Name: Trypanosoma cruzi veya Diğer Patojenik Organizmalardan DNA Tespiti için Kullanıma Hazır qPCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 50 s
Description: Öğrenin, jelifikasyon protokolü ile Trypanosoma cruzi DNA tespiti için kullanıma hazır qPCR reaksiyonları nasıl üretilir. Bu yöntem hazırlama süresini kısaltır, operatör hatalarını azaltır ve uzun süreli saklamaya olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, vakumlu fırınla ilgili teknik yardım için Aline Burda Farias'a ve söz konusu ekipmana erişime izin verdikleri için Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Curitiba, Brezilya) yönetimine şükranlarını sunmak isterler. Bu çalışma kısmen hibe CNPq 445954/2020-5 tarafından finanse edilmiştir.

1. Stok çözeltilerinin ve jelifikasyon karışımının hazırlanması
NOT: Dört stok çözeltisi hazırlanacak (400 mg/mL melezitoz, 400 mg/mL trehaloz, 0.75 mg/mL lizin ve 200 mg/mL glikojen) ve jelleşme karışımını üretmek için Tablo 1'de gösterilen orana göre karıştırılacaktır. Protokol 10 mL'lik stok çözümleri üretimini tanımlasa da, daha düşük veya daha yüksek hacimler için uyarlanabilir.
<ol><li>Melezitoz çözeltisi<ol><li>15 mL'lik plastik bir tüpte 4 g melezitoz tartın, 6 mL nükleaz içermeyen su ekleyin ve toz çözünene kadar cihazın maksimum hızında vorteks yapın. NOT: Son hacmi aşmamaya özen göstererek çözünürlüğü kolaylaştırmak için daha fazla su eklenebilir (aşağıya bakınız).</li>
		<li>Son hacmi nükleaz içermeyen su ile 10 mL'ye kadar yapın. 2-8 °C'de 6 aya kadar etiketleyin ve saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Trehaloz çözeltisi<ol><li>15 mL'lik plastik bir tüpte 4 g trehaloz tartın, 6 mL nükleaz içermeyen su ekleyin ve toz çözünene kadar cihazın maksimum hızında vorteks yapın. NOT: Son hacmi aşmamaya özen göstererek çözünürlüğü kolaylaştırmak için daha fazla su eklenebilir (aşağıya bakınız).</li>
		<li>Nükleaz içermeyen su ile hacmi 10 mL'ye kadar yükseltin ve çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreden süzün. 2-8 °C'de 6 aya kadar etiketleyin ve saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Glikojen çözeltisi<ol><li>15 mL'lik plastik bir tüpte 2 g glikojen tartın, 6 mL nükleaz içermeyen su ekleyin ve toz çözünene kadar cihazın maksimum hızında vorteks yapın. NOT: Son hacmi aşmamaya özen göstererek çözünürlüğü kolaylaştırmak için daha fazla su eklenebilir (aşağıya bakınız).</li>
		<li>Çözeltiyi 8-12 saat boyunca 2-8 ° C'de dinlendirin, çünkü glikojen çözünürse çok fazla kabarcık üretir (Şekil 1). Nükleaz içermeyen su ile hacmi 10 mL'ye kadar yükseltin. 2-8 °C'de 6 aya kadar etiketleyin ve saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Lizin çözeltisi<ol><li>15 mL'lik plastik bir tüpte 7,5 mg lizin tartın, 6 mL nükleaz içermeyen su ekleyin. Toz çözünene kadar aletin maksimum hızında vorteks. NOT: Son hacmi aşmamaya özen göstererek çözünürlüğü kolaylaştırmak için daha fazla su eklenebilir (aşağıya bakınız).</li>
		<li>Nükleaz içermeyen su ile hacmi 10 mL'ye kadar yükseltin ve çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreden süzün. Çözeltiyi kehribar renkli bir şişeye aktarın veya ışıktan koruyun. 2-8 °C derecelerde 6 aya kadar etiketleyin ve saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Jelleşme Karışımı (GM)<ol><li>50 mL'lik plastik bir tüpte, stok çözeltilerinin hacimlerini Tablo 1'e göre karıştırın.</li>
		<li>Reaktifleri, tüpün uçtan uca on ters çevrilmesiyle karıştırın. NOT: Bu adım laminer akış güvenlik başlığında gerçekleştiriliyorsa filtreleme adımına gerek yoktur. Bu adım temiz bir ortamda gerçekleştirilmezse, çözeltiyi sarı bir şişeye aktarmadan önce 0,2 μm'lik bir filtreden süzün.</li>
