi hastalık modellerinde elektrofizyolojik karakterizasyonu kolaylaştırmayı amaçlar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Elektrofizyoloji
- Nörobiyoloji
- Hastalık modellemesi
Arka Plan
- H-refleksi, spastisitenin değerlendirilmesi için kabul görmüş bir yöntemdir.
- Nöral devrelerin bütünlüğü elektrofizyolojik olarak değerlendirilebilir.
- Protokol, fare biyolojisi ile ilgili ölçümlerdeki değişkenliği azaltmayı amaçlamaktadır.
Kullanılan Yöntemler
- Doğrudan sinir stimülasyonu yoluyla H-refleksi kaydı
- Fareler (C57 black/6J), 8–16 haftalık
- Sinir ve kas yanıt değerlendirmesi için elektromiyografi
Temel Sonuçlar
- Yeni terminal protokolü, geleneksel yöntemlere kıyasla azalmış değişkenlik göstermektedir.
- Başarılı stimülasyon, H-refleks kayıtlarını doğrulayan gözlemlenebilir ön pençe yanıtlarına yol açmıştır.
- Temel ölçümler, H-dalgası ve M-dalgası amplitüd oranlarını içerir.
Sonuçlar
- Bu çalışma, araştırmalarda H-refleksinin miktarının belirlenmesi için güvenilir bir yöntem sunmaktadır.
- Bu protokol, spastisiteyi etkileyen nörolojik durumların incelenmesini destekleyebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Sinir devresi bütünlüğünün doğrudan elektrofizyolojik ölçümü, nörolojik hastalık modellerinde hedef doğrulamasını destekler. Terminal H-refleksi protokolü, spastisite değerlendirmesindeki değişkenliği azaltarak translasyonel araştırmalar için öngörü güvenilirliğini artırır. Bu durum, omurilik yaralanması ve inme hedefli preklinik portföylerde daha güvenilir devam/dur kararları verilmesini sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Spinal refleks yolunun bütünlüğünü nicelendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Doğrudan sinir stimülasyonu ölçümleri aracılığıyla biyolojik risk azaltma sağlar.
- Öngörücü Değer: Elektrofizyolojik spastisite fenotiplerine sahip hastalık modellerini belirleyerek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Fareler ve deney günleri arasında standardize edilmiş, düşük değişkenlikli H-refleks ölçümleri sağlar.
- Kantitatif Çıktı: Objektif spastisite değerlendirmesi için H-dalga/M-dalga genlik oranları üretir.
- Platformun Yeniden Kullanımı: Küçük modifikasyonlarla ulnar, median, tibial ve siyatik sinirlere uyarlanabilir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgili Önem: Hipertonia ve istemsiz kasılmalarla ilişkili H-refleks artışı aracılığıyla inme sonrası spastisiteyi modeller.
- Translasyonel Süreklilik: Hastalardaki klinik H-refleks kayıtlarını yansıtarak türler arası doğrulamaya olanak tanır.
- Risk Ayarlı Gelişim: Spinal yolaklarda hedef etkileşimini onaylayarak mekanistik risk azaltımını destekler.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Yöntem, hedef doğrulamadan nörolojik hastalık modellerindeki preklinik etkinlik testlerine kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Kas yanıtına olan spinal refleks katkılarını izole ederek yolak açıklığının testini sağlar.
- Tarama: Doğrudan sinir stimülasyonu ve vazelin izolasyonu aracılığıyla analiz tekrarlanabilirliğini sağlar.
- Analitik: Deneysel koşulları karşılaştırmak için nicel bir çıktı olarak H-dalgası/M-dalgası oranını sunar.
- Translasyonel Araştırma: Elektrofyizyolojik homoloji yoluyla klinik spastisite biyobelirteçleri ile uyum sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Laboratuvarlar arası elektrofyizyolojik doğrulama için altın standartta bir referans oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Nörodöngü bütünlüğü değerlendirmesindeki ölçüm değişkenliğini azaltarak öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Denekler ve ölçüm günleri arasındaki standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Çevrilebilir olmayan hedeflerin daha erken tanımlanmasını sağlayarak sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Elektrofizyolojik hedef doğrulamasına dayalı olarak bileşiklerin riskten arındırılmış önceliklendirilmesini kolaylaştırır.
Uygulama Hususları
- Fare cerrahisi, sinir diseksiyonu ve elektrofizyolojik kayıt konularında uzmanlık gerektirir.
- Mikromanipülatörler, stimülatörler ve EMG amplifikatörleri dahil olmak üzere hassas enstrümantasyon gerektirir.
- Sinir izolasyonu ve elektrot yerleştirme tekniklerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Protokolün arka ayak sinirlerine uygulanması sırasında adaptasyon değerlendirmeleri içerir.
- Terminal doğası gereği sınırlıdır ve aynı hayvan üzerinde boylamsal çalışmaları engeller.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:15
Preparation
1:53
Surgery
2:54
Electrode Placement
3:34
Placement of the Recording and Reference Electrodes and Measurement
4:25
Results: Terminal H-Reflex Quantification at the Ulnar and Median Nerves of the Mouse Forepaw
5:04
Conclusion
