Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Fare Nöromüsküler Kavşağında Yüksek Zamansal Çözünürlükte Kalsiyum Geçici Maddelerinin Kaydı

Presinaptik kalsiyum seviyesinin tahmini, sinaptik iletimin incelenmesinde önemli bir görevdir. Kalsiyum sinyallemesini incelemek, nörodejeneratif hastalıkları tedavi etmenin yollarını bulmak için de önemlidir. Sunulan yükleme tekniğinin temel avantajı, boyamanın sadece ilgilenilen hücreler için yapılmış olmasıdır.

Kalsiyum uyumsuzluğunu kaydetme yöntemimiz son derece iyi mekansal-zamansal çözünürlük sağlar. Sunulan kayıt yöntemi, konfokal mikroskop kullanarak hızlı periyodik süreçleri kaydetmesi gereken nörofizyologlar için yararlı olabilir. Yükleme tekniğindeki en zor adım, siniri pipetin içinde tutmaktır.

Pipetin çapı mükemmel bir şekilde oturmalıdır, bu yüzden birkaç tane yapın. Protokoldeki tüm adımların karmaşık olduğunu bilmek ve her birini göstermek çok yardımcı olacaktır. Elastomer kaplı Petri kabında levator auris longus kas dokusunu ince paslanmaz çelik pimlerle hafifçe gerilmiş bir şekilde sabitleyerek başlayın ve kas tamamen kaplanana kadar Ringer'ın çözeltisini tabağa ekleyin.

Ardından, hücre içi kayıtlar için ince keskin uçlu bir mikropipet hazırlamak üzere bir mikropipet çektirici kullanın. İç filamentler olmadan kılcal damarlar kullanın. Konikliği aşındırıcı ile puanladıktan sonra, mikropipet ucunu kırın ve bir ucu çapı yaklaşık 100 mikrometreye kadar açık bırakın.

Ardından, iç çap 80 mikrometreden 12 mikrometreye düşene kadar ucu ateşle cilalayın. İşiniz bittiğinde, bir tarafa silikon bir tüp ve doldurma pipetinin diğer tarafına iğnesiz bir şırınga takın. Bir stereo mikroskop altında, sinir gövdesinin ayrı sinir dallarına dönüştüğü yeri bulun.

Dolgu pipetini balmumu kullanarak Petri kabının üzerine yerleştirin ve ardından pipet ucunu sinirin üzerinde durana kadar hareket ettirin. Siniri kas lifine yakın ince makasla kesin, sinir kütüğünün yaklaşık bir milimetre uzunluğunda küçük bir parçasını bırakın. Ardından, sinir kütüğünü, siniri sıkıştırmadan, bir miktar Ringer çözeltisi ile doldurma pipetinin ucuna aspire edin.

İşiniz bittiğinde, silikon tüpü doldurma pipetinden çıkarın. Daha sonra, boya yükleme çözeltisini çizmek için uzun bir filamentli bir şırınga kullanın. Daha sonra, filament ucunu yükleme çözeltisi ile doldurma pipetine yerleştirin ve karışımı sinir kütüğüne bırakın, ardından sinir preparatını karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.

Kuluçkadan sonra, sinir preparatını taze Ringer çözeltisi ile durulayın ve iki saat boyunca 25 santigrat derecede bir cam kapta 50 mililitre Ringer çözeltisi ile işlemden geçirin. Konfokal mikroskopi için, sinir preparatını silikon elastomer kaplı bir deney odasına monte edin ve hafifçe gerilmiş bir dizi çelik mikroiğne ile sabitleyin. Daha sonra, preparatı Ringer'ın çözeltisi ile kapsamlı bir şekilde durulayın.

Odaya bir emme elektrodu takın. Hazırlama odasını mikroskop aşamasına monte ettikten sonra, giriş ve çıkış bağlantı parçalarını odaya yerleştirin. Fazla çözeltiyi preparattan çıkarmak için yerçekimi akışına bağlı bir sistemi açın.

İşiniz bittiğinde, uyarıcı emme elektrodunu bir elektrik stimülatörüne takın ve uyaranlardan sonra kas kasılmalarının meydana gelmesini sağlayın. Daha sonra, perfüzyon sistemini 10 mikromolar d-tubokurarin içeren Ringer çözeltisi ile doldurun ve perfüzyonu başlatmak için perfüzyon emme pompasını açın. Lazer taramalı konfokal mikroskopta veya LSCM yazılımında, görüntüleme parametrelerini ayarlamak için elektrofizyoloji ve edinme modunu seçin.

İş menüsü ayarlarında, uyarıcıyı mikroskop senkronizasyon darbesiyle tetiklemek için tetik ayarlarını seçin ve kare alanındaki tetikleyiciyi OUT 1 kanalına ayarlayın. Tarama modunu 1.400 hertz tarama frekansında XYT'ye çevirin. İğne deliği tamamen açıkken yakınlaştırma faktörü 6,1 olmalıdır.