		<li>Çözeltiyi kehribar renkli bir şişeye aktarın veya ışıktan koruyun. 2-8 °C'de 3 aya kadar etiketleyin ve saklayın. NOT: Jelifikasyon karışımını hazırlamak için bir kalite kontrol adımı olarak, ölçülen pH, iletkenlik ve yoğunluk değerlerinin aşağıdaki aralıklarda olduğundan emin olun: pH 5,55-6,66; iletkenlik 0.630-0.757 mS/cm; ve yoğunluk 1.08-1.11 g /cm3. Tüm ölçümler 25 °C'de alınmalıdır.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Jelleştirme için qPCR ana karışımının hazırlanması
NOT: Bu adımda, jelleştirme için qPCR ana karışımı hazırlanır. Bu nedenle, karışıma su eklenmez, bunun yerine jelleşme karışımı eklenir (Tablo 2).
<ol><li>Reaktifleri soğutulmuş bir kapta çözün. Reaktifleri Tablo 2'ye göre 1,5 mL'lik bir tüpte karıştırın. 5 μL DNA örneği içeren 25 μL'lik bir son hacme sahip bir reaksiyon örneği burada gösterilmiştir. NOT: DNA örneği bu adımda karışıma eklenmez; burada yalnızca qPCR ana karışımının her bir reaktifinin son hacimlerini hesaplamak için kullanılır. DNA örnekleri koşuya başlamadan hemen önce eklenmelidir (aşağıdaki adım 4'e bakın).</li>
</ol>3. Reaksiyon kaplarındaki reaktiflerin jelifikasyonu
<ol><li>Sekiz tüplü bir şeridin veya 96 delikli bir plakanın hazırlanması için Tablo 2'de gösterilen hacimleri uygun şekilde çarpın.</li>
	<li>Pipet 18.5 μL'lik jelifikasyon ana karışımı Tablo 2'de gösterilen her reaksiyon kuyusu üzerine yerleştirilir. NOT: Bu hacim, bir reaksiyon için kullanılan oligonükleotid karışımı, PCR tamponu ve jelifikasyon karışımının hacimlerini temsil eder ( Tablo 2'ye göre) ve reaktiflerin konsantrasyonuna ve bir reaksiyon için gereken hacme bağlı olarak değişecektir. Jelifikasyon ana karışımındaki son hacim, normal bir ana karışımdaki hacimden farklıdır, çünkü su eklenmez.</li>
	<li>Tüpleri/plakayı vakumlu fırının içindeki ısı iletken desteğe (örneğin alüminyum) yerleştirin. NOT: Isı iletken destek isteğe bağlıdır. Operatör, hızlı termal denge sağlamak için tüplerin tabanının vakumlu fırın rafı ile temas halinde olduğundan emin olmalıdır.</li>
	<li>Her iki 96 kuyucuklu plaka için bir bentonit kil torbası yerleştirin. NOT: Bentonit kil torbalar, jelifikasyon ana karışımından çıkarılan suyu, vakum tarafından uygulanan fark basıncı ile emmek için kullanılır. Bentonit kil torbalarının ikiden az 96 kuyucuklu plaka için gereksiz olduğu bulundu.</li>
	<li>Jelifikasyon ana karışımını içeren tüpleri/plakayı, atmosferik basınç elde edilene kadar (900-930 mBar), kontrollü sıcaklık altında (30 °C ± 1 °C) vakum salınımı ile dönüşümlü olarak her biri 30 dakikalık üç vakum döngüsüne (30 ± 5 mBar) maruz bırakın (Şekil 2). NOT: Cihaz parametreleri kontrol etmek için yazılım kullanır ve döngünün bir örneği Şekil 2'de gösterilmiştir. Kullanıcı, seçilen parametreleri belirterek çalıştırma için profil oluşturmalıdır.</li>
	<li>Döngü tamamlandığında, hacmin gözle görülür şekilde azaldığından (Şekil 3) ve tüplere/plakalara parmaklarla dokunulduğunda sıvıların hareket etmediğinden emin olarak tüplerin/plakaların reaktiflerin uygun jelifikasyonu için kontrol edin. NOT: Jelleşme gerçekleşmediyse, tüplere dokunulduğunda çözelti tüp duvarlarına sıçrayacaktır (Şekil 3).</li>
	<li>Tüpleri/plakaları kullanmadan önce 2-8 °C'de 8-12 saat boyunca kapatın ve saklayın.</li>
</ol>4. Jelleştirilmiş qPCR kullanma
<ol><li>Tüp şeridini veya plakasını buzdolabından çıkarın ve numune manipülasyonu için bir iş istasyonunda açın. Her reaksiyon kabına 15 μL nükleaz içermeyen su ekleyin. NOT: Jelleşmiş reaktiflerin hacminin yaklaşık 5 μL olduğu düşünülmektedir. Bu nedenle, DNA numune hacmi ile birlikte (aşağıya bakınız), nihai reaksiyon hacmi 25 μL'dir.</li>
	<li>5 μL DNA örneği ekleyin. NOT: Herhangi bir qPCR kalitesinde DNA şablonu kullanılabilir. Bu çalışmada, DNA 108T. cruzi epimastigotlarından (Dm28c suşu) çıkarıldı ve TE tamponu kullanılarak 1:10 oranında seri olarak seyreltildi.</li>
	<li>Tüpleri/plakaları kapatın ve seçtiğiniz ekipmana geçin. Denemeyi çalıştırın ve düzenli veri analizine geçin.</li>
</ol>

