Transkriptom Düzeyinde İnsan Primer Mezenterik Arteriyel Endotel Hücrelerinin İzolasyonu ve Profillenmesi

Transkriptomik düzeyde gen ekspresyonunu karakterize etmek, sağlık ve hastalıkta hücre fonksiyonunu anlamanın anahtarıdır. Yöntemimiz, vasküler duvarın kritik tabakası olan endotel hücrelerini, tek hücreli ve uzamsal bir çözünürlükle transkriptomik profilleme için insan donörlerinin menesterik arterlerinden yakalamaya odaklanmaktadır. Hücre kaybına neden olabilecek bir sıralama adımı olmayan bir damardan zenginleştirilmiş bir endotel hücresi popülasyonu vardır.

Ayrıca, doku bağlamında hücre-hücre etkileşimlerinin araştırılmasına izin veren başka hücre tipleri de mevcuttur. Bu tekniği diyabet ve obezitedeki arteriyel değişiklikleri araştırmak için kullandık. Geminin mevcudiyetine bağlı olarak, bu teknikler diğer vaskülatür ve diğer hastalıklarda biyolojiyi keşfetmek için de yeniden kullanılabilir.

İlk kez geliyorsa, iki önemli adım en fazla uygulamayı gerektirir. Birincisi, kazıma, daha derin katmanları ayırmadan integral hücreleri çıkarmak için yeterli kuvvet uygulanmalıdır. Ve iki, kriyostat kesitleme.

Bölümlerin soğuk, düz olduğundan ve özel slaytın sınırları içinde olduğundan emin olun. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan doktora sonrası iki araştırmacı olan Yingjun Luo ve Xiaofang Tang olacak. Başlamak için dokuyu DPBS ile yıkayın.

Steril forseps ve diseksiyon makası ile damar temizlenene kadar yağ ve dış bağ dokularını çıkarın. Geminin uzunluğunu kabın dışına yerleştirilmiş bir cetvelle ölçün ve fotoğraf kayıtları alın. Damar lümenini dikey olarak açmak için mezenterik arteri uzunlamasına makasla kesin.

İğneler kullanarak, kabı dört köşedeki siyah balmumu üzerine takın ve intima'yı açığa çıkarın. İntima için bir mililitre önceden ısıtılmış sindirim tamponu ekleyin. Steril bir neşter kullanarak, kabın lümenini iki kez hafifçe kazıyın.

Sindirim tamponunu bir tüpe aktarın. Kalan hücreleri toplamak ve hücre süspansiyonunu bir tüpe aktarmak için intima ve pipete bir mililitre sindirim tamponu ekleyin. Hücreleri bir inkübatörde veya bir rocker'da beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Enzimatik reaksiyonu söndürmek için hücre süspansiyonuna M199 ortamı ekleyin ve yavaşça karıştırın. Süspansiyonu dört santigrat derecede beş dakika ve santrifüjlemenin sonuna G.At 600 kez santrifüj yapın, tüm hücrelerin pelette yakalanıp yakalanmadığını gözlemlemek için süpernatantı ayrı ayrı bir kontrol kültürü olarak çıkarın ve saklayın. Ardından, hücre peletini bir mililitre M199 ortamında tekrar askıya alın.

10 mikrolitre tripan mavisini 10 mikrolitre hücre stoğu ile karıştırarak hücre canlılığını değerlendirin. Hücre morfolojisini gözlemleyin ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Altı delikli bir plakanın iki kuyusunu, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 500 mikrolitre ataşman reaktifini kuyucuklara pipetleyerek kaplayın.

Kuyuları steril DPBS ile yıkadıktan sonra, tüm hücre stoğunu bir kuyuya dağıtın ve süpernatant ikinci kuyuya kontrol olarak tutulur. Santrifüj daha önce hücre stoğunu beş dakika boyunca dört santigrat derece ve 600 kez G'de hazırlamıştı. Süpernatantı çıkarın ve DPBS'de %0,04 BSA'da bir P-1000 pipetle peleti nazikçe yeniden askıya alın.

Tek hücreli bir süspansiyon sağlamak için iyice karıştırın. Hücre kalıntılarını gidermek için çözeltiyi 40 mikrometrelik bir süzgeçten geçirin. Ardından, süspansiyonu santrifüj edin ve gösterildiği gibi süpernatantı çıkarın.

Bir P-1000 pipet kullanarak peleti DPBS'de 500 mikrolitrelik %0,04 BSA'da tekrar askıya alın ve tek hücreli bir süspansiyon sağlamak için iyice karıştırın. Daha önce gösterildiği gibi, tripan mavisi kullanarak hücre canlılığını değerlendirin. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak, tek hücreli süspansiyon morfolojisini gözlemleyin, doku kalıntılarını kontrol edin ve canlı ve ölü hücrelerin sayısını hesaplayın.

Metal bir kutuya isopentan ekledikten sonra, sıvı azot veya kuru buzda soğutun. OCT bileşiğini etiketli plastik kriyo kalıbının kuyucuklarına dökerek kabarcık oluşumunu önleyin. Kriyo kalıbını soğuması için kuru buz üzerinde bırakın.

