Akson Başlangıç Segmentinin Membran Periyodik İskeletinin 3D Yapılı Aydınlatma Mikroskobu (3D-SIM) Kullanılarak Ölçüm Özellikleri
February 11th, 2022
Bu protokol, kültürlü sıçan hipokampal nöronları ve 3D yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (3D-SIM) kullanarak aktin halkalarını ve akson başlangıç segmentinin membran periyodik iskeletinin diğer bileşenlerini görselleştirmek ve ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır.
Bu protokol, kültürlenmiş nöronların akson başlangıç segmentindeki membran periyodik iskeletinin çözülmesine izin verir. Proteinlerin lokalizasyonu incelenerek membrandaki periyodik iskelet fonksiyonuna dair içgörü kazanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı sağlamlığı ve kullanım kolaylığıdır.
Yapısal aydınlatma mikroskobu, membranın periyodik iskeletini çözebilir ve numune hazırlama kolay ve basittir. Floresan mikroskobunda daha önce deneyime sahip olan herkes bu tekniği kolayca uygulayabilir. Bu protokol, numune hazırlama ve görüntüleme sırasında sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmıştır.
Başlamak için, nöronları oda sıcaklığında 12 dakika boyunca% 4 Paraformaldehit kullanarak sabitleyin. Kapak kaymasını fosfat tampon çözeltisinde %0,2 BSA'da bir kez yıkayın ve oda sıcaklığında PBS'de %1'lik bir Triton X çözeltisi içinde 10 dakika boyunca inkübe edin. Kapak kaymasını fosfat tampon çözeltisinde BSA ile yıkayın, BSA kullanarak anti ankirin G antikorlarını bir fosfat tampon çözeltisinde bir ila 200 oranında seyreltin.
Kapak kaymasına antikor çözeltisi ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri BSA fosfat tampon çözeltisinde bir kez% 0.1 Triton X'te bir kez fosfat tampon çözeltisinde ve bir kez fosfat tampon çözeltisinde yıkayın. Floro 4 etiketli seyreltin, BSA fosfat tampon çözeltisine daha fazla ikincil antikor ekleyin ve kapak kaymasına ekleyin.
Hücreleri BSA fosfat tampon çözeltisinde bir kez% 0.1 Triton X'te bir kez fosfat tampon çözeltisinde, daha sonra bir kez fosfat tampon çözeltisinde yıkayın. Fosfat tampon çözeltisinde etiketli Ferodin'in bir mikromolar çözeltisini hazırlayın ve hücrelere ekleyin. Hücreleri bir kez Sığır Serumu Albümin fosfat tampon çözeltisinde% 0.1 Triton X'te bir kez fosfat tampon çözeltisinde, daha sonra bir kez fosfat tampon çözeltisinde yıkayın.
Kapak kaymasını bir cam kızağa monte etmek için, bir slayta bir damla montaj ortamı uygulayın, kapak kaymasını deiyonize suya batırın ve fazla suyu gidermek için yumuşak bir kağıt havluyla dokunun. Kapak kaymasını cam sürgü üzerine yerleştirin ve 24 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Mümkünse, görüntülemeden önce mikroskopi tesisindeki personele danışın ve numuneye uygun daldırma yağını seçmek için bir daldırma yağı hesaplayıcısı kullanın.
Numuneler hazır olduğunda, kapak fişlerinin temiz olduğundan ve suya veya etanolle batırılmış bir pamuk ucu ile temizleyerek herhangi bir kalıntıdan arındırıldığından emin olun. Örneği bir 3D-SIM mikroskobuna yerleştirin ve görüntüyü yakalamak için hücreyi bulun. İlgili lazer çizgilerinin gücünü ayarlayın.
Ve numuneyi önemli ölçüde ağartmadan sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarmak için maruz kalma süreleri. Numunenin üst ve alt sınırlarını Z boyutunda ayarlayın ve bir yığın edinmeye devam edin. Süper çözümlenmiş bir yeniden yapılandırma elde etmek için yığın üzerinde yeniden yapılandırma algoritmasını çalıştırın.