<ol><li>Lewinsohn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carlos+Chagas+%281879-1934%29%3A+the+discovery+of+Trypanosoma+cruzi+and+of+American+trypanosomiasis+%28foot-notes+to+the+history+of+Chagas%27s+disease%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease).</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).</li>
<li>Bern, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+treatment+of+Chagas+disease+in+the+United+States%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review.</a> The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).</li>
<li>Pereira, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chagas%27+disease+as+a+foodborne+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Chagas' disease as a foodborne illness.</a> Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).</li>
<li>Tanowitz, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chagas%27+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Chagas' disease.</a> Clinical Microbiology Reviews. 5 (4), 400-419 (1992).</li>
<li>Rassi, A., Marin-Neto, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Chagas disease.</a> Lancet. 375 (9723), 1388-1402 (2010).</li>
<li>Ramírez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+validation+of+quantitative+real-time+PCR+methods+for+quantification+of+trypanosoma+cruzi+DNA+in+blood+samples+from+chagas+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).</li>
<li>Rivero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+Trypanosoma+cruzi+by+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%3A+A+potential+novel+tool+for+the+detection+of+congenital+Chagas+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).</li>
<li>Schijman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+diagnosis+of+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Molecular diagnosis of Trypanosoma cruzi.</a> Acta Tropica. 184, 59-66 (2018).</li>
<li>Besuschio, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+cruzi+loop-mediated+isothermal+amplification+%28Trypanosoma+cruzi+Loopamp%29+kit+for+detection+of+congenital%2C+acute+and+Chagas+disease+reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402(2020).</li>
<li>Duffy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+real-time+PCR+strategy+for+monitoring+bloodstream+parasitic+loads+in+chagas+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).</li>
<li>Melo, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+real+time+PCR+to+quantify+parasite+load+in+serum+samples+from+chronic+Chagas+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients.</a> Parasites & Vectors. 8 (1), 154(2015).</li>
<li>Parrado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+serial+blood+sampling+and+PCR+replicates+for+treatment+monitoring+of+patients+with+chronic+Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191(2019).</li>
<li>de Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ready-to-use+duplex+qPCR+to+detect+Leishmania+infantum+DNA+in+naturally+infected+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Parasitology%22%5BJournal%5D)">A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs.</a> Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).</li>
<li>Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proof+of+concept+for+a+portable+platform+for+molecular+diagnosis+of+tropical+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).</li>
<li>Costa, A. D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ready-to-use+qPCR+for+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+or+Trypanosoma+cruzi+in+food+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Waterborne+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices.</a> Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111(2021).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-storage+of+gelified+reagents+in+a+lab-on-a-foil+system+for+rapid+nucleic+acid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis.</a> Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).</li>
<li>Kamau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample-ready+multiplex+qPCR+assay+for+detection+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria.</a> Malaria Journal. 13, 158(2014).</li>
<li>Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+and+further+challenges+in+lyophilization%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Recent advances and further challenges in lyophilization.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).</li>
<li>Rosado, P. M. F. S., López, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+preparing+stabilised+reaction+mixtures%2C+which+are+totally+or+partially+dried%2C+comprising+at+least+one+enzyme%2C+reaction+mixtures+and+kits+containing+said+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22PubChem%22%5BJournal%5D)">Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures.</a> PubChem. , (2002).</li>
<li>Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+a+fast+and+easy+sample-to-answer+protocol+for+tuberculosis+screening+in+point-of-care+settings%3A+A+proof+of+concept+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study.</a> PLoS One. 15 (12), 0242408(2020).</li>
<li>Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+improved+U.S.+food+and+drug+administration+method+for+the+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+in+produce+using+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR.</a> Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).</li>
<li>Iglesias, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+a+new+gelled+nested+PCR+test+for+the+diagnosis+of+imported+malaria%3A+comparison+with+microscopy%2C+rapid+diagnostic+test%2C+and+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Research%22%5BJournal%5D)">Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR.</a> Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).</li>
<li>Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+diagnostics+for+Chagas+disease%3A+up+to+date+and+novel+methodologies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Son yıllarda, tropikal ve ihmal edilmiş hastalıkların teşhisine yardımcı olmak için daha hassas ve spesifik teknolojiler bulma ihtiyacı vurgulanmıştır. Epidemiyolojik kontrol için önemli olmakla birlikte, parazitolojik (optik mikroskopi) ve serolojik testlerin özellikle duyarlılık ve bakım noktası uygulanabilirliği açısından sınırlamaları vardır. PCR, izotermal amplifikasyon ve ilgili varyasyonlar gibi DNA amplifikasyon teknikleri laboratuvar ortamlarında uzun zamandır kullanılmaktadır, ancak teknolojik engeller saha ort...