Geminin uzunluğunda bir santimetrenin en az iki koronal bölümünü kesin. 12 inçlik forseps kullanarak, dokuyu donana kadar isopentana batırın. Dokuyu OCT'ye oryantasyonda, merkezde görülebilen lümen ile hızlı bir şekilde batırın.

Kriyo kalıplarını kavrayın ve kuru buz üzerine yerleştirin ve donmayı gözlemleyin. OCT, bir ila iki dakika içinde dışarıdan giderek beyazlaşacaktır. Bu bölümleri altı aya kadar eksi 80 santigrat derecede güvenli bir kapta saklayın.

Oda ve numune kafası için istenen kriyostat sıcaklığını ayarlayın. OCT'ye gömülü kap bölümlerini, bıçakları, fırçaları ve slaytları kriyostatta yaklaşık 30 dakika boyunca eksi 20 santigrat dereceye kadar dengeleyin. Denge kurarken, makineyi ve bıçak da dahil olmak üzere bölümlere temas edebilecek tüm ekipmanı% 70 etanol ve ardından RNaz dekontaminasyon çözeltisi ile temizleyin.

Dairesel kriyostat bloğuna az miktarda OCT dağıtarak ve donmadan önce numuneyi üstüne yerleştirerek numuneyi takın. Bloğu numune kafasının ortasına yerleştirdikten sonra, soldaki uzun siyah sapı kullanarak bloğu yerine vidalayın. Gemiyi çevreleyen fazla OCT'yi kesin.

Kesme kalınlığını kriyostatta 10 mikrometreye ayarlayarak, yaklaşık 60 bölüm kesin ve bunları RNA ekstraksiyon reaktifi içeren önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Bölümler tamamen çözülene kadar vorteks. RNA'yı metin yazısında açıklandığı gibi çıkarın ve saflaştırılmış RNA peletini beş mikrolitre RNaz içermeyen suda çözün.

10 mikrometre kalınlığındaki kesitleri yuvarlanmayı önleyici plaka ile yerinde kesin. Çevirin ve çevredeki OCT'deki bölüme hafifçe dokunarak dikkatlice düzleştirin. Slaytı etanol ile silin ve yakalama alanının arka tarafını parmağınızla önceden ısıtın.

RNase içermeyen kriyostat fırçaları veya doğrudan slayt kullanarak, doku bölümünü yalnızca çevreleyen OCT'yi kullanarak kare içine yerleştirin. Bölüm yapıştıktan sonra, bölümün donmasına izin vermek için slaytı kriyo çubuğunun üzerine yerleştirin.

Daha önce gösterildiği gibi 10 mikrometre kalınlığındaki doku kesitlerini doku optimizasyonu veya gen ekspresyon slaytlarına kesin. Slaytı kuru buz üzerine yerleştirilmiş bir slayt postalayıcısına aktarın. Şekil, tarif edilen protokol kullanılarak kültürlenmiş izole edilmiş EC'leri, minimum kirletici hücrelere sahip farklı bir parke taşı benzeri morfoloji sergilemektedir.

EC marker vasküler endotelyal kadherinin ekspresyonu, hücre-hücre bileşkelerini görselleştiren immünofloresan kullanılarak doğrulandı. Hücrelerin yaklaşık% 80'i CD31-pozitifti, bu da insan mezenterik arteriyel EC'lerinin yeni izole edilmiş hücre popülasyonunun çoğunu oluşturduğunu gösteriyordu. Başarısız izolasyonlar, morfolojisi bozulmuş, potansiyel olarak mezenkimal belirteçleri eksprese eden veya fibroblastik bir duruma benzeyen uzamış hücrelerle sonuçlanır.

Şekil, izole insan mezenterik arteriyel ECS'sinde tek hücreli RNA dizilimi için mevcut protokol kullanılarak mezenterik arter için izole edilmiş temsili bir üniform manifold yaklaşımı ve projeksiyonunu göstermektedir ve% 34'ü PECAM1 ve VWF'yi belirteçler olarak kullanarak ECs olarak kümelenmiş hücrelerle. Yüksek kaliteli RNA, altıdan az olmayan bir RNA bütünlük sayısı göstermelidir ve 28S ila 18S ribozomal RNA bantlarının oranı mümkün olduğunca ikiye yakındır. RNA'lar bozulduğunda bu ribozomal RNA sinyallerinin zayıflığı veya yokluğu gözlenebilir.

Hematoksilin ve eozin boyaması, damarın morfolojisini görselleştirdi ve ilgi alanlarının tanımlanmasına izin verdi. Gen ekspresyonu, hematoksilin ve eozin boyalı damar üzerinde uzamsal ankraj ile görselleştirildi. Özellikle uzamsal transkriptom profillemesi için RNA kalitesini korumak için doku ve hücre stoğunu dikkatli bir şekilde kullanın.

RNA bozulmasını azaltmak için dokunun kuru buz üzerine yerleştirildiğinden emin olun. Ayrıca, bölümleri ve dokuları önceden soğutulmuş aletlerle tutun. Diyabet bağlamında LncRNA'lar ve diğer hücre tipleriyle etkileşimleri de dahil olmak üzere EC gen ekspresyon değişikliklerini keşfedebildik.

Bu transkriptomik değişikliklerin yerini uzamsal transkriptom profilleme tekniklerini kullanarak çıkarabiliriz.