Bilinen yapılar için rekonstrüksiyonları kontrol edin ve gerekirse bunları düzeltmek için parametreleri ayarlayın. Çözünürlükteki gelişmeleri gözlemlemek için SIM yeniden yapılandırmasını geniş bir alan görüntüsüyle karşılaştırın. Çok renkli yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu gerçekleştirirken, tatmin edici bir yeniden yapılanma hazır olduğunda, farklı kanalları doğru şekilde hizalamak için hizalama algoritmasını kullanın.
Membran periyodik iskeletindeki aktin halkaları ayırt edici periyodik bir görünüme sahiptir. Aktin halkalarının görünür olduğu tüm odak düzlemlerini kullanarak görüntü analiz yazılımında maksimum yoğunlukta bir projeksiyon görüntüsü oluşturun. Maksimum yoğunluk projeksiyon görüntüsünde, görünür bitişik halkalar boyunca dik bir çizgi çizin ve yazılımın çizgi çizim profili işleviyle birlikte floresan yoğunluğunu kaydedin.
Ortalama pikler arası mesafeyi hesaplamak için, çizgi profilindeki yerel maksimumu not edin ve bireysel bitişik floresan yoğunluğu zirveleri arasındaki mesafeyi ölçün. Farklı proteinlerin membran periyodik iskeletindeki aktin halkaları ile kolokalizasyonunu değerlendirmek için, aktin ve aday proteinin SIM rekonstrüksiyonları üzerinde bir kolokalizasyon analiz prosedürü çalıştırın. Yazılım platformundaki kolay birlikte yerelleştirme eklentisi için akson başlangıç segmentini ilgi alanı olarak tanımlamak üzere manuel olarak bir seçim yapın ve Pearson'ın kolokalizasyon için korelasyon katsayısını hesaplamak üzere analizi çalıştırın.
SIM görüntü analizi sırasında, görüntü yığınlarının rekonstrüksiyonları, aktin halkalarının net periyodikliğini gösterdi. Ankirin G ve aktin halkalarının kolokalizasyonu, Pearson'un korelasyon katsayısını hesaplamak için bir kolokalizasyon analiz prosedürü kullanılarak akson başlangıç segmentinde test edildi. Pearson'ın ankirin G ve aktin halkaları floresansının kolokalizasyonu için korelasyon katsayısı 0.36 artı veya eksi 0.03 idi.
Doğru daldırma yağını kullanmak ve ızgara çizgilerini görünür kılmak için lazer gücünü ve pozlama süresini ayarlamak önemlidir. Proteinin membran periyodik iskeletinin bir parçası olduğu belirlendikten sonra, membran periyodik iskeletinin korunmasında işlevi araştırılabilir ve kurulabilir. Örneğin, proteinin parçalanmasının aktin halkaları üzerindeki etkileri analiz edilebilir.
Süper çözünürlüklü mikroskopi tekniklerinin geliştirilmesi, akson başlangıç segmentinin aktin halkaları, spektrum ve ankirinden oluşan membran periyodik iskeleti içerdiğini bilmemizin nedenidir. SIM, araştırmacıların membran periyodik iskelet bileşenlerini kolayca görselleştirmelerini ve canlı hücrelerdeki aktin halkalarına bakmalarını sağlamıştır.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, kültürlenmiş sıçan hipokampal nöronları ve 3D-yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (3D-SIM) kullanarak akson başlangıç segmentinin zar periyodik iskeletinde aktin halkalarını görselleştirmek ve ölçmek için bir protokol belirlemektedir. Bu teknik, araştırmacıların protein lokalizasyonunu keşfetmelerine olanak tanır ve zar periyodik iskeletinin işlevini anlamak için katkıda bulunur.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Mikroskopi Tekniği
Arka Plan
- Akson başlangıç segmenti, nöronel sinyalleşme için kritik öneme sahiptir.
- Aktin halkaları, zar periyodik iskeletinin korunmasında önemli bir rol oynar.
- Yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu, biyolojik örneklerin görüntülemesinde çözünürlüğü artırır.
- Proteinlerin lokalizasyonunu anlamak, işlevsel rollerine dair içgörüler sunar.
Çalışmanın Amacı
- Kültürlenmiş nöronlarda aktin halkalarını görselleştirmek için güvenilir bir protokol oluşturmak.
- Zar periyodik iskeletin bileşenlerini açıklığa kavuşturmak.