Chagas hastalığı, 20. yüzyılın başlarında, yoksulluğun yaygın olduğu Brezilya'nın kırsal bölgelerinde keşfedildi 1,2. Bugün bile, hastalık Amerika'da sağlığın sosyal ve ekonomik belirleyicilerine bağlı olmaya devam etmektedir. Chagas hastalığı bifaziktir, akut ve kronik bir fazdan oluşur. Trypanosoma cruzi parazitinin enfeksiyonundan kaynaklanır, böcek vektörleri tarafından bulaşır, konjenital yolla kan transfüzyonu veya kontamine gıdaların oral alımı 3,4.
Chagas hastalığının teşhisi, klinik semptomların (özellikle Romaña belirtisi), kan yayma mikroskobu, seroloji ve gerçek zamanlı PCR (qPCR) veya izotermal amplifikasyon 4,5,6,7,8,9 gibi moleküler testlerin gözlemlenmesiyle yapılabilir. Klinik semptomlar ve kan yayma mikroskobu şüpheli akut enfeksiyon vakalarında kullanılırken, asemptomatik hastalarda antikor arayışı tarama aracı olarak kullanılmaktadır. Duyarlılığı ve özgüllüğü nedeniyle, qPCR'nin kronik hastalar için bir izleme aracı olarak, kandaki parazit yükünü ölçen tedavi gören akut hastalar için ve terapötik başarısızlığın vekil bir belirteci olarak kullanılması önerilmiştir 6,8,10,11,12 . Şu anda mevcut testlerden daha hassas ve spesifik olmasına rağmen, qPCR'nin nakliye ve depolama için donma sıcaklıklarının gerekliliği nedeniyle dünya çapında imtiyazsız bölgelerde tanılama araçları olarak bilinmesi etkili bir şekilde engellenmiştir13,14,15.
Bu engeli aşmak için, liyofilizasyon ve jelleştirme gibi koruma teknikleri araştırılmıştır16,17. Liyofilizasyon yıllarca koruma sağlarken, enzim stabilizasyonu / konservasyonu için yaygın olarak kullanılan gliserol varlığı olmadan özel olarak yapılmış reaktifler gerektirir18. Jelleşmenin aylarca koruma sağladığı gösterilmiş olsa da, düzenli reaktiflerin kullanılmasına izin verir19. Jelifikasyon çözeltisi, her biri proseste belirli rollere sahip dört bileşenden oluşur: şekerler trehaloz ve melozitoz, çözeltideki serbest su moleküllerini azaltarak kuruma işlemi sırasında biyomolekülleri korur, glikojen daha geniş bir koruyucu matris üretir ve amino asit lizini, biyomolekülün karboksili arasındaki oksitleyici reaksiyonları inhibe etmek için serbest radikal temizleyici olarak kullanılır, amino ve fosfat grupları. Bu bileşenler, kuruma işlemi sırasında üçüncül veya kuaterner yapının kaybını önleyen bir sol-jel karışımı tanımlar, böylece biyomoleküllerin rehidrasyon üzerine aktivitesini korumaya yardımcı olur19. Reaksiyon tüplerinin içinde stabilize edildikten sonra, reaksiyonlar normal -20 ° C yerine 2-8 ° C'de birkaç ay veya 21-23 ° C'de birkaç hafta saklanabilir. Bu yaklaşım, Chagas hastalığı, sıtma, leishmaniasis, tüberküloz ve siklosporiyazis13,14,15,20 gibi hastalıkların teşhisine yardımcı olmak için tasarlanmış testlere dahil edilmiştir.
Bu çalışma, jelleştirme prosedürü için gerekli çözümleri hazırlamak için tüm adımları, süreçteki tuzakları ve sekiz tüplü şeritler içinde kullanıma hazır jelleştirilmiş bir qPCR'nin beklenen son yönünü açıklamaktadır. Aynı protokol tek tüpler veya 96 delikli plakalar için uyarlanabilir. Son olarak, T. cruzi DNA'sının tespiti bir kontrol çalışması olarak gösterilecektir.