Sıralı, transpasif, çift yönlü X modunun açık olduğundan emin olun, ardından 52 milisaniyelik bir kare oluşturmak için minimum süreyi ayarlayın ve ham bir videoda kareleri 20 karede toplayın. Argon lazerin uyarma dalga boyunu çıkış gücünün% 8'i ile 488 nanometreye ayarlayın. Parametreler ayarlandığında, boya ile yüklenen sinir terminallerinin canlı önizlemesini almak için canlı mod düğmesine basın.

Canlı modda, en iyi odağı elde etmek için ilgilenilen bölgeyi veya YG'yi arayın. Ardından, uyarıcıdaki gecikmeyi önceki değere göre iki milisaniye daha az değiştirin ve her bir diziyi bir öncekinden iki milisaniye kaydırarak 26 dizi elde etmek için veri toplama yazılımını çalıştırın. Çekilen videoları işlemek için Leica Application Suite X veya LAS X yazılımını çalıştırın ve oluşturulan projeyi açın.

Ardından, çerçeveleri hedef klasöre TIF formatında kaydetmek için dışa aktar ve kaydet'e tıklayın. Ardından, ImageJ yazılımını çalıştırın ve dosyaya, içe aktarmaya ve görüntü dizisine tıklayın. Görüntü dizisini aç penceresinde, hedef klasörü seçin ve ilk kareyi açın.

Sıra seçeneklerinden, başlangıç görüntüsü alanına gidin ve kare numarasını ilk kare için bir olarak ayarlayın. Ardından, artış alanında, Tamam'ı tıklatmadan önce değeri ilk sinyal kaydındaki kare sayısına eşit olarak ayarlayın. Dikişli ilk karelerin oluşturulan dosyasını ayrı bir klasöre kaydetmek için, dosya, kaydet ve klasör sekmelerini sırayla tıklatın.

Başlangıç görüntüsü alanında karşılık gelen kare numarasını ayarlayarak 19 kare için prosedürleri tekrarlayın. Tüm görüntüler elde edildiğinde, başlangıç görüntüsünde ve artış alanlarında birini seçmek için dosyaya, içe aktarmaya ve görüntü dizisine tıklayın. Tüm karelerin artan zamansal çözünürlükte bir araya getirildiği son video görülebilir.

Ardından, video dosyasını TIF biçiminde kaydedin. Dikişli videoyu analiz etmek için görüntüye, yığınlara, araçlara ve yığın sıralayıcıya tıklayın. Ardından analiz, araçlar ve yatırım getirisi yöneticisi'ne gidin.

Daha önce kaydedilmiş TIF dosyasını sürükleyip ImageJ penceresine bırakın ve daha iyi bir görünüm için görüntüyü genişletin. Görüntü görselleştirmesini geliştirmek için, parlaklık kontrastını otomatik olarak açmak için resme tıklayın, ayarlayın. YG çizerek ve YG yöneticisine değer katarak arka planı sinir terminaline yakın bir yere ayarlayın.

Ardından, daha fazla ve çoklu ölçüye tıklayarak arka planı hesaplayın. E-tablo programına yapıştırmak için ortalama değerleri kopyalayın. Ardından, ortalama değeri hesaplayın.

Ardından, işlem, ana ve çıkar'a tıklayarak hesaplanan ortalama değeri yığınlardan çıkarın. Elde edilen değeri girin ve YG yöneticisine eklemeden önce bir çokgen çizgisi aracılığıyla bir sinir terminalinin etrafına YG çizin. Daha fazla ve çoklu ölçüm sekmelerine tıklayarak sinir terminalinin geçici yoğunluğunu ölçün.

Ardından, ortalama yoğunluk değerlerini kopyalayın ve sinyallerin ortalama ofsetini hesaplamak için bunları elektronik tablo programına yapıştırın. Sinyal değerlerini ortalama ofset değerine bölün. Elde edilen değerden birini çıkarın ve% 100 ile çarpın, ardından genliği belirlemek için bir kalsiyum geçici grafiği çizin.

Sinir preparatını bir boya ile yükledikten sonra, sinapsın çoğu sinir kütüğüne yakın bir yerde bulunur, yeterli bir floresan seviyesine işaret eder. Görüntü işleme sonrasında istenilen uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip kalsiyum geçiciliği elde edildi. Bu protokoldeki en önemli adımlardan biri, sinir kütüğünün, siniri kestikten sonraki ilk birkaç dakika içinde boya içeren çözeltiye yerleştirilmesi gerektiğidir.

Bu yöntem, motor nöronlara çeşitli boyalar ve ilaçlar yüklemek için kullanılabilir. Kayıt protokolü, CNS preparatlarındaki dendritlerde ve dikenlerde kalsiyumun değerlendirilmesinde yararlı olabilir. Tekniğimiz, iyi mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip bir kalsiyum sinyalinin kaydedilmesini sağlar.

Kalsiyum geçiciliğini incelemek, bir nörotransmitter salınımının ve sinaptik plastisitenin araştırma düzenlemesinde güçlü bir araçtır.