- Akson başlangıç segmentindeki çeşitli proteinlerin kolokalizasyon analizini kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Görüntüleme için 3D-yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu kullanıldı.
- Kullandığı ana biyolojik model, kültürlenmiş sıçan hipokampal nöronları içeriyordu.
- Metinde multiomics iş akışlarından bahsedilmedi.
- Kritik adımlar sabitleme, antikor inkübasyonu ve görüntüleme hazırlığını içerir.
- Aktin halkası periyodikliğini ve protein kolokalizasyonunu değerlendirmek için görüntü analizi yapıldı.
Ana Sonuçlar
- Protokol, kültürlenmiş nöronlarda aktin halkalarının belirgin periyodiklikte görselleştirilmesini sağladı.
- Ankyrin G ve aktin halkalarının kolokalizasyonu, 0.36 ± 0.03'lük bir Pearson katsayısı ile kantitatif olarak belirlendi.
- Aktin halkalarının tanımlanması, bunların zar periyodik iskeletindeki rolünü destekler.
- SIM, geleneksel geniş alan görüntüleme yöntemlerine kıyasla net çözünürlük iyileştirmeleri sağladı.
Sonuçlar
- Çalışma, nöronlarda zar periyodik iskeletinin analiz edilmesi için güçlü bir yöntem göstermiştir.
- Gelişmiş görüntüleme teknikleri, nöronal hücrelerde hücresel yapının anlaşılmasına katkıda bulunur.
- Bu araştırmadan elde edilen bilgiler, nöronal protein fonksiyonlarının ve sağlık ve hastalıktaki etkilerinin gelecekteki araştırmaları için temel oluşturur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding the structural organization of the axon initial segment's membrane periodic skeleton supports target validation in neuroscience drug discovery by clarifying the spatial context of ion channels and scaffolding proteins. This mechanistic insight enables predictive de-risking of therapeutic hypotheses related to neuronal excitability disorders. The method enhances confidence in target engagement studies by providing quantitative spatial data on protein localization within a disease-relevant subcellular compartment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving the nanoscale architecture of the axon initial segment membrane periodic skeleton.
- Operational Value: Provides a robust, accessible super-resolution method for validating target localization in neuronal models.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking through quantitative assessment of protein periodicity and colocalization with actin rings.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence intensity profiles and Pearson's correlation coefficients for assessing protein-actin ring spatial relationships.
- Operational Value: Delivers reproducible, standardized imaging workflows compatible with multi-well neuronal culture formats.
- Assay Readiness: Produces super-resolved reconstructions that enable reliable detection of subcellular protein localization patterns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links molecular target localization to functional maintenance of the membrane periodic skeleton in a disease-relevant neuronal system.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether candidate proteins are structural components of the axon initial scaffold, informing target selection for neuropsychiatric indications.
- Predictive Confidence: Supports go/no-go decisions by determining if a protein is part of the periodic skeleton prior to functional validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through subcellular resolution and enabling progression to mechanistic studies in neuronal models.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by determining if a protein exhibits periodic localization consistent with membrane periodic skeleton integration.
- Screening: Enables assay development for high-content analysis of protein localization patterns in fixed neuronal cultures.
- Analytics: Provides quantitative readouts including inter-peak distance measurements and colocalization coefficients for objective comparison across conditions.
- Translational Research: Connects molecular findings to structural integrity of the axon initial segment, a key determinant of neuronal polarity and signaling.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized imaging platform applicable to multiple targets across neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by defining the nanoscale spatial organization of axon initial segment proteins.
- Operational Value: Offers ease of use and robustness, requiring only standard fluorescence microscopy experience and accessible super-resolution instrumentation.
- Strategic Value: Improves target selection confidence by validating subcellular localization before investing in functional assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their integration into the axon initial segment scaffold.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence microscopy and super-resolution imaging principles.
- Dependent on access to 3D-SIM instrumentation and appropriate immersion oil optimization.
- Necessitates standardized antibody validation and blocking conditions to minimize nonspecific signal.
- Involves careful laser power and exposure calibration to balance signal-to-noise ratio with photobleaching.
- Applicable primarily to fixed neuronal cultures; live-cell applications require additional validation.