<table><tbody><tr><td>Bentonit kil torbaları (aktif)</td><td>Embamat Global Packaging Solutions (Barselona, İspanya)</td><td>026157/STD</td><td>Silika jel paketleri ile karıştırılmamalıdır</td></tr><tr><td>Glikojen</td><td>Amersham Biyobilim</td><td>Kedi# US16445</td><td></td></tr><tr><td>Lizin</td><td>Acros Organik Kedi</td><td># 365650250</td><td></td></tr><tr><td>Melezitoze</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kedi # 63620</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>tercih edilen satıcı</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Oligonükleotidler</td>, <td>tercih edilen satıcı</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>PCR mastermix,</td><td>tercih edilen satıcı veya Instituto de Biologia Molecular do Paran&aacute; (IBMP, Curitiba, Brezilya)</td><td>Chagas NAT kiti</td><td></td></tr><tr><td>PCR termodöngüleyici</td><td></td> vakumlu fırın Memmert Gmbh Celsius v10.0 Trehalose Sigma-Aldrich Cat # T9531 Trypanosoma cruzi DNA'sı için şirket içi ekili parazitlerden veya ATCC Vakumlu fırın Memmert gibi akredite satıcılardan satın alınan tercih edilen satıcı <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> yazılımı <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Gmbh</td><td>VO-400</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

trypanosoma cruzi veya diğer patojenik organizmalardan dna tespiti için kullanıma hazır qpcr

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Gerçek zamanlı PCR (qPCR), çok sayıda numuneden nükleik asit hedeflerinin dakika miktarlarını yükseltmeye olanak tanıyan son derece hassas ve hassas bir tekniktir. Birçok araştırma alanında yaygın olarak kullanılmış ve genetiği değiştirilmiş organizmaların (GDO) mahsullerinin mahsullerinde insan teşhisi ve özellik seçimi gibi alanlarda endüstriyel uygulama sağlamıştır. Ancak, qPCR hatasız bir teknik değildir. Tüm reaktiflerin daha sonra normal bir qPCR plakasının 96 kuyucuğuna dağıtılan tek bir ana karışımda karıştırılması, reaktiflerin yanlış karıştırılması veya kuyucuklara yanlış dağıtılması gibi operatör hatalarına yol açabilir. Burada, jelleştirme adı verilen bir teknik sunulmaktadır, bu sayede ana karışımda bulunan suyun çoğu, bir vakuma gönderildiğinde bir sol-jel karışımı oluşturan reaktiflerle ikame edilir. Sonuç olarak, qPCR reaktifleri oda sıcaklığında birkaç hafta veya 2-8 oC'de birkaç ay boyunca etkili bir şekilde korunur Her bir çözeltinin hazırlanmasının ayrıntıları, T. cruzi uydu DNA'sını (satDNA) tespit etmek için tasarlanmış jelleştirilmiş bir reaksiyonun beklenen yönüyle birlikte burada gösterilmiştir. Diğer organizmaları tespit etmek için benzer bir prosedür uygulanabilir. Jelleştirilmiş bir qPCR çalıştırması başlatmak, plakayı buzdolabından çıkarmak, numuneleri kendi kuyularına eklemek ve çalıştırmayı başlatmak kadar basittir, böylece tam plaka reaksiyonunun kurulum süresini, numuneleri yüklemek için gereken süreye düşürür. Ek olarak, jelize PCR reaksiyonları partiler halinde kalite için üretilebilir ve kontrol edilebilir, böylece zamandan tasarruf edilir ve rutin PCR reaksiyonları çalıştırılırken yaygın operatör hatalarından kaçınılabilir.

Jelleşme karışımını oluşturan reaktiflerden üçü, kuvvetli vorteks üzerinde kolayca çözünür. Bununla birlikte, glikojen tozun tamamen çözündüğünden emin olmak için dikkatli bir vorteks gerektirir. Ne yazık ki, güçlü vorteks, çözeltinin gerçek hacmini belirlemeyi zorlaştıran çok sayıda kabarcık üretir (Şekil 1A-B). Bu nedenle, glikojen çözeltisinin, kabarcıkların içinde sıkışmış çözeltinin çoğu ana çözelti gövdesine taşınana kadar buzdolabında dinlenmesine izi...

Bu çalışma, reaksiyon kabına önceden yüklenebilen ve birkaç ay boyunca buzdolabında saklanabilen T. cruzi DNA tespiti için kullanıma hazır qPCR üretme adımlarını açıklamaktadır.

Trypanosoma cruzi veya Diğer Patojenik Organizmalardan DNA Tespiti için Kullanıma Hazır qPCR

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...

Jelleştirme protokolü, bir çalıştırmayı başlatmak için gereken süreyi ve adımları azaltan kullanıma hazır qPCR reaksiyonları üretir. Bu protokol, qPCR reaksiyonlarının aynı anda kalite ve büyük miktarlarda üretilmesini ve kontrol edilmesini sağlayarak reçete hesaplamaları sırasında operatör hatası olasılığını azaltır veya kuyulara. Bu yöntem, geleneksel dondurulmuş formatta zaten tamamen optimize edilmiş herhangi bir qPCR'ye uygulanabilir.Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi önemlidir, çünkü ana kalite kontrol adımlarından ikisi görseldir. Melezitoz çözeltisini hazırlamak için, 15 mililitrelik plastik bir tüpte dört gram melezitozu tartın, altı mililitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve toz çözünene kadar maksimum hızda vorteks yapın. Son hacmi nükleaz içermeyen suyla 10 mililitreye çıkarın, ardından çözeltiyi altı aya kadar iki ila sekiz santigrat derecede etiketleyin ve saklayın.Trehaloz çözeltisini hazırlamak için, 15 mililitrelik plastik bir tüpte dört gram trehaloz tartın, toz çözünene kadar maksimum hızda altı mililitre nükleaz içermeyen su ve vorteks ekleyin. Daha sonra nükleaz içermeyen su ile hacmi 10 mililitreye kadar yükseltin ve çözeltiyi 0.2 mikronluk bir filtreden sü

ready-to-use-qpcr-for-detection-dna-from-trypanosoma-cruzi-or-other

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu videoda, iki farklı genetik belirteci aynı anda tespit etmede yararlı olan geleneksel PCR tekniğinin bir modifikasyonu olan çift yönlü dijital PCR (ddPCR) tekniğini gösteriyoruz. Tek bir PCR reaksiyonu, bağımsız olarak amplifiye edilen nanolitre boyutunda emülsifiye edilmiş damlacıklara bölünür ve hedef dizilerin başlangıç konsantrasyonunu hesaplamak için damlacıkların fraksiyonundan farklı renkli floresan amplifikasyon sinyallerinin tespiti kullanılır.

Çift genetik belirteçlerin eş zamanlı olarak ölçülmesi için dubleks dijital PCR

Bu protokol, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü biyopsi dokusunda sitomegalovirüsün qPCR tespitini tanımlar, bu da hızlı, hassas, spesifik ve belirsiz hematoksilen ve eozin veya immünohistokimyasal boyama paternlerini yorumlamak için yararlıdır.

QPCR Formalinle sabit, Parafin-gömülü Biyopsi Doku sitomegaloviral DNA tespiti için bir Hassas ve Hızlı Yöntem mi

Sağlanan, bir termal döngüleyici veya bir mikroskop ve sahne ısıtıcısı kullanarak DNA örneklerinin ilk konsantrasyonunu ölçmek için gerçek zamanlı bir rekombinaz polimeraz amplifikasyon testi geliştirmek için bir protokoldür. Ayrıca bir iç pozitif kontrolün geliştirilmesi de açıklanmaktadır. Ham gerçek zamanlı floresan verilerinin işlenmesi için komut dosyaları sağlanmıştır.

İç Pozitif Kontrol ile Kantitatif Recombinase Polimeraz Amplifikasyon Testi Geliştirme

Bir proteine bir etiket eklemek, onun işlevi hakkında fikir edinmenin güçlü bir yoludur. Burada, yüzlerce Trypanosoma brucei proteinini paralel olarak endojen olarak etiketlemek için bir protokol açıklıyoruz, böylece genom ölçeği etiketlemesi elde edilebilir.

Yüksek verimli Gen Etiketleme içinde<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Trypanosoma cruzi Ajan Chagas hastalığının klinik olarak tanınan patoloji aniden geliştirmek uzun ömürlü asemptomatik enfeksiyondan üretir. Aşağıdaki araştırma Protokolü cinsel üst nesneden döl için aktarılan T. cruzi enfeksiyon çözülmeye bir kısa vadede ailesi tabanlı epidemiyolojik çalışma açıklar.

Naive arkadaşları için kadın ve erkek üzerinden Amerikan Tripanozomlar cinsel iletim

Chagas hastalığının etken maddesi olan Trypanosoma cruzi'nin üç yaşam döngüsü aşamasında β-galaktosidaz aktivitesini ölçen yüksek verimli bir kolorimetrik tahlil tanımladık. Bu tahlil, tripanosidal bileşikleri kolay, hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde tanımlamak için kullanılabilir.

İn Vitro β-galaktosidaz İfade Eden Parazitleri Kullanarak Trypanosoma cruzi'nin Tüm Yaşam Döngüsü Aşamalarına Karşı İlaç Taraması

Bu protokol, örnek toplama, metabolit ekstraksiyonu, sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi veri toplama, 3D model oluşturma ve son olarak veri görselleştirme dahil olmak üzere trypanosomatid enfeksiyonu sırasında metabolit dağılımının 3D modelini oluşturma adımlarını açıklar.

Tripozomatid Enfeksiyonunu İncelemek için Kimyasal Kartografi Yaklaşımları

Acinetobacter baumannii'nin hızlı ve hassas tespitini kolaylaştırmak için, A. baumannii enfeksiyonlarını tanımlamak için LbaCas12a endonükleaz ile birlikte Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu (RPA) kullanan bir protokol sunuyoruz.

Rekombinaz polimeraz amplifikasyonu/Cas12a tabanlı bir sistem kullanılarak Acinetobacter baumannii enfeksiyonlarının hızlı ve spesifik tespiti

Burada, amplifikasyona hazır hücre lizzi, rekombinaz polimeraz amplifikasyonu ve CRISPR/Cas12a tahlilleri kullanarak Lotmaria passim ve Nosema ceranae gibi arı patojenlerinden DNA'yı tespit etmek için basit ve hızlı bir prosedürü açıklıyoruz.

RPA/CRISPR/Cas12a Sistemine Bağlı Alkalin Lizis Yoluyla Tripanosomatid Parazitlerin ve Nosema ceranae'nin Yerinde DNA Tespiti

Burada, genotoksik strese maruz kalan süspansiyon hücre kültürlerinde ATM ve p53 arasındaki doğrudan protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve görselleştirmek için in situ Proximity Ligation Assay (PLA) 'nın nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

Öğrenin, jelifikasyon protokolü ile Trypanosoma cruzi DNA tespiti için kullanıma hazır qPCR reaksiyonları nasıl üretilir. Bu yöntem hazırlama süresini kısaltır, operatör hatalarını azaltır ve uzun süreli saklamaya olanak tanır.

Trypanosoma cruzi veya Diğer Patojenik Organizmalardan DNA Tespiti için Kullanıma Hazır qPCR

Daha fazla video keşfet